A. REAKSI UJI PROTEIN PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA M.T. SIMANJUNTAK J. SILALAHI Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan Farmasi Universitas Sumatera Utara I. PROTEIN 1. PENGENDAPAN PROTEIN OLEH GARAM-GARAM ANORGANIK Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam-garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang. a. ammonium sulfat b. pereaksi Millon (150 gr/l larutan merkuri sulfat dalam 15% v/v asam sulfat) c. pereaksi Biuret Cara Kerja: 1. Jenuhkan 10 ml larutan protein dengan ammonium sulfat, dengan cara penambahan ammonium sulfat kristal sedikit demi sedikit, aduk hingga larut. Tambah dan aduk lagi sehingga sedikit garam ammonium yang tertinggal tidak larut lagi (terbentuk larutan lewat jenuh). Saring. 2. uji kelarutan endapan dalam pereaksi Millon dan pada filtratnya tambahkan pereaksi Biuret. Pengendapan Protein oleh garam anorganik I ( endapan ) Millon. II ( filtrat ) Biuret 2. UJI KOAGULASI Protein dengan penambahan asam atau pemanasan akan terjadi koagulasi. Pada ph iso-elektrik (ph larutan tertentu biasanya berkisar 4 4,5 dimana protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling menetralkan) kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada temperatur diatas 60 o C kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tertier dan kuartener yang menyebabkan koagulasi. 2003 Digitized by USU digital library 1
a. asam asetat 1M b. pereaksi Millon Cara Kerja: 1. ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml larutan protein ditambahkan dua tetes asam asetat 1M. 2. letakkan tabung dalam air mendidih selama lima menit. 3. ambil endapan dan ujilah kelarutannya dalam air dan pereaksi millon. Uji Koagulasi I ( endapan ) Air. II ( endapan ) Millon 3. PENGENDAPAN DENGAN ALKOHOL Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pelarut organik akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga kelarutan protein berkurang, dan juga karena alkohol akan berkompetisi dengan protein terhadap air. a. HCl 0,1 M b. NaOH 0,1 M c. Buffer asesat 1M (ph 4,7) d. Etanol 95% Cara Kerja: 1. Sediakan 3 tabung reaksi dan isi masing-masing tabung reaksi dengan 5ml larutan protein. 2. Ke dalam tabung I : tambahkan 1ml HCl 0,1M dan 6ml etanol 95% II : 1ml NaOH 0,1M dan 6ml etanol 95% III : 1ml Buffer asetat dan 6ml etanol 95% 3. Lihat tabung-tabung mana yang tidak larut. Pengendapan dengan alkohol I ( 5 ml Protein ) 1 ml HCl 0,1 N 6 ml etanol 95 %. II ( 5 ml Protein ) 1 ml NaOH 0,1 N 6 ml etanol 95 %. III ( 5 ml Protein ) 1 ml buffer asetat 6 ml etanol 95 % 2003 Digitized by USU digital library 2
4. DENATURASI PROTEIN Denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, ikatan garam atau bila susunan ruang atau rantai polipetida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur sekunder, tertier dan kuartener, tetapi struktur primer (ikatan peptida) masih utuh. a. buffer asetat 1M (ph 4,7) b. HCl 0,1M c. NaOH 0,1M Cara Kerja: 1. Sediakan tiga tabung reaksi masing-masing tabung diisi dengan 9ml larutan protein. 2. Ke dalam tabung I : tambahkan 1ml HCl 0,1M II : 1ml NaOH 0,1M III : 1ml Buffer asetat 3. Tempatkan ketiga tabung dalam air mendidih selama 15 menit dan dinginkan pada temperatur kamar. 4. Lihat ke dalam tabung mana terjadi endapan. 5. Lanjutkan percobaan di atas terhadap tabung I dan II dengan menambahkan 10ml buffer asetat. Denaturasi Protein a ) I ( 9 ml larutan Protein ) 1 ml HCl 0,1 N. II ( 9 ml larutan Protein ) 1 ml NaOH 0,1 N. III ( 9 ml larutan Protein ) 1 ml buffer acetat b ) I ( Hasil a ) 10 ml buffer acetat. II ( Hasil a ) 10 ml Buffer asetat. B. PENENTUAN KADAR CASEIN Casein merupakan protein yang terdapat dalam susu. Hampir 80% protein dalam susu terdiri dari casein di samping Laktalbumin dan laktoglobulin. a. Asam asetat 1 N dan 0,25 N b. NaOH 0,1 N c. Formaldehide 40% d. Fenolftalein 2003 Digitized by USU digital library 3
