TEKNIK PENGEMBANGAN PRIMORDIAL GERM CELL AYAM LOKAL

TEKNIK PENGEMBANGAN PRIMORDIAL GERM CELL AYAM LOKAL (Development of Primordial Germ Cells Technique on Native Chicken) TATAN KOSTAMAN, S. SOPIYANA dan A.R. SETIOKO Balai Penelitian Ternak, PO Box 221, Bogor 16002 t_kostaman@yahoo.co.id ABSTRACT Primordial germ cells (PGC) is the progenitor of the ovum and spermatozoa, PGC was detected in chicken embryo at the end of gastrulation process. Biotechnology on reproduction has been developed to save genetic material by using PGC, which will be used to produce the chimera or transgenic animal. Prior to PGC utilization there were several processes included, namely he migration of PGC in circulating blood, purification of PGC by using nycodenz, cryopreservation of PGC to preserve the PGC, and the PGC application. Research Institute for Animal Production (RIAP) was successfully purified the PGC from Indonesian native chicken and preserve by cryopreservation, to conserve the germplasm from rare species as well as for the development of science in poultry reproduction. Key Words: Poultry, PGC, Purification, Cryopreservation, Model of Development ABSTRAK Primordial Germ Cell (PGC) adalah progenitor dari sel telur dan spermatozoa, dideteksi pada embrio ayam pada akhir proses gastrulasi. Bioteknologi reproduksi yang sudah mulai dikembangkan untuk menyelamatkan material genetik adalah dengan memanfaatkan PGC, yang nantinya dapat digunakan untuk memproduksi keturunan berupa hewan chimera atau hewan transgenik. Guna pemanfaatan PGC, perlu diketahui jalur migrasi PGC untuk mengetahui keberadaan PGC di dalam sirkulasi darah, pemurnian PGC dengan nicodenz, kriopreservasi PGC untuk pengawetan PGC, dan aplikasi PGC itu sendiri. Balai Penelitian Ternak sudah berhasil memurnikan PGC dari beberapa ayam lokal yang ada di Indonesia dan mengawetkannya dengan teknik kriopreservasi, sehingga dapat dimanfaatkan untuk menyelamatan plasma nutfah yang berasal dari hewan langka dan terancam punah serta untuk pengembangan ilmu di bidang reproduksi unggas. Kata Kunci: Ayam, PGC, Pemurnian, Kriopreservasi, Model Pengembangan PENDAHULUAN Primordial Germ Cell (PGC) adalah progenitor dari sel telur dan spermatozoa yang memiliki aktivitas migrasi yang unik pada burung, begitu juga pada mamalia. Pada mamalia PGC awalnya berasal dari epiblast gastrulasi embrio dan pindah ke gonad embrio melalui hindgut (kantung) oleh gerakan amuboid. Sebaliknya pada burung, PGC pertama kali muncul dari epiblast di blastoderm dan translokasi ke hypoblast di area pelusida. Primordial Germ Cell (PGC) dideteksi pertama kali pada embrio ayam oleh SWIFT pada tahun 1914 pada akhir proses gastrulasi (GINSBURG, 1997). Selama proses gastrulasi, sel terlihat meninggalkan epiblast melalui primitive streak untuk membentuk lapisan tengah, mesoderm, dan mengganti hypoblast dengan endoderm. Akibatnya, dari dua lapis menjadi tiga lapis. Oleh karena itu, hypoblast diserang oleh endoderm, didorong ke depan untuk menjadi jaringan embrio tambahan. Daerah ini adalah germinal crescent, dimana PGC berada. Selain itu, mesoderm ekstraembrionik yang menimbulkan sirkulasi darah ekstraembrionik selalu dikaitkan dengan keberadaan PGC di daerah ini. Primordial Germ Cell (PGC) merupakan bentuk transisi dari stem cell yang terdapat pada embrio. Primordial Germ Cell (PGC) ini bersifat reversible (dapat berubah) yang kelak akan menjadi bentukan sel yang tidak dapat diubah kembali menjadi full germ cells ketika 84

