BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan menggunakan pre test-post test control group design (Pocock,2008). P0 O1 O5 P1 O2 O6 P S R P2 O3 O7 P3 O4 O8 Bagan 4.1 Rancangan Penelitian Keterangan: P= Populasi S= Sampel
28 R= Random O1,O2,O3,O4= Observasi tekanan 27darah tikus putih yang sudah dibuat hipertensi sebelum perlakuan. P0= Perlakuan dengan pemberian plasebo pada tikus putih berupa aquadest 0,5 ml sebagai kontrol negatif. P1= Perlakuan dengan pemberian captopril oral dosis 3 mg/kgbb pada tikus putih sebagai kontrol positif dalam volume 0,5 ml P2= Perlakuan dengan pemberian ekstrak buah mengkudu dosis 500 mg/kgbb pada tikus putih dalam volume 0,5 ml P3 = Perlakuan dengan pemberian ekstrak buah mengkudu dosis 1000 mg/kgbb pada tikus putih dalam volume 0,5 ml O5 = Pengukuran tekanan darah tikus putih setelah pemberian plasebo berupa aquadest 0,5 ml selama dua minggu O6 = Pengukuran tekanan darah tikus putih jantan setelah pemberian captopril oral dosis 3 mg/kgbb selama dua minggu O7= Pengukuran tekanan darah tikus putih setelah pemberian ekstrak buah mengkudu dosis 500mg/kgBB selama dua minggu O8 = Pengukuran tekanan darah tikus putih setelah diberikan ekstrak buah mengkudu dosis 1000 mg/kgbb selama dua minggu 4.2. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Bagian Farmakologi dan Terapi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada Jogjakarta, pada bulan Maret-Mei 2011.
29 4.3. Populasi dan Sampel 4.3.1. Kriteria Sampel Dalam penelitian ini digunakan sampel dengan kriteria sebagai berikut: 1. Kriteria inklusi: a. Tikus putih jantan galur Wistar (Rattus norvegicus) b. Umur 3 bulan c. Berat badan 180-200 gr d. Hipertensi 2. Kriteria eksklusi Sampel dianggap drop out apabila selama penelitian dilaksanakan tikus putih jantan sakit dan mati 4.3.2. Besar Sampel Besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus Pocock (2008). Populasi adalah: 2δ 2 n = X (µ 2 -µ 1 ) 2 f(α,β) Keterangan: n = jumlah sampel µ 2 = rerata hasil pada kelompok perlakuan pre-test penelitian pendahuluan µ 1 = rerata hasil pada kelompok post-test penelitian pendahuluan
30 δ = simpangan baku kelompok pre-test f(α,β) = besarnya dilihat pada tabel pokok Berdasarkan penelitian pendahuluan terhadap lima ekor tikus putih pada kelompok pre-test diperoleh rerata 187 dan kelompok post-test diperoleh rerata 179 serta standar deviasi (SD) kelompok pre-test 4,48 dan standar deviasi (SD) kelompok post-test 5,48. Perhitungan besar sampel dalam penelitian ini menggunakan α = 0,05 dan β = 0,01, f(α,β) = 10,5 sehingga diperoleh n = 6,58. Untuk menghindari drop out pada sampel ditambahkan 15% sehingga sampel menjadi 7,20 dibulatkan menjadi 8. 4.4. Variabel Penelitian 4.4.1 Klasifikasi variabel a. Variabel bebas: ekstrak buah mengkudu dengan dosis 500 mg/kgbb, 1000 mg/kgbb, b. Variabel tergantung: tekanan darah sistolik dan diastolik. c. Variabel terkendali: jenis kelamin tikus, berat badan tikus, umur tikus, galur tikus, makanan standar tikus. 4.4.2 Definisi operasional variabel a. Ekstrak buah mengkudu adalah ekstrak yang dibuat dari buah mengkudu yang telah dikeringkan dalam oven suhu 65 o C selama 72 jam dan dibagi menjadi 2 dosis, yaitu: 500 mg/kgbb dan 1000 mg/kgbb.
