BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Ribosome Inactivating protein (RIP) adalah protein tanaman yang memiliki kemampuan memotong DNA superkoil beruntai ganda menjadi nik sirkuler dan bentuk linear (Sismindari, 1998). RIP juga dapat menonaktifkan ribosom menyebabkan terjadinya pemutusan ikatan N-glikosidase adenin pada posisi 4.324 di 28 S rrna sehingga pada akhirnya sintesis protein terhenti (Stripe, 2005), menjadikan RIP kandidat antikanker yang baik (Sudjadi dan Sismindari, 2011). Mirabilis jalapa L adalah salah satu tanaman yang mengandung RIP. Mirabilis jalapa L. yang dimurnikan dengan kromatografi penukar ion akan menghasilkan fraksi protein basa (RIP MJ-30) (Ikawati dkk., 2006) dan protein asam (RIP MJ- C). RIP MJ-C bermuatan negatif telah terbukti selektif pada cell line kanker (Sismindari dkk., 2010) dan terbukti lebih poten dibandingkan RIP MJ-30 (Sudjadi dkk., 2007). Masalah yang dihadapi RIP MJ-C adalah protein yang mudah terdegradasi dalam tubuh (Kouchak dkk., 2012; Mohanraj dan Chen, 2006), selain itu RIP MJ- C adalah RIP tipe 1 yang tidak memiliki sub unit lektin seperti RIP tipe 2 sehingga tidak dapat berikatan dengan reseptor galactose pada permukaan sel dan memfasilitasi masuknya RIP ke dalam sitoplasma (Ling dkk., 1994). Sistem penghantaran obat yang tepat dibutuhkan untuk dapat melindungi dan meningkatkan spesifisitasnya terhadap sel kanker (de Virgilio dkk., 2010). 1
Nanopartikel adalah salah satu jenis sistem penghantaran obat yang dapat melindungi makromolekul seperti protein dari degradasi. Pembuatan nanopartikel yang banyak digunakan adalah menggunakan polimer. Polimer alam merupakan pilihan yang baik untuk penghantaran obat karena toksisitasnya yang rendah dalam lingkungan biologis dan biodegradabel (Leon dkk., 2005). Kitosan dan pektin adalah polimer polisakarida alam yang sangat berpotensi dalam sistem penghantaran nanopartikel (Morris dkk., 2010) Kitosan merupakan polisakarida kationik yang bersifat hidrofilik, memiliki sifat stabilitas yang baik dan tidak toksik (Leon dkk., 2005). Nanopartikel kitosan yang dapat melindungi protein dari degradasi di endosom (Taira dkk., 2005). Kitosan rantai medium digunakan karena menurut Kouchak dkk. (2012), enkapsulasi nanopartikel protein kitosan rantai medium lebih besar dibandingkan nanopartikel kitosan rantai pendek dan kitosan rantai panjang. Kitosan adalah polimer yang paling banyak digunakan pada pembuatan nanopartikel dengan metode gelasi ionik. Gelasi ionik merupakan metode sederhana, tidak menggunakan pelarut organik dan hanya menggunakan pengadukan ringan sehingga tidak merusak protein (Tiyaboonchai, 2003). Gugus amino pada posisi C2 unit galaktosamin kitosan pada kondisi asam akan terprotonasi menjadi polielektrolit kation ammonium kuartener, sehingga nanopartikel RIP MJ-C dapat dibuat dengan metode gelasi ionik. Pada gelasi ionik gugus kationik kitosan akan bereaksi dengan gugus anionik secara ionik yang berfungsi sebagai pengait silang. 2