Cara kerja : 1. 20 ml sampel masukkan dalam beaker glas, panaskan di penangas air pada suhu 40 o C. bila digunakan sampel susu kental diencerkan dengan aquades perbandingan 1:2 dan susu bubuk ditambahkan aquades 1:9. 2. Tambahkan 1,5 ml asam asetat 1 N, aduk homogen dan diamkan selama 20 menit. Tambah lagi 4,5 ml asam asetat 0,25 N (untuk mencapai ph isoelektrik dari casein) aduk dan diamkan selama 1 jam. 3. Dekanter kedalam corong dengan kertas saring. Cuci endapan dengan aquades sampai air cucian bersifat netral. 4. Kemudian kertas saring dan endapan masukkan kedalam beker semula dan tambahkan aquades sampai dengan volume ± 20 ml. 5. Tambahkan 4 ml larutan NaOH 0,1 M, panaskan diatas penangas air sampai larut seperti susu dan dinginkan sampai suhu 21-24 o C, teteskan 3 tetes fenolftalein. 6. Tambahkan 4 ml formaldehide 40% (warna rose hilang), titrasi dengan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna rose kembali. Kadar Casein = ml NaOH 0,1 N 0,9 % Catatan: Protein bersifat amfoter sehingga sulit dititrasi sebagai asam maupun sebagai basa. Supaya dapat dititrasi sebagai asam, maka sifat basa dari gugus amino dapat dihilangkan dengan mereaksikannya dengan formaldehide sehingga ion H + dapat dititrasi dengan NaOH. Reaksi: + H 3 N- -COO - + 2 HCOH (HOCH 2 ) 2 NH + - -COO - Protein Formaldehide (HOCH 2 ) 2 NH + - -COO - + NaOH (HOCH 2 ) 2 NH + - -COO - + Na + + H 2 O Penentuan Kadar Casein Volume NaOH 0,1 N V 1 =.. ml V 2 =.. ml V 3 =.. ml V rata rata = ml Kadar Casein = Vol rata rata NaOH 0,1 N x 0,9 % II. KARBOHIDRAT C. REAKSI UMUM KARBOHIDRAT 1. Reaksi Molish Prinsip: ikatan glikosida pada karbohidrat akan terhydrolisa oleh H 2 SO 4 (pekat) menghasilkan monosakarida yang kemudian dihydrasi membentuk Furtural. Dan bila direaksikan dengan Alpha Naftol akan memberikan warna ungu. Bahan/Alat : - Larutan karbohidrat - Asam sulfat pekat - Larutan alpha nafthol 5% dalam etanol.(dibuat baru) - Tabung reaksi 2003 Digitized by USU digital library 4
Cara Kerja : 1. Dalam tabung reaksi yang bersih dan kering dimasukkan 2 ml larutan karbohydrat dan 3 tetes larutan alpha nafthol 2. Melalui dinding tabung tambah secara perlahanlahan larutan asam sulfat pekat sampai terbentuk cincin coklat. 3. Ulangi percobaan di atas dengan mempergunakan 2 ml air sebagai pengganti 2 ml larutan karbohydrat. (percobaan blanko). Amati apa yang terjadi. Keterangan : Disakarida yang dalam suasana asam akan terhidrolisa dan menyebabkan reaksi positif. Reaksi positif. Ditunjukkan dengan adanya Endapan Cu 2 O yang berwarna merah bata. Reaksi Molish Tabung Bahan Pereaksi Hasil Keterangan I II 2 ml Karbohydrat 3 tts alpha napthol 2 ml air, 3 tts lar. Alpha napthol H 2 SO 4 P H 2 SO 4 P... 2. Reaksi Yodium Prinsip : Senyawa polisakarida akan memberikan warna yang spesifik dengan yodium. Bahan dan alat : - Larutan amyulum - Larutan dekstrin - Larutan Yodium - Spot plate Larutan yodium terdiri dari: Kristal yodium kalium yodida dan aquades Cara kerja : 1. Pada plat tetes yang bersih dan kering dimasukkan 3 tetes larutan yang diperiksa. 