II. METODE PENELITIAN 1. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1.1. Materi Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, cawan petri, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, beaker glass, object glass, pipet tetes, batang Drugalsky, rak tabung reaksi, sprayer alkohol, pembakar spirtus, jarum ose, cool box, tabung eppendorf, baki, hot plate and stirer, timbangan analitik, autoklaf, Laminar Air Flow, microcentrifuge, mikropipet, tip, alat elektroforesis, water bath, ph meter, oven, inkubator, UV transiluminator, dan perangkat PCR ( Polymerase Chain Reaction). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades steril, sampel tanah dari lahan penambangan timah di Belitung, alumunium foil, spirtus, kapas, kassa, label, alkohol 70%, medium NA ( beef extract 3 g, peptone 5 g, agar 15 g, dan akuades s.d 1000 ml), Medium cair ( Dunger and Fielder, 1989) untuk menumbuhkan bakteri pengoksidasi besi dan sulfur (KH 2PO 4 0,05 g, (NH 4) 2SO 4 0,15 g, Ca(NO 3) 0,01 g, MgSO 4.7H 2O 0,50 g, KCl 0,05 g, FeSO 4.7H 2O 1 g, dan akuades s.d 1000 ml), Medium padat 9K ((NH 4) 2SO 4 3 g, KCl 0,1 g, KH 2PO 4 0,5 g, MgSO 4.7H 2O 0,5 g, Ca(NO 3) 0,01 g, akuades 700 ml, H 2SO 4 (10N) 1 ml, FeSO 4.7H 2O 1 g dan agar 15 ml), wrapper, crystal violet, lugol s iodin, alkohol 96 %, safranin, buffer Tris EDTA (TE), lisozym, SDS ( Sodium Dedocyl Sulfate), es batu, kloroform, alkohol absolut, alkohol 70%, isopropanol, TE 1x, agarosa, loading dye, Tris Asam asetat glasial EDTA (TAE), Fluorosafe DNA staining, primer universal 27F (5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3') dan 1540R ( 5 AAGGAGGTGATCCAACCGCA 3 ) (Ohnishi et al., 2009), dh 20, ddh 2O, DNA genom, dan KAPA 2G Fast Ready Mix. 1.2. Lokasi dan Waktu Penelitian Sampel diambil di tiga lokasi lahan tambang di Belitung yaitu Meranteh, Pasir Tebu dan Batu Penyu. Isolasi dan Identifikasi dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Genetika dan Molekuler Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto, dan Laboratorium Riset Universitas Jenderal Soedirman selama bulan Juli 2013 Februari 2014. 6
2. Metode Penelitian 2.1. Metode Percobaan Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur, seleksi, karakterisasi morfologi, dan identifikasi berdasarkan urutan basa gen 16S rrna. 2.2. Cara Kerja 2.2.1 Preparasi Sampel Tanah Sampel tanah diambil dari lahan penambangan timah di Belitung. Sampel tanah diambil dengan teknik random sampling di tiga lokasi berbeda. Sebelum pengambilan tanah, ph tanah diukur terlebih dahulu dengan menggunakan ph meter. Sampel tanah diambil pada kedalaman 10-15 cm dari permukaan tanah. Sampling di setiap lokasi dilakukan pada 2 titik yang berbeda, yaitu di tanah kering dan tanah basah (tergenang). Sampel tanah kemudian dimasukan ke dalam plastik dan disimpan dalam cool box. 2.2.2. Isolasi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur (Dara, 2000) Sampel tanah dari lokasi penambangan timah di Belitung di timbang sebanyak 1 g kemudian dimasukan ke dalam 9 ml akuades steril. Setelah itu dilakukan pengenceran bertingkat hingga 10-4. Sebanyak 0,1 ml di tiga seri pengenceran terakhir (10-2, 10-3, dan 10-4 ) diinokulasikan ke media media cair (Leathen et al., 1956) secara duplo. Selanjutnya diinkubasi selama 14x24 jam pada suhu 30 0 C. 2.2.3. Pengujian Kemampuan Tumbuh Isolat Bakteri pada Medium yang Mengandung Fe dan S (Nurseha dan Djajakirana, 2004) Isolat yang mampu tumbuh pada medium cair (Dunger dan Fielder, 1989), kemudian ditumbuhkan pada medium padat 9K secara SP ( spread plate) dan diinkubasi selama 14x24 jam pada suhu 30 0 C. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan melihat adanya pembentukan koloni karat, dan perubahan pada media agar di sekitar koloni dari bening menjadi kuning sebagai akibat teroksidasinya besi ferro (Fe 2+ ) menjadi besi ferri (Fe 3+ ) oleh isolat bakteri. 7
2.2.4. Perhitungan Jumlah Bakteri pada Media 9K Koloni yang tumbuh pada medium 9K diamati dan dihitung jumlah koloninya, kemudian ditentukan jumlah total bakteri dengan metode TPC (Total Plate Count). 