berasosiasi dengan sel somatik pada gonad (SHAMBLOTT, 2001). Bioteknologi reproduksi yang sudah mulai dikembangkan untuk menyelamatkan material genetik adalah dengan memanfaatkan PGC, yang nantinya dapat digunakan untuk memproduksi keturunan berupa hewan chimera atau hewan transgenik. Sebelum PGC dapat dimanfaatkan, ada beberapa tahapan untuk mendapatkannya yaitu dimulai dari jalur migrasi PGC untuk mengetahui keberadaan PGC di dalam sirkulasi darah, pemurnian PGC dengan nicodenz dan kriopreservasi PGC untuk pengawetan PGC ayam lokal, dan aplikasi PGC. interendothelial dari aorta dorsal atau melalui arteri mesonefrik (PEREZ-APARICIO et al., 1998). Setelah ekstravasasi, PGC bergerak menuju epitel selom, menebal melalui mesenkim oleh gerakan amuboid. Pada stadium 20 (HAMBURGER dan HAMILTON, 1951) PGC kebanyakan telah tiba di anlagen gonad (UKESHIMA et al., 1991), seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Jalur migrasi primordial germ cell (PGC) Jalur migrasi yang unik dari PGC ayam dapat diidentifikasi mulai tahap X pada permukaan ventral daerah sentral dari zona pelusida. Selanjutnya, secara bertahap PGC memisahkan dari permukaan ventral zona pelusida stadium X untuk pindah ke permukaan dorsal hypoblast stadium XI XIV (TSUNEKAWA et al., 2000). Translokasi PGC dari epiblast ke hypoblast berlanjut selama tahap kedua dan selesai pada stadium 6 (HAMBURGER dan HAMILTON, 1951). Pada saat yang sama, PGC di hypoblast gerakannya pasif dibawa ke germinal crescent ekstraembrio oleh migrasi anterior mesoderm selama gastrulasi. Translokasi horizontal PGC germinal crescent berakhir pada akhir proses gastrulasi (GINSBURG, 1997). Ketika mesoderm sampai di germinal crescent, lokasi PGC di antara lapisan endoderm dan ektoderm. Sel-sel mesoderm kemudian membentuk pulau-pulau darah dan PGC dipisahkan menembus ke dalam sistem peredaran darah yang dikembangkan oleh gerakan amuboid. Pada stadium 12 (HAMBURGER dan HAMILTON, 1951), sistem vaskular pada embrio sepenuhnya terbentuk dan PGC mulai beredar (D'COSTA et al., 2001). Pada fase berikutnya, PGC disirkulasi dari pembuluh darah selama stadium 12 16 (HAMBURGER dan HAMILTON, 1951). Pada saat ini, PGC tidak aktif bermigrasi tetapi pasif diangkut oleh sirkulasi darah (MEYER, 1964). Pada tahap terakhir, PGC meninggalkan pembuluh darah baik melalui ruang Gambar 1. Jalur migrasi Primordial Germ Cell (PGC) Sumber: NIEUWKOOP dan SUTASURYA (1979) Primordial Germ Cell (PGC) unggas bermigrasi ke organ primitive genital melalui sirkulasi sistemik selama perkembangan embrio, dan ini dimanfaatkan untuk menghasilkan germ line chimera (YAMAMOTO et al., 2007). Primordial Germ Cell (PGC) sebagai sel donor telah diupayakan untuk menghasilkan germ line chimera dengan menggunakan PGC dari embrio pasca migrasi ke fase jaringan gonad (PARK et al., 2008). Teknik pemurnian primordial germ cell (PGC) Primordial Germ Cell (PGC) ayam dapat diisolasi dan dikoleksi dengan cara membuka bagian dorsal embrio dari telur fertil atau bagian arteri vitelin. Ada beberapa teknik untuk pemurnian PGC pada unggas, diantaranya dengan sistem gradien sentrifugasi menggunakan ficol (FICS) (YASUDA et al., 1992), immunomagnetic cell sorting (MACS) (ONO dan MACHIDA, 1999) metode gradien sentrifugasi menggunakan nicodenz (ZHAO dan KUWANA, 2003), dan fluorescence-activated cell sorting (FACS) (MOZDZIAK et al., 2006). Teknik yang paling simpel untuk pemurnian 85

