VETERINARIA Vol. 5 No. 3 Nopember 2012 Pola Resistensi Staphylococcus aureus yang Diisolasi dari Mastitis pada Sapi Perah di Wilayah Kerja KUD Argopuro Krucil Probolinggo terhadap Antibiotika Antibiotik Susceptibility Pattern of Staphylococcus aureus Isolated from Mastitis in Dairy Cattle at Argopuro Dairy Cooperative in Krucil Probolinggo District 1 Soetji Prawesthirini, 2 Adwin Ferianto, 1 Koesnoto Supranianondo 1 Fakultas Kedokteran Hewan Unair 2 PPDH Fakultas Kedokteran Hewan Unair Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115. Telp. 031-5992785, Fax. 031-5993015 Email : f_adwin@yahoo.com Abstract The purpose of this research was to find out the antibiotic susceptibility pattern of S. aureus isolated from milk of mastitis cases of dairy cattle at Argopuro Dairy Cooperative, Krucil. The antibiotic discs used for susceptibility test were oxytetracycline 30µg, penicillin 10U, ampicillin 10µg, cloxacillin 5µg and erithromycin 10µg according to Kirby-Bauer method. Twenty isolates of S. aureus from 21 mastitis cases samples had been identified by microscopic, Gram staining, and biochemical characteristics. The antibiotic susceptibility pattern of S. aureus isolates showed differentiation between each villages, which were non of Kalianang s isolates were resistance to all of antibiotics, 66,66% of Krucil s isolates were resistance to penicillin and ampicillin, 50% of Tambelang s isolates were resistance to erythromycin, 66,66% of Bremi s isolates were resistance to penicillin, 66,66% of Kertosuko s isolates were resistance to penicillin and 66,66% Watu Panjang s isolates were resistance to penicillin, ampicillin and erythromycin. Keywords : Antibiotic susceptibility pattern, Staphylococcus aureus, Dairy cattle mastitis, Argopuro dairy cooperative Pendahuluan Mastitis adalah proses keradangan pada ambing yang dapat berlangsung secara akut, sub akut, maupun kronis yang ditandai dengan kenaikan jumlah sel dalam air susu, perubahan fisik maupun susunan susu, tanpa atau disertai perubahan patologi atas kelenjarnya sendiri (Subronto, 2003). Berdasarkan ilmu epidemologi terdapat tiga faktor yang mempermudah terjadinya penyakit (Djajalogawa, 2000), pada kasus mastitis tiga faktor tersebut antara lain kondisi sapi sebagai inang, kondisi lingkungan yang buruk dan mikroorganisme sebagai agen penyebab penyakit. Salah satu mikroorganisme utama penyebab mastitis pada sapi adalah bakteri Staphylococcus aureus. Tingkat kejadian infeksi Staphylococcus aureus dalam suatu kandang suatu kandang seringkali mencapai 35% (Subronto, 2003). Koperasi Unit Desa Argopuro kecamatan Krucil kabupaten Probolinggo membawahi peternak-petenak dengan jumlah populasi 7.628 ekor pada tahun 20011. Berdasarkan laporan screening sebelumnya kasus mastitis terbanyak adalah subklinis, dengan kebiasaan penduduk disana yang tidak memperhatikan perawatan pada sapi perah yang terkena mastitis subklinis maka akan berkembang menjadi klinis. Penanggulangan kasus mastitis yang sering dilakukan yaitu dengan pemberian antibiotika (Wasitaningrum, 2009). Beberapa obat yang sering digunakan untuk mengobati mastitis di KUD Argopuro antara lain oksitetrasiklin, penisilin, dan ampisilin, namun berdasarkan keterangan tenaga kesehatan hewan disana antibiotika tersebut sudah tidak ampuh lagi untuk mengobati mastitis pada sapi perah. Penelitian yang pernah dilakukan oleh Estoepangestie dkk. (2003) terhadap kuman 181