Pengait silang yang cukup menjanjikan adalah pektin. Berdasarkan derajat esterifikasi (DE), pektin dibagi 2 yaitu pektin metilasi tinggi (HM) dan rendah (LM). Semakin banyak gugus karboksil yang tidak teresterifikasi berarti DE semakin rendah (Liu dkk., 2006). Semakin rendah DE maka semakin besar gugus karboksilat sehingga diperlukan konsentrasi yang lebih sedikit untuk pembentukan kompleks polielektrolit (Sagita dkk., 2010) dan pektin LM lebih mudah diserap kedalam darah dibandingkan pektin HM (Khotimchenko dkk., 2012). Formulasi nanopartikel RIP MJ-C terenkapsulasi matriks polimer kitosan rantai medium-pektin metilasi rendah ini masih bersifat konvensional yang belum bisa selektif terhadap sel target, sehingga untuk menghasilkan efek tertarget pada sel kanker dan melindungi sel normal dari efek yang merugikan digunakan antibodi anti Ep-CAM. Epitelium Adhesion Cell molecules (EpCAM) adalah membran monomer glikoprotein yang diekspresikan dalam sebagian epitel manusia normal dan diekspresikan dalam kebanyakan karsinoma (Trzpis dkk., 2007). Osta dkk. (2004), melaporkan bahwa EpCAM diekspresikan 100 kali lipat lebih besar pada kanker payudara primer dan metastatik dibandingkan dengan jaringan payudara normal, sehingga penanda anti EpCAM dapat dikembangkan untuk terapi kanker payudara yang tertarget. Antibodi anti EpCAM tipe 9C4 dipilih pada penelitian ini karena efektif pada sel kanker payudara MCF-7 (Sterzynska dkk., 2012). Nanopartikel RIP MJ-C yang dikonjugasikan dengan antibodi monoklonal diharapkan mempunyai efek yang selekif hanya terhadap sel target (Sudjadi dkk., 2007). 3
Optimasi formula nanopartikel RIP MJ-C terenkapsulasi matriks polimer kitosan rantai medium-pektin metilasi rendah dilakukan dengan Rancangan Faktorial 2 2 menggunakan perangkat lunak Design Expert 7.1.5. Uji karakterisasi pada formula optimum yang dihasilkan meliputi penentuan efisiensi enkapsulasi, persen transmitan, ukuran partikel, indeks polidispersitas, zeta potensial dan karakterisasi morfologi partikel. Formula optimal yang dihasilkan dikonjugasikan dengan antibodi anti EpCAMP lalu divisualisasi dengan PAGE native dengan pewarnaan coomasie brilliant blue dan silver staining. Uji aktivitas dilakukan pada model sel kanker payudara MCF-7. Pada penelitian ini digunakan MCF-7 sebagai model sel karena fraksi protein asam yang bermuatan negatif (MJ-C) dari Mirabilis jalapa L. telah terbukti selektif pada kedua sel kanker (Sismindari dkk., 2010). 1. Rumusan masalah Berdasarkan latar belakang penelitian maka dapat dirumuskan beberapa permasalahan sebagai berikut : a. Berapakah proporsi campuran polimer kitosan rantai medium dan pektin metilasi rendah yang dibuat dengan teknik gelasi ionik yang dapat menghasilkan formula optimum nanopartikel RIP MJ-C yang memenuhi karakteristik meliputi ukuran partikel kurang dari 400 nm, Polidispersi indeks yang terdistribusi merata, zeta potensial diatas ± 30 mv dan efisiensi enkapsulasi yang mampu mengenkapsulasi RIP MJ-C? b. Apakah formula nanopartikel RIP MJ-C dapat dikonjugasi dengan antibodi anti EpCAM? 4
c. Bagaimana efek sitotoksik formula optimum nanopartikel RIP MJ-C terkonjugasi antibodi antiepcam pada sel kanker payudara MCF-7? 