31 b. Tekanan darah sistolik dan diastolik tikus putih jantan yang fisiologis adalah 100/80mmHg, sedangkan tekanan darah sistolik tikus putih jantan yang dibuat hipertensi adalah 170-200 mmhg c. Hewan coba yang dipakai dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan, galur Wistar, berat 180-200 g, umur 3 bulan, makanan yang diberikan adalah makanan standar tikus 4.5. Prosedur Penelitian 4.5.1 Pembuatan ekstrak buah mengkudu Buah mengkudu sebanyak 2 kg diambil dari kebun yang berasal dari daerah Blahkiuh, Badung, kemudian dicuci bersih, diiris setebal 1 cm, dan dikeringkan dengan open suhu 65 0 C selama 72 jam, kemudian di blender hingga menjadi tepung. Dilakukan maserasi dengan pelarut ethanol 95% dengan perbandingan 1000 gr bahan dalam 1 liter pelarut. Kemudian diinkubasi 72 jam untuk memberi kesempatan zat pelarut menarik bahan aktif. Dilakukan penyaringan atau filtrasi dengan menggunakan kertas saring whatman nomor 2. dilakukan ekstraksi dengan rotari evaporator dan didapatkanlah ekstrak mengkudu yang kering sebanyak 50 gr. Pembuatan ekstrak bauh mengkudu dilakukan di laboratorium biospestisida Pascasarjana Universitas Udayana. 4.5.2 Hewan Coba 1. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan berat 180-200 gr berumur 3 bulan kemudian dilakukan
32 aklimatisasi selama 1 minggu di tempat penelitian untuk penyesuaian dengan lingkungan. 2. Dilakukan induksi hipertensi buatan pada tikus putih jantan galur Wistar dengan memberikan alkohol 30 % secara oral sebanyak 0,5 ml setiap hari. Dalam 6 minggu diharapkan akan terjadi peningkatan tekanan darah sistolik dan diastolik tikus putih jantan dari tekanan fisiologis (100/80mmHg) menjadi 170-200 mmhg. 3. Setelah itu tikus putih jantan galur Wistar dibagi secara random menjadi 4 kelompok P0 (kontrol negatif ), P1 (kontrol positif), P2 (pemberian ekstrak buah mengkudu dosis 500 mg/kg BB), P3 (pemberian ekstrak buah mengkudu dosis 1000 mg/kg BB) 4. Tikus putih jantan galur Wistar ditempatkan pada kandang yang bersih dengan ventilasi yang baik dengan ukuran panjang 50 cm, lebar 50 cm, tinggi 40 cm. Selama periode 6 minggu tikus-tikus tersebut diberikan konsumsi makanan standar dan air minum ad libitum. 5. Setelah 6 minggu, pada kelompok kontrol P0 (diberikan akuades 0,5 ml), P1 (kontrol positip) P2 diberikan ekstrak buah mengkudu dosis 500 mg/kgbb, P3 diberikan ekstrak buah mengkudu dosis 1000 mg/kgbb. Pada setiap kelompok perlakuan diberikan alkohol 0,5 cc setiap hari dan dilakukan pengamatan terhadap berat badan tikus putih jantan galur Wistar dan kondisi kesehatannya selama penelitian berlangsung. 6. Pemberian ekstrak buah mengkudu dilakukan setiap hari secara oral selama 2 minggu. Langkah pertama dimulai dengan penyedotan
33 ekstrak buah mengkudu yang telah diencerkan dengan aquadest sebanyak 0,5 cc menggunakan sonde yang ujungnya terbuat dari karet. Tikus dipegang pada kulit bagian kepala sehingga mulut menghadap ke atas. Selanjutnya sonde dimasukkan melalui mulut secara perlahan sampai mencapai lambung. Kemudian ekstrak mengkudu disemprotkan. Pemberian ekstrak mengkudu ini dilakukan 3 kali sehari pada jam 08.00, 14.00, dan 20.00. 7. Pada minggu ke-8 dilakukan pengukuran tekanan darah tikus putih jantan galur Wistar pada masing-masing kelompok. 4.5.3. Dosis Konversi dari Manusia ke Tikus Pemberian dosis ekstrak buah mengkudu 500 mg/kgbb dan 1000 mg/kgbb berdasarkan tabel konversi dosis dari manusia ke tikus menurut Lurence (1984). Kelompok perlakuan dengan ekstrak mengkudu 500 mg/kgbb mendapat dosis konversi 30 mg/ 200g BB tikus, sedangkan kelompok perlakuan dengan dosis 1000 mg/kgbb mendapat dosis konversi 60 mg/200g BB tikus, untuk kontrol positif dengan captopril 3 mg/kgbb mendapat dosis 0,25 mg/200g BB tikus (Lucia, 2006) 4.5.4 Cara Pengukuran Tekanan Darah Hewan Coba Pengukuran tekanan darah dapat dilakukan pada tikus hipertensi spontan atau hipertensi buatan. Pengukuran tekanan darah dengan cara Tail Cuff method menggunakan alat blood pressure analyzer. Metode ini memungkinkan peneliti untuk mengetahui tekanan darah sistolik dan diastolik. Prinsip kerja pengukuran tekanan darah adalah Cuff digelembungkan sampai mencapai tekanan darah diatas
34 tekanan darah sistolik, sehingga nadi menghilang kemudian tekanan cuff dikurangi perlahan-lahan. Pada saat tekanan darah mencapai di bawah tekanan sistolik nadi akan muncul kembali. Cara pengukuran ini sesuai dengan cara pengukuran tekanan darah menggunakan sphigmomanometer pada manusia. Pengukuran tekanan darah pada metode Tail Cuff selain digunakan pada tikus juga dapat digunakan pada mencit, anjing, dan primata kecil (Ngatijan, 2006). 4.6. Bahan dan Alat 4.6.1 Bahan a. Tikus Putih jantan galur Wistar usia 3 bulan dengan berat badan 180-200gr b. Makanan standar untuk tikus c. Alkohol 30 % d. Ethanol 95% e. Aquadest f. Buah mengkudu 4.6.2 Alat-alat a. Kandang tikus ukuran 50 cm X 50 cm X 40 cm b. Timbangan electrical scale untuk ketelitian c. Spuit 3 cc d. Silver clip e. Sonde f. Blood pressure analyzer untuk mengukur tekanan darah tikus
35 4.7. Alur Penelitian Tikus putih jantan 32 ekor Diaklimatisasi 1 minggu Tikus putih jantan dibuat hipertensi Random Observasi tekanan darah tikus putih yang dibuat hipertensi O1,O2,O3,O4 Kontrol (P0) 8 ekor Perlakuan 1 (P1) 8 ekor Perlakuan 2 (P2) 8 ekor Perlakuan 3 (P3) 8 ekor Observasi 5 (O5) Observasi 6 (O6) Observasi 7 (O7) Observasi 8 (O8) Analisis data 4.8. Analisis Data a. Analisis deskriptif b. Uji normalitas data dengan uji Shapiro-Wilk c. Uji homogenitas dengan Levene Test
36 d. Uji komparabilitas dengan one way Annova. Karena distribusi data homogen. e. LSD (Least Significant Difference) untuk mengetahui kelompok yang berbeda.