Soetji Prawesthirini. Pola Resistensi Staphylococcus Aureus... penyebab mastitis pada sapi perah di KUD Dadi Jaya Purwodadi Kabupaten Pasuruan menunjukkan bahwa Staphylococcus spp. hasil isolasi dari KUD tersebut 90% peka terhadap cloxacillin dan erithromycin, 70% peka terhadap oxytetracycline, 50% peka terhadap penicillin, dan hanya 40% yang masih peka terhadap ampicillin. Penentuan antibiotika yang tepat untuk suatu pengobatan mastitis seharusnya didasarkan atas uji sensitifitas bakteri penyebab penyakit (Subronto, 2003). Metode difusi disk (Disk diffusion test) merupakan metode yang sering digunakan pada uji sensitifitas bakteri. Hasil metode difusi disk dapat dilihat dengan mengukur diameter zona terang (Cleare zone) yang merupakan petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh antibiotika (Hermawan, 2007). Penelitian ini bertujuan untuk mengatahui pola resistensi Staphylococcus aureus yang diisolasi dari sapi perah mastitis di tiap desa wilayah KUD Argopuro terhadap tiga antibiotika yang sering digunakan disana yaitu oksitetrasiklin, penisilin, ampisilin ditambah dengan dua antibiotika alternatif yaitu kloksasilin dan eritromisin. Materi dan Metode Penelitian Tempat dan waktu penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya. Pengambilan sampel dilakukan di wilayah kerja KUD Argopuro kecamatan Krucil kabupaten Probolinggo. Pelaksanaan penelitian ini pada bulan Mei Juli 2012. Pengambilan sampel Pengambilan sampel dilakukan secara Non Probability Sampling sehingga tidak melibatkan unsur peluang untuk penarikan sampel. Pemilihan sampel bertujuan memperoleh satuan sampel yang memiliki karakteristik yang dikehendaki peneliti atau Purposive sampling (Setiawan, 2005). Dalam hal ini sampel yang memenuhi kriteria adalah sampel susu sapi mastitis yang diambil dari enam desa berdasarkan data hasil screening yang telah dilakukan oleh KUD Argopuro sebelumnya dan laporan peternak. Sampel susu mastitis diambil dan ditampung pada tabung steril dari tiap kuartil yang menunjukkan gejala klinis dan positif CMT lalu ditutup dengan penutup karet serta diberilabel. Simpan pada termos berisi es hingga tiba di laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner. Pemerikasan CMT Pemeriksaan CMT dapat dilakukan pada kuartil yang menunjukkan gejala klinis atau subklinis yang ditandai dengan penurunan produksi berdasarkan informasi dari peternak. Menurut Rice dan Dune (1981) serta Mallenbergen (2000) terdapat 5 interpretasi hasil CMT. Negatif berarti sapi tidak menderita mastitis, trace dan positif lemah berarti sapi menderita mastitis subklinis, positif sedang dan positif kuat berartti sapi tersebut menderita mastitis klini. Berdasarkan hal tersebut maka pemeriksaan CMT hanya dilakukan pada mastitis subklinis, sedangkan mastitis klinis dilakukan pemeriksaan palpasi dan visualisasi untuk mengatahui perubahan fisik ambing. Isolasi dan Identifikasi Staphylococcus aureus. Penanaman pada Mannitol Salt Agar (MSA) Isolasi bakteri pada media Mannitol Salt Agar (Merck, Art 105404) dilakukan dua kali, yang pertama dengan cara sebar permukaan gunanya untuk menumbuhkan bakteri pada susu, mula-mula ambil 0,1 ml susu kemudian tuang dan ratakan pada permukaan MSA inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Koloni Staphylococcus aureus dapat memfermentasi mannitol ditandai dengan perubahan warna media MSA dari merah menjadi kuning, kemudian diambil dengan ose untuk dilakukan pemurnian pada media MSA lagi. Pemurnian dilakukan dengan cara streak pada permukaan MSA kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C, dari pemurnian ini akan dilanjutkan identifikasi bakteri. Identifikasi bakteri Identifikasi bakteri yang pertama dengan cara pemeriksaan mikroskopis serta pewarnaan Gram, yaitu dengan mengambil sedikit koloni dari pemurnian pada MSA dan fiksasi diatas api kemudian tuangkan zat pewarnaan gram antara lain Kristal Violet (Merck, Art 1408), Lugol (Merck, Art 9261), Alkohol aceton (Merck, Art 100014), Safranin (Merck, 1382), Aquades dan tetesi minyak Emersi (Merck, Art 104699). 182