2. Campur dengan 2 tetes larutan yodium 3. Terbentuk warna biru untuk amylum dan warna merah anggur untuk dekstrin. Reaksi Yodium Plat tetes Bahan Pereaksi Hasil Keterangan Lobang I 3 tetes sampel 2 tetes Yodium.. Lobang II 3 tetes sampel 2 tetes Yodium.. 3. Reaksi Benedict Prinsip: Cu 2+ akan direduksi oleh gula menjadi Cu +. Dalam hal ini terbentuk endapan Cu 2 O. reaksi dinyatakan positif apabila terbentuk endapan berwarna biru kehijauan sampai merah batu bata. (tergantung pada kadar gula reduksi yang tersedia). 2003 Digitized by USU digital library 5
Bahan dan alat: - Larutan sukrosa (Lar...) - Larutan laktosa (Lar...) - Larutan Benedict - Tabung reaksi Cara kerja: 1. Ke dalam tabung reaksi yang bersih dan kering dimasukkan 1 ml larutan yang akan diselidiki kemudian dicampur dengan 2 ml larutan Benedict. Kocok. 2. Didihkan selama 2 menit atau masukkan dalam air yang mendidih selama 5 menit. 3. Perhatikan warna reaksi yang terjadi. Larutan Benedict terdiri dari; - CuSO 4. 5H 2 O... - Na 2 CO 3 6 H 2 O... - Natrium Citrat... - Aquades... Reaksi Benedict I (1 ml sampel) 2 ml Benedict D. PENENTUAN KADAR GLUKOSA 1. Yodimetri Prinsip: Glukosa adalah termasuk gula reduksi karena monosakarida yang memiliki gugus OH laktol bebas dan dapat berobah menjadi glukosa alifatis dengan gugus aldehide sebagai reduktor lemah dan kemudian dapat dioksidasi oleh oksidator lemah seperti Yodium membentuk asam glukonat. a. Indikator larutan kanji b. Larutan natrium karbonat 14,3 % c. Larutan Yodium 0,1 N d. HCl encer e. Larutan natrium tiosulfat 0,1 N Cara kerja: Ditimbang seksama sampel padat yang mengandung kira-kira 100 mg glukosa yang tidak mengandung reduktor lainnya, dilarutkan di dalam 50 ml air suling di dalam erlenmeyer bertutup. Ditambahkan 25 ml yodium 0, 1 N dan 10 ml larutan natrium karbonat 14,3 %, ditutup dan dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap. Kemudian ditambahkan 15 ml asam klorida encer dan yodium yang tersisa dengan larutan natrium tiosulfat 0,1 N sampai terjadi warna kuning lemah. Ditambahkan lagi indikator kanji dan lanjutkan titrasi sampai warna biru hilang. Dilakukan titrasi blanko. Tiap ml yodium 0,1 N setara dengan 9,9185 mg glukosa. Penentuan Kadar Glukosa Volume larutan 0,1 N yodium V 1 =.. ml V 2 =.. ml V 3 =.. ml V rata rata larutan Yodium = ml 2003 Digitized by USU digital library 6
III. LIPIDA Lipida adalah senyawa organik yang terdapat dalam mahluk hidup yang larut di dalam pelarut non-polar tetapi tidak larut di dalam air. Lipida terdiri dari lemak (sekitar 95%), steroida, karotenoida, vitamin yang larut dalam lemak. E. PEMERIKSAAN KELARUTAN LEMAK Prinsip: Jika minyak dikocok kuat dengan air akan terjadi emulsi yang tidak mantap karena butir-butir minyak kecil akan memisah dari air. Penambahan emulgator misalnya, protein, gom, sabun akan terbentuk emulsi yang stabil. Lemak larut dalam pelarut non-polar seperti eter, heksan, bensin, kloroform, tetapi tidak larut didalam pelarut polar. Lemak dalam larutan NaOH atau KOH akan terjadi penyabunan. Bahan dan alat: - Minyak goreng, mentega - Bensin, air, eter, alkohol 95%, NaOH 1 N - Tabung reaksi, pipet ukur Cara kerja : 1. Siapkan 5 buah tabung reaksi yang bersih dan kering 2. Tanbahkan pada masing-masing tabung reaksi 1 ml minyak goreng, kenudian dicampurkan dengan bahan sebagai berikut: - Tabung I : ditambah 1 ml air - Tabung II : ditambah 1 ml bensin - Tabung III : ditambah 1 ml alkohol 96% - Tabung IV : ditambah 1 ml eter - Tabung V : ditambah 1 ml NaOH 1N 3. Aduk-aduk sampai homogen. Diamkan beberapa menit dan amati serta catat perubahan yang terjadi. 