PGC ayam adalah dengan metode gradien sentrifugasi menggunakan nicodenz (ZHAO dan KUWANA, 2003). Nicodenz adalah 5-(N-2,3-dihydroxypropy lacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N -bis (2,3- dihydroxypropyl) isophthalamide, bahan kimia non-ionic, mempunyai berat molekul sebesar 821 dan densitas sebesar 21 g/ml. Keuntungan yang lain dari nicodenz adalah toksisitas dan viskositas yang rendah, daya larut dalam air tinggi, dan lebih stabil ketika berada di autoklaf (ZHAO dan KUWANA, 2003). Tahapan pemurnian PGC dengan nicodenz yaitu: beberapa kali sentrifugasi, sehingga jumlah PGC meningkat dan sel darah merah berkurang (Gambar 2). Balai Penelitian Ternak (Balitnak) telah berhasil memurnikan PGC dari embrio ayam lokal yang berasal dari sampel darah pada stadium 14 18 dengan metode gradien sentrifugasi menggunakan nicodenz (Gambar 3). Morfologi PGC dapat dibedakan dengan sel darah merah secara mikroskopis, dimana PGC memiliki ukuran yang lebih besar daripada sel darah merah. a O O O O O O O O O O 2% (200 ul) 8% (500/1000 ul) (380 ul) (380 ul) 12% (1000 ul) O O b O O OO O O c O O O d 8% (350 ul) e 10% (350 ul) f 14% (400 ul) O Sel darah merah Gambar 2. Diagram proses pemurnian PGC dengan metoda gradien sentrifugasi menggunakan nicodenz Sumber: ZHAO dan KUWANA (2003) PGCs ZHAO dan KUWANA (2003) melaporkan bahwa metode gradien sentrifugasi dengan nicodenz pada darah embrio burung puyuh dan ayam White Leghorn mendapatkan tingkat kemurnian PGC masing-masing lebih dari 70 dan 90% dengan recovery rate sebesar 87,3 dan 92%. Pada PGC tikus, tingkat kemurnian PGC bisa lebih dari 95% (MAYANAGI et al., 2003). Sementara itu, pemurnian dengan metode FICS pada PGC ayam hanya mendapatkan tingkat kemurnian sebesar 60% (NAITO et al., 1999), sedangkan untuk burung puyuh, penggunaan metode MACS tidak efisien karena hanya mendapatkan tingkat kemurnian PGC yang sangat rendah, yaitu sebesar 5,2% dengan recovery rate sebesar 41,5% (ONO dan MACHIDA, 1999). Begitu juga dengan pemakaian metode FACS mendapatkan recovery rate yang rendah, karena metode MACS dan FACS tidak spesifik untuk PGC. Gambar 3. Perbedaan morfologi antara PGC (anak panah warna hitam) dengan sel darah merah (anak panah warna merah) (400x). Dokumentasi pribadi Evaluasi PGC hasil pemurnian berdasarkan identifikasi morfologi telah dipaparkan oleh YASUDA et al. (1992) pada ayam dan puyuh antara lain menjelaskan bahwa PGC di dalam darah yang dikoleksi dari embrio dengan mudah dapat dibedakan dari sel darah merah dengan mikroskop phase kontras. Diketahui bahwa sel-sel tersebut mengandung droplet lipid cerah (terang) yang tersebar di dalam sitoplasmanya, inti besar yang tidak asimetris, tepinya tampak sebagai cincin cerah di bawah selaput sel. sedangkan PGC yang mati tidak ditemukan cincin cerah tetapi tampak tembus cahaya (transparan) dengan sitoplasma 86