VETERINARIA Vol. 5 No. 3 Nopember 2012 Kemudian diperiksa dibawah mikoskop dengan lensa obyektif pembesaran 100 kali. Identifikasi yang kedua dengan uji Katalase, yaitu dengan mengambil sedikit koloni dari pemurnian MSA dan letakkan pada obyek glass, kemudian tetesi dengan H 2 O 2 3% (Merck, Art 107210) dan amati adanya gelembung udara. Identifikasi yang ketiga yaitu dengan uji koagulase, mula-mula ambil sedikit koloni dari pemurnian pada MSA kemudian masukkan pada 0,5 ml MHB inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Setelah 24 jam maka tambahkan plasma darah kelinci dengan jumlah yang sama, campur hingga rata. Inkubasi campuran plasma kelinci dan suspensi bakteri tersebut selama 4 hingga 24 jam pada suhu 37 0 C dan amati adanya gumpalan. Pembuatan Suspensi Staphylococcus aureus Suspensi Staphylococcus aureus yang akan digunakan dibuat dengan memasukkan empat (4) koloni S. aureus ke dalam 4 ml media Muller Hinton Broth (Merck, Art 110293), kemudian diaduk hingga merata dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Suspensi tersebut disamakan kekeruhannya dengan standart Mc Farland I yang mengandung 3.10 8 kuman (Rosilawati dkk., 2009). Pelaksanaan Uji Sensitifitas Uji sensitifitas Staphylococcus aureus sebagai penyebab mastitis di wilayah kerja KUD Argopuro terhadap antibiotika dilakukan menurut metode difusi Kirby-Bauer. Media yang digunakan adalah Mueller Hinton Agar (Merck, Art 105437) dan 5 macam paperdisk antibiotika dari Oxoid oksitetrasiklin 30µg (Art 251537), penisilin 10U (Art 265614), ampisilin 10 µg (Art 268952), kloksasilin 5µg (Art 266676), dan eritromisin 10µg (Art 236708). Hasil pengujian difusi disk terlihat adanya daerah bening atau jernih di sekeliling Paperdisk sebagai daerah hambatan pertumbuhan kuman. Diameter daerah hambatan tersebut di bedakan menjadi 3, yaitu peka (sensitif), kurang peka (intermediate) dan tidak peka (resisten) (Tyasningsih dkk., 2010). Pengamatan dilakukan dengan melihat zona hambatan pertumbuhan yang ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar paperdisk. Menurut Pollack et al., (2005) dan Alexander et al., (2004) apabila terdapat koloni bakteri didalam zona bening maka yang diukur adalah koloni tersebut, sebagai bakteri strain yang lebih resisten terhadap antibiotika. Hasil pengukuran diameter hambatan akan dicocokan dengan standart dari Kirby-Bauer sehingga dapat diketahui status resistensi antibiotikanya. Hasil dan Pembahasan Sampel yang berhasil didapatkan sebanyak 21 sampel susu mastitis, dengan 20 sampel mastitis subklinis dan 1 sampel mastitis klinis. Kemudian dilakukan isolasi dan identifikasi yang dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Isolasi dan Identifikasi Staphylococcus aureus Sampel Identifikasi Asal Kode MSA gram Kat* Koag* Krucil A1 F+ + + 4+ A2 F+ + + 2+ A3 F+ + + 2+ Tambelang B1 F+ + + 2+ B2 F+ + + 2+ B3 F+ + + 2+ B4 F+ + + 4+ Bremi C2 F+ + + 3+ C3 F+ + + 2+ C4 F+ + + 2+ Kalianang D1 F+ + + 2+ D2 F+ + + 3+ D3 F+ + + 2+ D4 F+ + + 2+ Kertosuko E1 F+ + + 2+ E2 F+ + + 2+ E3 F+ + + 2+ Watu panjang F1 F+ + + 2+ F2 F+ + + 2+ F3 F+ + + 1+ *Keterangan : Kat : Katalase Koag : Koagulase 183
Soetji Prawesthirini. Pola Resistensi Staphylococcus Aureus... Tabel 2. Persentase Resistensi Staphylococcus aureus terhadap antibiotika oksitetrasiklin 30µg, penisilin 10U, ampisilin 10µg, kloksasilin 5µg, eritromisin 10µg. Desa oksitetrasiklin penisilin ampisilin kloksaslin eritromisin Krucil 33,33% 66,66% 66,66% 0% 33,33% Tambelang 0% 25% 0% 0% 50% Bremi 0% 66,66% 33,33% 0% 0% Kalianang 0% 0% 0% 0% 0% Kertosuko 0% 66,66% 33,33% 0% 0% Watu panjang 0% 66,66% 66,66% 0% 66,66% Berdasarkan tabel 1 dapat kita lihat bahwa 20 sampel tersebut menunjukkan hasil yang sama yaitu positif memfermentasi mannitol, gram positif, Katalase positif, namun koagulase yang berbeda-beda. Hanya ada 2 sampel saja yang jelas menunjukkan adanya Staphylococcus auresu, sedangkan sampel lain menunjukkan koagulase yang lemah. Hasil koagulase lemah ini dapat dikatakan sebagai Staphylococcus aureus murni, hal ini kemungkinan karena hasil isolasi Staphylococcus aureus dari lapangan yang beragam sifat koagulasenya. Menurut Effendi (2009) rendahnya hasil isolasi Staphylococcus aureus disebabkan kemampuan tumbuh dan berkembangnya bakteri tersebut tergantung dari kemampuan untuk beradaptasi dengan perubahan lingkungan. Dari hasil identifikasi tersebut maka uji sensitifitas dapat dilakukan dan dapat dilihat hasilnya pada tabel 2. Berdasarkan Tabel 2 dapat dilihat bahwa pola resistensi Staphylococcus aureus dari desa Krucil, Bremi, Kertosuko dan