4. Ulangi percobaan di atas dengan memakai mentega sebagai sumber lipida. Tabung Minyak goreng Pereaksi Hasil Keterangan I II III IV V 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml air 1 ml Bensin 1 ml alkohol 96% 1 ml eter 1 ml NaOH...... F. REAKSI PENYABUNAN DAN SIFAT-SIFAT ASAM LEMAK Prinsip: Sabun merupakan garam alkali dari asam lemak rantai panjang yang bersumber dari minyak atau lemak, dimana jumlah rantai karbon mulai dari asam lemak pembentuk sabun dari atom C-10-C-16. Kebanyakan sabun dibuat dengan jalan penyabunan antara lemak dengan suatu basa monovalen seperti natrium hidroksida melalui reaksi penyabunan. Bahan dan alat : - Larutan NaOH 1N, HCl 1N, etanol 96%, bensin - Beker glas, erlenmeyer, batang pengaduk - minyak goreng kelapa sawit 2003 Digitized by USU digital library 7
Cara kerja : 1. 5 gram minyak goreng dimasukkan ke dalam beker glas kemudian ditambahkan NaOH 1 N sedikit demi sedikit sambil dipanaskan pada suhu 70 o C sebanyak 5x 0,142 g = 1,71 g (yang terdapat dalam sekitar 42 ml 1N NaOH). Pemanasan dilanjutkan sampai terbentuk sabun. Kedalam larutan sabun yang telah terbentuk ditambahkan HCl 1N kemudian amati apa yang terjadi. 2. Kedalam campuran yang telah ditambahkan HCl ditambahkan bensin atau alkohol 96 % dan amati apa yang terjadi. Reaksi Penyabunan Tabung NaOH 1 N Pemanasan HCl 1 N Hasil I 42 ml 30 menit 5 ml + bensin ---- > +alkohol 96% ---- > G. PENENTUAN KADAR LEMAK SUSU Metode ini digunakan untuk penetapan kadar lemak susu. Metode ini banyak digunakan di Eropa sebagai analisa rutin. Prinsip: Susu dicampur dengan H 2 SO 4 dan amil alkohol dalam tabung Gerber khusus lalu disentrifuse sehingga lemak susu terpisah dan menempati bagian atas tabung. Lemak yang terpisah ini dapat ditentukan kadarnya dengan melihat panjang kolom lemak yang terbentuk. 1. Asam sulfat 90% (w/w), BJ 1,815 2. Amil alkohol Peralatan: 1. Tabung butirometer Gerber 2. Sentrifuse Gerber berdiameter 50 cm 3. Pipet volumetri 10,75 ml (lihat catatan 1) Cara kerja: 1. Masukkan 10 ml H 2 SO 4 ke dalam tabung butirometer dengan tanpa membasahi leher tabung. 2. Pipet 10,75 ml susu, masukkan ke dalam tabung butirometer dengan tanpa membasahi leher tabung. 3. Tambahkan 1 ml amil alkohol. Tutup tabung dengan penutupnya, kocok merata, sentrifuge selama 4 menit pada 1100 rpm. 4. Tempatkan tabung dalam penangas air 65 o C, selama 3 menit. 5. Baca persentase kadar lemak (w/w), sesuai dengan panjang kolom tabung yang telah dikalibrasi. Catatan: 1. Jumlah sampel yang diambil untuk analisa ini berbeda-beda untuk setiap negara, sebagai contoh: India 10,75 ml Belanda 10,66 ml Hongaria 10,80 ml Inggris 10,94 ml AS 11,00 ml 2. Jangan tambahkan amil alkohol sedemikiam rupa sehingga kontak langsung dengan asam. 2003 Digitized by USU digital library 8
3. Persiapkan kain dan sodium bikarbonat. Kedua bahan ini berguna jika tabung butirometer yang berisi H 2 SO 4 pekat pecah. H. PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODA LOWRY. 1. Prinsip : Dialam protein terdapat dalam 3 ( tiga ) bentuk, yaitu ; a. Protein bebas. b. Protein yang tidak terlarut, terdapat dalam tulang, otot, rambut dan gumpalan darah. c. Protein terlarut, terdapat banyak dalam bahan pangan seperti susu, telur dan daging. Penentuan kadar protein terlarut ini berdasarkan pada berbagai metoda, misalnya : titrasi formol, spektrofotometri dan sebagainya. 