granular yang gelap. CHANG et al. (1998) mengemukakan bahwa dengan mikroskop phase kontras, ciri PGC yang dikoleksi dari puyuh diidentifikasi sebagai sel-sel bulat besar berdiameter sekitar 15 20 m dengan banyak droplet cerah di dalam sitoplasma. Sementara itu, ZHAO dan KUWANA (2003) mengemukakan bahwa dengan mikroskop phase kontras, ciri PGC ayam White Leghorn memiliki ukuran sel 14 19 m, nukleus sperikal dan besar, dan terdapat lemak refraktif di sitoplasmanya, sehingga PGC dapat dibedakan dari sel lainnya. Teknik kriopreservasi primordial germ cell (PGC) Primordial Germ Cell (PGC) dapat disimpan cukup lama melalui teknik kriopreservasi. Bentuk fisik dari fase cair ke fase padat dan kembali ke fase cair lagi. Proses fisika kimia tersebut meliputi penurunan temperatur dalam keadaan tekanan normal yang disertai dengan dehidrasi sampai tingkat tertentu dan mencapai temperatur yang sangat rendah. Proses ini harus reversible ke keadaan fisiologis awal. Prinsip dasar proses kriopreservasi terhadap sel adalah pengeluaran sebagian air intraselular sebelum sel tersebut membeku. Bila dehidrasi demikian tidak terjadi, maka sel akan mengalami kerusakan sebagai dampak terbentuknya kristal es beukuran besar pada bagian intraselular. Sebaliknya jika dehidrasi terlalu tinggi, efek letal lainnya muncul sebagai akibat sel mengalami kekeringan. Kriopreservasi juga sebagai faktor pendukung yang sangat baik untuk konservasi in situ dan program seleksi (DANCHIN-BURGE dan HIEMSTRA, 2003). Menurut FULTON (2006), kriopreservasi plasma nutfah akan sangat berharga bagi industri unggas dan untuk pelestarian sumber daya genetik unggas yang masih ada. Keberhasilan kriopreservasi PGC unggas pertama kali dilaporkan oleh NAITO et al. (1994) yang berhasil memperoleh PGC dalam keadaan baik dan normal setelah dibekukan dan dilakukan thawing (Gambar 4). Beberapa hasil penelitian yang telah dilakukan dengan teknik kriopreservasi disajikan pada Tabel 1. Proses kriopreservasi yang harus diperhatikan juga adalah jenis dan konsentrasi krioprotektan. Krioprotektan dibutuhkan untuk mencegah pembentukan kristal es, akan tetapi krioprotektan juga akan bersifat toksik setelah thawing. Yang menjadi dasar pemilihan jenis krioprotektan menurut SQUIRES et al. (2004) dan ALVARENGA et al. (2005) selain mengandung bahan yang bekerja melindungi sel pada saat pembekuan juga harus mempunyai bobot molekul yang kecil agar lebih mudah dan cepat terjadi penetrasi ke dalam sel, sehingga mengurangi toksisitas akibat osmolaritas yang tinggi, dan mudah larut dalam air. Gambar 4. PGC ayam (a) sebelum dan (b) sesudah pembekuan, dari embrio pada stadium 13 15. Skala bar: 20 µm Sumber: NAITO et al. (1994) 87

Tabel 1. Persentase recovery rate dan viabilitas PGC dari beberapa ternak unggas Jenis ternak Metode Persentase Recovery rate Viabilitas Sumber Ayam White Leghorn Filtrasi 39,4 - TAJIMA et al. (2003) Ayam White Leghorn Ayam White Leghorn Ayam Barred Plymouth Rock Ayam KUB Ayam Sentul Ayam Arab 1 C/menit 1 C/menit 1 C/menit 0,5 C/menit 0,5 C/menit 0,3 C/menit Ayam KUB: Ayam kampung unggul Balitnak - 80,6 MOORE et al. (2006) 49,9 83,5 SETIOKO et al. (2007) 54,3 - NAKAMURA et al. (2007) 45,7 78,5 KOSTAMAN et al. (2011) 45,7 76,0 KOSTAMAN et al. (2011) 43,5 79,1 KOSTAMAN et al. (2011) Masa depan primordial germ cell (PGC) Pemanfaatan PGC dapat digunakan untuk keperluan baik dalam bidang riset maupun bidang yang lain. Konservasi plasma nutfah Konservasi plasma nutfah unggas lokal melalui kriopreservasi