2. Keaslian penelitian Penelitian mengenai Ribosome Inactivating Protein (RIP) dari daun Mirabilis jalapa L. antara lain fraksi protein Mirabilis jalapa L. dapat menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan Raji (Ikawati dkk., 2003), melalui mekanisme apoptosis terjadi fragementasi DNA (Sudjadi dkk., 2002) yang menghasilkan efek sitotoksik pada sel tumor (Ikawati dkk., 2006). Protein asam MJ-C, bersifat sitotoksik terhadap sel HeLa, myeloma dan T47D (Sudjadi dkk., 2007), selektifitas efek sitotoksik dari protein asam MJ-C pada beberapa cell line (Sismindari dkk., 2010) dan aktivitas angiogenesis fraksi protein asam RIP MJ-C (Indrayudha, 2010). Penelitian nanopartikel kitosan antara lain sebagai penghantar protein bovine serum albumin (BSA) dengan menggunakan polimer kitosan dan alginat (Masalova dkk., 2013), pengembangan dan konjugasi antara berbagai tipe kitosan dan plasmid DNA memberi hasil yang memuaskan (Jansson, 2010). Penelitian nanopartikel protein Insulin yang dibuat dengan metode gelasi ionik menggunakan polimer kitosan dan alginat (Sarmento dkk., 2006) dan menggunakan kitosan rantai rendah dan pektin, belum mampu memberikan efek perlindungan insulin di lambung (Daud, 2015). Penelitian formulasi RIP-MJ terkonjugasi antibodi anti EpCAM tipe AUA 1 dan efek sitotoksiknya terhadap sel kanker T47D antara lain dengan menggunakan pengait silang pektin metilasi tinggi dan polimer kitosan rantai 5
pendek (Pertiwi, 2014) meningkatkan sitotoksisitas terhadap sel yang overekspresi EpCAM (sel Vero) dan meningkatkan aktivitas protein MJ, sedangkan dengan menggunakan kitosan rantai medium (Feranisa, 2014) meningkatkan efek sitotoksik RIP-MJ pada sel Vero, namun menurunkan efek sitotoksik pada sel kanker T47D jika dibandingkan dengan nanopartikel RIP MJ yang tidak terkonjugasi, kedua penelitian ini belum mencapai nilai IC 50. Penelitian yang serupa dilakukan oleh Wicaksono, (2014) dengan menggunakan polimer kitosan rantai rendah dan alginat memberikan efek sitotoksik lebih besar (IC 50 13,269 µg/ml) dibandingkan RIP MJ tanpa formula (IC 50 1824 µg/ml) terhadap sel T47D dan lebih selektif terhadap sel T47D dibandingkan sel vero dengan IC 50 nanopartikel terkonjugasi anti EpCAM 33,62 µg/ml dan RIP MJ tanpa formulasi 1387,86 µg/ml. Berdasarkan hasil penelusuran pustaka dan pencarian di internet, sejauh peneliti ketahui belum pernah dilakukan penelitian Formulasi RIP MJ-C dengan menggunakan kitosan rantai medium dan pektin metilasi rendah terkonjugasi anti EpCAM tipe 9C4 dengan metode gelasi ionik. Bagan keaslian penelitian dapat dilihat pada gambar 1. 3. Urgensi penelitian Penelitian ini diharapkan dapat diperoleh formula nanopartikel RIP MJ-C dengan menggunakan polimer kitosan rantai medium dengan pengait silang pektin metilasi rendah terkonjugasi antibodi anti EpCAM yang memiliki efek sitotoksik tertarget pada kanker payudara secara in vitro. Pengetahuan mengenai efek formula RIP MJ-C sangat berguna sebagai dasar 6
untuk mengembangkan sediaan yang dapat digunakan sebagai alternatif terapi kanker payudara pada manusia yang selektif dan aman. B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Melakukan optimasi untuk mengetahui proporsi campuran polimer kitosan rantai medium dan pektin metilasi rendah yang dibuat dengan teknik gelasi ionik yang dapat menghasilkan formula optimum nanopartikel RIP MJ-C yang memenuhi karakteristik meliputi ukuran partikel kurang dari 400 nm, Polidispersi indeks yang terdistribusi merata, Zeta potensial diatas ± 30 mv dan efisiensi enkapsulasi yang mampu mengenkapsulasi RIP MJ-C. 2. Membuat formula nanopartikel RIP MJ-C yang dapat dikonjugasi dengan antibodi anti EpCAM. 3. Melakukan uji sitotoksik pada formula optimum nanopartikel RIP MJ-C terkonjugasi antibodi antiepcam pada sel kanker payudara MCF-7. 7