2.2.5. Karakterisasi Morfologi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur (Ambarwati, 2002) Karakterisasi dilakukan terhadap jenis bakteri yang mampu mengoksidasi besi dan sulfur. Karakter yang diamati yaitu morfologi sel dan morfologi koloni, meliputi bentuk koloni, ukuran, warna, tepi, permukaan, elevasi, pigmentasi serta sifat Gram. 2.2.6. Pewarnaan Gram (Cappuccino dan Sherman, 1987) Setiap koloni yang memiliki morfologi berbeda, di uji pewarnaan Gram. Sebanyak satu ose isolat diulaskan pada object glass, kemudian difiksasi dengan melewatkan object glass pada pembakar spirtus. Ulasan diteteskan dengan Gram A atau cristal violet selama 1 menit, setelah itu dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Ulasan diteteskan lugol s iodine yang berfungsi sebagai mordant selama 1 menit. Kemudian ulasan dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Tahap selanjutnya adalah proses dekolorisasi dengan etanol sampai tetesan yang jatuh dari ulasan jernih. Ulasan dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Terakhir, safranin yang berfungsi sebagai warna pembanding diteteskan selama 1 menit, dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Setelah itu, ulasan diamati dengan mikroskop. 2.2.7. Seleksi Isolat Bakteri Berdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium yang Mengandung Fe dan S Seleksi isolat bakteri yang mempunyai kemampuan tumbuh terbaik pada medium yang mengandung Fe dan S dilakukan dengan inokulasi koloni bakteri sebanyak satu ose dan dicampurkan ke dalam medium cair (Leathen et al., 1956). Media yang telah diinokulasi selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari sambil dilakukan pengocokan secara terusmenerus dengan menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 125 rpm. Pada akhir inkubasi, dilakukan pengukuran OD ( Optical Density) dengan menggunakan UV -Spektrofotometer pada panjang gelombang 432 8
nm. Isolat dengan nilai OD tertinggi merupakan isolat yang memiliki kemampuan tumbuh terbaik pada medium cair yang mengandung Fe dan S. 2.2.8. Identifikasi Berdasarkan Urutan Basa 16S rrna 2.2.8.a. Ekstraksi DNA Bakteri Isolat Terpilih Ekstraksi DNA bakteri dilakukan dengan menggunakan 3 ml kultur cair sel bakteri dalam eppendorf steril (1,5 ml), dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang dan ditambahkan dengan 1 ml TE 1x, setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sel bakteri yang mengendap dilarutkan dalam 50 μl tenderizer 30% kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 60 menit. SDS 10% ditambahkan ke eppendorf sebanyak 50 μl dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke eppendorf steril baru dan ditambahkan alkohol absolut sebanyak setengah dari volume supernatant yang dipindahkan dan di bolak balik dengan hatihati agar terbentuk benang-benang DNA, kemudian disentrifugasi pada suhu 4 C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 100 μl etanol dingin dan disentrifugasi pada suhu 4 C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang, setelah itu DNA yang telah mengendap dikering anginkan selama ± 10 menit dan selanjutnya dilarutkan dalam 100 µl TE 1x. 2.2.8.b. Pengukuran Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer (Sambrook et al., 1989) Kemurnian DNA dilihat dari hasil spektrofotometer dengan rasio absorbansi DNA (A260 : A280). DNA dengan nilai rasio A260/280 antara 1,8-2,0 kemudian diamplifikasi dengan metode PCR. 2.2.8.c. Amplifikasi Gen 16S rrna Amplifikasi gen 16S rrna dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses amplifikasi dimulai dengan membuat campuran 17,5 µl ddh 2O, 25 µl KAPA 2G Fast Ready Mix, 1,25 µl forward primer 50pM, 1,25 µl reverse primer 50 pm dan 5 µl templat DNA 5 ng. 9
Campuran tersebut diamplifikasi menggunakan mesin PCR. PCR dilakukan dengan tahapan pre PCR 95 0 C selama 5 menit, denaturasi 94 0 C selama 1 menit, annealing 50 0 C selama 1 menit dan ekstensi 72 0 C selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan post PCR 72 0 C selama 10 menit. Suhu kemudian diturunkan 4 0 C selama 5 menit. 2.2.8.d. Running dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Riffiani, 2010) DNA hasil amplifikasi PCR di elektroforesis pada gel agarosa. Hasil amplifikasi dapat diketahui dari fraksinasi pita DNA pada gel agarose 1,5% dalam buffer TAE (Tris Asam asetat glasial EDTA) yang ditambahkan Fluorosafe DNA staining sebanyak 4µl/40ml agarosa. DNA hasil amplifikasi PCR kemudian dimasukkan ke dalam sumuran gel agarose. Running elektroforesis dilakukan selama 50 menit pada 100 V dan 400 ma. Hasil pemisahan divisualisasi menggunakan UV transluminator dengan menggunakan standar 1 kb DNA ladder untuk mengetahui hasil dan ukuran pita DNA hasil amplifikasi. 2.2.8.e. Sekuensing Proses sekuensing dilakukan dengan mengirimkan sampel DNA ke 1 st Base Pte Ltd Singapura untuk mengetahui urutan basa dari DNA sampel. 3. Metode Analisis Urutan basa hasil sekuensing dianalisis menggunakan software Bioedit, Blast, Clustal X dan rekonstruksi dendogram menggunakan program Mega 5.05 untuk mengetahui kekerabatan bakteri pengoksidasi Fe dan S dengan bakteri lain yang diunduh dari GenBank NCBI. 10