PGC selain dapat digunakan untuk konservasi materi genetik untuk pengembangan unggas di masa mendatang juga dapat digunakan untuk preservasi unggas dalam kondisi kritis atau hampir punah (TAGAMI et al., 2007). Konservasi plasma nutfah unggas dalam bentuk PGC harus dapat dihidupkan kembali menjadi bentuk unggas untuk mendapatkan kembali plasma nutfah unggas yang dikonservasi. PETITTE (2006) telah melakukan pendekatan untuk konservasi sumberdaya genetik dengan menghasilkan ayam chimera (Gambar 5). KINO et al. (1997) melaporkan bahwa 9 dari 16 embrio (56,2%) yang disuntik dengan PGC segar menghasilkan ayam chimera. Sementara itu, penyuntikan PGC yang dibekukan dan diseleksi masing-masing menggunakan percoll dan nicodenz menghasilkan 2 dari 26 embrio (7,7%) dan 3 dari 26 embrio (11,5%). Gambar 5. Tahapan pelalaksanaan kriopreservasi materi genetik dan rekontruksi menggunakan chimera Sumber: PETTITE (2006) Untuk kriopreservasi germ line supaya berhasil, harus ada sumber germ line, dan cara yang paling efisien untuk rekonstruksi germ line seperti pada Gambar 5. Sel harus diperoleh dari embrio, dapat diisolasi dari sel blastodermal segar dari embrio stadium X atau PGC dari stadium 14 16 selama embrio bermigrasi di sirkulasi darah atau stadium 26 28 ketika menetap di germinal ridge. Karena materi genetik dari hewan yang terancam tidak ada dalam jumlah besar, cara yang ideal untuk memperbanyak jumlah sel adalah melalui kultur. Setelah sel diperoleh, germ line chimera dapat dihasilkan melalui transfer sel pada 88

stadium perkembangan yang sesuai. Telur dimanipulasi untuk menetas, dan kemudian diperoleh chimera yang dapat dikawinkan satu sama lain untuk progeny test. Hewan biomodel Hewan model digunakan untuk menyediakan bahan-bahan yang paling penting untuk penelitian berbagai penyakit pada manusia dan hewan (KIRSCHNER, 2009). Hasil yang diperoleh untuk mengidentifikasi etiologi dan pengobatan penyakit telah dilaporkan dengan menggunakan model hewan pengerat, dan baru-baru ini ayam telah mulai digunakan untuk hewan model. Hal ini dimungkinkan karena genom ayam menunjukkan susunan genetik yang serupa dengan manusia. Selain itu, perkembangan embrio burung yang terisolasi menawarkan banyak keuntungan sebagai hewan model. Sistem yang bebas dari pengaruh induk akan membantu untuk mendeteksi respon yang akurat untuk pengobatan dengan bahan kimia atau stres fisik. Ini unik untuk sistem in vitro, seperti sistem in vivo memungkinkan waktu pemantauan melalui windows kulit telur dan ada suatu sistem pengganti yang mapan untuk kelangsungan hidup dan perkembangan embrio yang ada. Ayam juga sangat baik untuk model penyakit manusia, seperti kanker ovarium (JOHNSON dan GILES, 2006), limfoma (BURGESS et al., 2004), dan untuk obat regeneratif (COLEMAN, 2008). Ayam juga telah digunakan sebagai hewan model untuk mempelajari penyakit kanker epitel ovarium. Pada manusia, kejadian kanker epitel ovarium cenderung meningkat pesat setelah menopause dan penghentian ovulasi oleh kehamilan dan penggunaan kontrasepsi oral telah dilaporkan dapat mengurangi tingkat penyakit ini (JOHNSON, 2009). Ayam adalah hewan model yang sesuai untuk mempelajari kanker epitel ovarium, karena ovulasi ayam hampir setiap hari dan dapat menghasilkan sekitar 300 telur dalam satu tahun. penelitian transgenik dan stem cell. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa PGC dan EGC ayam menunjukkan reaktivitas spesifik untuk antibodi dan antigen, termasuk antigen spesifik untuk stadium embrio (SSEA)-3 dan -4, antigen membran epitel -1 (EMA 1), integrin α6 (ITGA), dan β1 (ITGB) (JUNG et al., 2005). PGC dan EGC ayam juga bereaksi dengan lektin Solanum tuberosum agglutinin (STA) dan Dolichos biflorus agglutinin (DBA). Penanda ini dapat digunakan untuk karakteristik PGC ayam lainnya dengan penanda konvensional, seperti periodic acid-schiff (PAS), anti SSEA- 1, dan anti EMA-1 (PARK et al., 2003). Penanda terbaru ditemukan dapat digunakan untuk membedakan PGC dari sel lainnya dan lebih lanjut akan memberikan kontribusi yang cepat dan dapat diandalkan untuk karakteristik germ cell lainnya. Interspesifik hibrid Interspesifik hibrid adalah hewan yang diproduksi oleh perkawinan silang antara dua spesies, misalnya ayam dengan kalkun, ayam dengan puyuh, atau ayam dengan pheasant telah dilaporkan (SONG et al., 2010), seperti ditunjukkan pada Gambar 6. Interspesifik hibrid memberikan wawasan ke dalam aspekaspek penting dari interaksi sel-sel dan berbagai karakteristik sitogenetik antara jaringan xenogenik selama perkembangan. Hal yang terpenting adalah bahwa hewan tersebut tidak menghasilkan kekurangan prekusor gamet spermatogenik atau oogenik (TAKAHASHI et al., 1975; TAKASHIMA dan MIZUMA, 1981). Penanda spesifik untuk primordial germ cell (PGC) Perkembangan penanda untuk PGC dan EGC sangat penting untuk keberhasilan Gambar 6. Interspesifik hibrid yang dihasilkan melalui inseminasi buatan dari sperma ayam ke betina pheasant Sumber: SONG et al. (2010) 89

KESIMPULAN Primordial germ cell (PGC) merupakan leluhur dari spermatogonia di dalam testis dan oogonia di dalam ovarium. PGC berfungsi sebagai pembawa material genetik, yang dapat digunakan dalam menciptakan keturunan silang berupa chimera atau keturunan transgenik, sehingga selain dapat membantu mempercepat menghasilkan bibit-bibit seperti yang diinginkan juga dapat membantu menyelamatkan material genetik dari jenisjenis hewan langka dan terancam punah. Selain itu, dengan teknik pengembangannya (baik teknik pemurnian dan kriopreservasi) sudah berhasil diperoleh koleksi PGC ayam lokal, sehingga dapat dimanfaatkan untuk penyelamatan plasma nutfah dari jenis-jenis hewan langka dan terancam punah serta untuk pengembangan ilmu di bidang reproduksi unggas. DAFTAR PUSTAKA ALVARENGA, M.A., F.O. PAPA, F.C. LANDIM- ALVARENGA and A.S.L. MEDEIROS. 2005. Amides as cryoprotectants for freezing stalilion semen. A. Review. Anim. Reprod. Sci. 89: 105 113. BURGESS, S.C., J.R. YOUNG, B.J. BAATEN, L. HUNT, L.N. ROSS, M.S. PARCELLS, D.M. KUMAR, C.A. TREGASKES, L.F. LEE and T.F. DAVISON. 2004. Marek s disease is a natural model for lymphomas over-expressing Hodgkin s disease antigen (CD30). Proc. of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102: 13879 13884. CHANG, I.K., M. NAITO, T. KUWANA, M. MIZUTANI and M. SAKURAI. 1998. Production of germline chimeric quail by transfer of gonadal primordial germ cells preserved in liquid nitrogen. J. Poult. Sci. 35: 321 328. COLEMAN, C.M. 2008. Chicken embryo as a model for regenerative medicine. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today 84: 245 256. D COSTA, S., S.L. PARDUE and J.N. PETITTE. 