2. Tujuan : Untuk menentukan kadar prtein terlarut dalam suatu bahan secara cepat. 3. Bahan & Alat : Larutan protein yang diselidiki Pereaksi Lowry A dan Lowry B. Larutan buffer asetat ph 5.0 Tabung reaksi 20 ml. Seperangkat spektrofotometer 4. Cara kerja : 1. Penentuan panjang gelombang maksimum. a. Siapkan larutan protein dalam konsentrasi tertentu dalam tabung reaksi yang bersih dan kering. b. Tambahkan 8 ml pereaksi Lowry A, diamkan selama 10 menit. c. Kemudian tambahkan 1 ml pereaksi Lowry B, diamkan selama 10 menit. Jumlah seluruh volume 10 ml. d. Ukur absorbansi sampel dari panjang gelombang 400 nm - 800 nm, pada alat spektrofotometer. e. Bentuk kurva absorbansi Vs panjang gelombang. 2. Pembuatan kurva kalibrasi larutan protein. a. Timbang teliti 300 mg albumin ( protein ), larutkan dalam 1liter air ( konsentrasi = 300 mg/ L = 300 µg / ml). b. Siapkan larutan protein tersebut dalam 10 tabung reaksi Sehingga kadarnya bertingkat dari 30 300 mg / ml Cara pengenceran dapat dilakukan sebagai berikut : c. Tambahkan kedalam masing masing tabung reaksi diatas 8 ml pereaksi Lowry A,diamkan selama 10 menit. d. Kemudian tambahkan 1 ml larutan pereaksi Lowry B, diamkan selama 10 menit. Volume akhir setiap tabung adalah 10 ml Sehingga konsentrasi protein perlu diperhitungkan dengan pengencerannya. e. Dengan alat spektrofotometer diukur absorbansi masing masing tbg tersebut pada panjang gelombang maksimum. ( 600 nm ) f. Buat kurva kalibrasi pada kertas grafik dengan menunjukkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi 2003 Digitized by USU digital library 9
Tabung No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ml larutan protein ( 300 µg / ml ) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 ml H 2 0 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 µg protein / ml 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 3. Pengukuran sampel. a. Larutan protein yang terlarut dari sampel, misalnya enzyme,albumin,dan lain lain diendapkan terlebih dahulu dengan kristal ammonium sulfat ( jumlahnya tergantung pada jumlah protein dalam sampel, sampai mengendap sempurna ). b. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisahkan. c. Endapan berupa protein dilarutkan kembali dalam larutan buffer asetat ph 5,0 sebanyak 5 ml. d. Pipet 1 ml dari larutan protein ph 5,0, masukkan kedalam masing masing tabung reaksi yang bersih dan kering ( 3 buah ). Campur dengan 8 ml larutan pereaksi Lowry A, diamkan selama 10 menit. e. Kemudian kedalam tabung tersebut ditambahkan 1 ml larutan pereaksi Lowry B, diamakan selama 10 menit. Volume akhir setiap tabung adalah 10 ml, sehingga konsentrasi protein dalam sampel perlu diperhitungkan dengan pengenceran ( dalam hal ini 1 : 10 ). 5. Data : 1. Kurva Kalibrasi ( 600 nm ) Tabung No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 µg protein / ml Absorbansi 0 3,0 6,0 9,0 12,0 15,0 18,0 21,0 24,0 27,0 2003 Digitized by USU digital library 10
2. Pengukuran sampel Tabung No 1 2 3 4 5 6 7 Absorbansi 6. Perhitungan : 7. Catatan. a. Pereaksi Lowry A - Asam phosphotungstat phosphomolibdat dalam air ( 1 : 1 ) b. Pereaksi Lowry B - Na 2 CO 3 2 % 100 ml dalam larutan NaOH 0,1 N, tambahkan 1mL CuSO 4 dan 1 ml K Na Tartrat 2 % c. Larutan dapar asetat ph 5,0. - Larutan I : 0,2 M larutan asam asetat Larutan II : 2 M larutan Na-asetat Campur larutan I 14,8 ml + larutan II 35,2 ml encerkan sampai 100 ml. 2003 Digitized by USU digital library 11