2001. Comparative development of avian primordial germ cells and production of germ line chimeras. Avian Poult. Biol. Reviews 12: 151 168. DANCHIN-BURGE, C. and S. HIEMSTRA. 2003. Cryopreservation of domestic animal species in France and the Netherlands experiences, similarities and differences. Workshop on Cryopreservation of Animal Genetic Resources in Europe. Paris, France. pp. 15 29. FULTON, J.E. 2006. Avian genetic stock preservation: An industry perspective. Poult. Sci. 85: 227 231. GINSBURG, M. 1997. Primordial germ cell development in avian. Poult. Sci. 76: 91 95. HAMBURGER, V. and H.L. HAMILTON. 1951. A series of normal stages in development of the chick embryo. J. Morphol. 88: 49 92. JOHNSON, K.A. 2009. The standard of perfection: thoughts about the laying hen model of ovarian cancer. Cancer Prevention Research 2: 97 99. JOHNSON, P.A. and J.R. GILES. 2006. Use of genetic strains of chickens in studies of ovarian cancer. Poult. Sci. 85: 246 250. JUNG, J.S., D.K. KIM, T.S. PARK and S.D. LEE. 2005. Development of novel markers for the characterization of chicken primordial germ cells. Stem Cells 23: 689 698. KINO, K., B. PAIN, S.B. LEIBO, M. COCHRAN, M.E. CLARK and R.J. ETCHES. 1997. Production of chicken chimeras from injection of frozenthawed blastodermal cells. Poult. Sci. 76: 753 760. KIRSCHNER, L.S. 2009. Use of mouse models to understand the molecular basis of tissuespecific tumorigenesis in the Carney complex. J. Intern. Med. 266: 60 69. KOSTAMAN, T., S. SOPIYANA dan A.R. SETIOKO. 2011. Tingkat penurunan suhu pada kriopreservasi primordial germ cell (PGC) dari tiga jenis ayam lokal Indonesia. JITV 16: 218 223. MAYANAGI, T., R. KUROSAWA, K. OHNUMA, A. UEYAMA, K. ITO and J. TAKAHASHI. 2003. Purification of mouse primordial germ cells by nycodenz. Reprod. 125: 667 675. MEYER, D.B. 1964. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Develop. Biol. 10: 154 190. MOORE, D.T., P.H. PURDY and H.D. BLACKBURN. 2006. A method for cryopreserving chicken primordial germ cells. Poult. Sci. 85: 1784 1790. 90

MOZDZIAK, P.E., R. WYSOCKI, J. ANGERMAN- STEWART, S.L. PARDUE and J.N. PETITTE. 2006. Production of chick germline chimeras from fluorescence-activated cell-sorted gonocytes. Poult. Sci. 85: 1764 1768. NAITO, M., A. TAJIMA, T. TAGAMI, Y. YASUDA and T. KUWANA. 1994. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J. Reprod. Fertil. 102: 321 325. NAITO, M., Y. MATSUBARA, T. HARUMI, T. TAGAMI, H. KAGAMI, M. SAKURAI and T. KUWANA. 1999. Differention of donor primordial germ cells into functional gametes in gonads of mixed-sex germline chimeric chickens produced by transfer of primordial germ cells isolated from embryonic blood. J. Reprod. Fertil. 117: 291 298. NAKAMURA, Y., Y. YAMAMOTO, F. USUI, T. MUSHIKA, T. ONO, A.R. SETIOKO, K. TAKEDA, K. NIRASAWA, H. KAGAMI and T. TAGAMI. 2007. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult. Sci. 86: 2182 2193. NIEUWKOOP, P.D. and L.A. SUTASURYA. 1979. The migration of primordial germ cells. In: Primordial Germ Cells in the Chordates. Cambridge, Massachussetts. pp. 113 127. ONO, T. and Y. MACHIDA. 1999. Immunomagnetic purification of viable primordial germ cells of Japanese quail (Coturnis japanica). Comparative Biochem Physiol Part A. 122: 255 259. PARK, T.S., D.K. JEONG, J.N. KIM, K.H. SONG, Y.H. HONG, J.M. LIM and J.Y. HAN. 2003. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol. Reprod. 68: 1657 1719. PARK, T.S., M.A. KIM, J.M. LIM and J.Y. HAN. 2008. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras derived from in vitro cultured gonadal primordial germ cells. Mol. Reprod. Dev. 75: 274 355. PEREZ-APARICIO, F.J., A. CARRETERO, M. NAVARRO and J. RUBERTO. 1998. The lack of genital ridge vascularization tn the early chick embryo: Implications in the migration of the primordial germ cells. Anat. Rec. 251: 398 405. PETITTE, J.N. 2006. Avian germplasm preservation: Embryonic stem cells or primordial germ cells? Poult. Sci. 85: 237 242. SETIOKO, A.R., T. TAGAMI, H. TASE, Y. NAKAMURA, K. TAKEDA and K. NIRASAWA. 2007. Cryopreservation of primordial germ cells (PGCs) from White Leghorn using commercial cryoprotectants. J. Poult. Sci. 44: 73 77. SHAMBLOTT, M.J. 2001. Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. Proc. Natl Acad Sci USA. http//www.newdrugs.com/ stem-cell-references.html (7 April 2008). SONG, G., T.S. PARK, T.M. KIM and J.Y. HAN. 2010. Avian biotechnology: Insights from germ cellmediated transgenic system. J. Poult. Sci. 47: 197 207. SQUIRES, E.L., S.L. KEITH and J.K. GRAHAM. 2004. Evaluation of alternative cryoprotectants for preserving stallion spermatozoa. Theriogenology 62: 1056 1065. TAGAMI, T., H. KAGAMI, Y. MATSUBARA, T. HARUMI, M. NAITO, K. TAKEDA, H. HANADA and K. NIRASAWA. 2007. Differentiation of female primordial germ cells in the male testes of chicken (Gallus gallus domesticus). Mol. Reprod. Dev. 74: 68 75. TAJIMA, A., G.F. BARBATO, T. KUWANA and R.H. HAMMERSTEDT. 2003. Conservation of a genetically selected brioler line (42L) using cryopreserved circulating primordial germ cells (PGCs) isolated by fittration method. J. Poult. Sci. 40: 53 61. TAKAHASHI, E., Y. KURIHARA, N. KONDO and S. MAKINO. 1975. Karyological studies on hybrids between the guinea fowl (female) and the vulturine guinea fowl (male). Proc. of the Japan Academy. 51: 593 597. TAKASHIMA, Y. and Y. MIZUMA 1981. The testes of chicken-quail hybrids. Tohoku J. Agric. Res 33: 146 150. TSUNEKAWA, N., M. NAITO, Y. SAKAI, T. NISHIDA and NOCE T. 2000. Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells. Development 127: 2741 2750. UKESHIMA, A, K. YOSHINAGA and T. FUJIMOTO. 1991. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cell with special reference to the extravasation in their migration course. J. Electron Microscopy 40: 124 128. 91

UKESHIMA, A. and T. FUJIMOTO. 1984. Ultrastructure of primordial germ cells in the early chick embryo. In: VAN BLERKOM, J. and P.M. MOTTA (Eds.). Ultrastructure of Reproduction. Martinus Nijhoff Publishers. hlm. 12 18. YAMAMOTO, Y., F, USUI, Y. NAKAMURA, Y. ITO, T. TAGAMI, K. NIRASAWA, Y. MATSUBARA, T. ONO and H. KAGAMI. 2007. A novel method to isolate primordial germ cells and its use for the generation of germline chimeras in chicken. Biol. Reprod. 77: 115 119. YASUDA, Y., A. TAJIMA, FUJIMOTO and T. KUWANA. 1992. A method to obtain avian germ-line chimeras using isolated primordial germ cells. J. Reprod. Fertil. 96: 521 528. ZHAO, D. and T. KUWANA. 2003. Purification of avian circulating primordial germ cells bya Nycodenz density gradient centrifugation. Br. Poult. Sci. 44: 30 35. 92