Watu panjang menunjukkan bahwa antibiotika penisilin sudah tidak layak untuk pengobatan mastitis pada sapi perah di keempat desa tersebut. Sedangkan Staphylococcus aureus dari desa Krucil dan Watu panjang menunjukkan bahwa antibiotika ampisilin sudah tidak layak untuk pengobatan mastitis pada sapi perah di dua desa tersebut Penisilin dan ampisilin termasuk golongan antibiotika β-laktam (Effendi, 2009). Beberapa bakteri dapat membentuk enzyme perusak (βlaktamase) yang membuka cincin β-laktam dari penisilin dan menghilangkan daya antimikrobanya (Jawetz et al., 2008). Pada Staphylococcus aureus, β-laktamase diperantarai plasmid berupa penicillinase (Jawetz et al., 2008). Sedangkan resitensi Staphhylococcus aureus terhadap ampisilin bisa terjadi karena resitensi silang. Resistensi silang bisa terjadi jika bakteri yang telah resisten terhadap suatu obat tertentu dapat pula resisten terhadap obat lain yang mempunyai mekanisme kerja obat yang mirip satu sama lain (Wasitaningrum, 2009). Hasil yang berbeda ditunjukkan oleh oksitetrasiklin walaupun ketiga antibiotika ini sering digunakan untuk pengobatan mastitis disana. Hasil uji sensitifitas oksitetrasiklin terhadap Staphylococcus aureus dari tiap-tiap desa menujukkan bahwa antibiotika tersebut masih ampuh untuk pengobatan mastitis. Hasil uji sensitifitas berbeda juga terlihat pada antibiotika kloksasilin dan eritromisin, walaupun antibiotika kloksasilin termasuk dalam golongan penisilin namun dari semua Staphylococcus aureus tiap desa menunjukkan resistensi 0% (sensitif 100%). Hal ini menunjukkan bahwa Staphylococcus aureus dari tiap desa tidak terdapat Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). MRSA termasuk strain dari Staphylococcus aureus yang memiliki gen resisten terhadap antibiotika methicillin dan antibiotika β-laktam lainnya (CFSPH, 2011). Beberapa antibiotika yang termasuk sintesis penicillin yang tahan terhadap enzyme penicillinase antara lain metisilin, azidosilin, oksasilin, nafsilin, kloksasilin, quinasilin dan dikloksasilin (Ahrens, 1996). Hasil yang sama juga terlihat pada antibiotika eritromisin, resistensi terhadap antibiotika tersebut pada tiga desa (Bremi, Kalianang dan Kertosuko) menunjukkan resistesi 0%, sedangkan tiga desa lainnya menunjukkan adanya resistensi yang beragam. Beberapa strain Staphylococcus aureus mempunyai eritromisin- 184
VETERINARIA Vol. 5 No. 3 Nopember 2012 resistant methylase genes (erm A, erm B dan erm C) (Pechere, 2001 dalam Effendi, 2009) yang menyandi pemindahan dalam ribosom RNA dengan fungsi mencegah pengikatan makrolida pada bakteri sehingga menghasilkan reistensi tingkat tinggi. Berdasarkan tabel 2 juga dapat dilihat Staphylococcus aureus dari desa Kalianang menunjukkan tidak resisten terhadap kelima antibiotika. Dari hasil isolasi sampel susu desa Kalianang tersebut didapatkan Staphylococcus aureus yang tidak memiliki enzyme penicillinase. Penelitian yang dilakukan di beberapa wilayah KUD Argopuro ini mendapatkan sampel sejumlah 21 dengan jumlah sapi sebanyak 21 ekor. Jumlah ini hanya sekitar 0,275% dibandingkan dengan total populasi sapi perah di daerah tersebut yang mencapai 7628 ekor pada tahun 2011. Artinya penelitian ini hanya memberikan gambaran awal sejauh mana kasus mastitis yang disebabkan Staphylococcus aureus terjadi di beberapa wilayah di KUD Argopuro kecamatan Krucil kabupaten Probolinggo. Penelitian lanjutan dengan jumlah sampel yang representatif terhadap populasi akan bermanfaat terutama untuk memberi pengetahuan bahwa Staphylococcus aurues di beberapa wilayah KUD tersebut memiliki resistensi yang berbeda. Sehingga dalam penanggulangan dan pengobatan mastitis pada sapi perah dapat memilih antibiotika yang sesuai untuk beberapa wilayah di KUD Argopuro. Kesimpulan Staphylococcus aureus yang disolasi dari mastitis pada sapi perah desa Krucil kebanyakan resisten terhadap penisilin dan ampisilin sebesar 66,66%. Staphylococcus aureus yang disolasi dari mastitis pada sapi perah desa Tambelang kebanyakan resisten terhadap eritromisin sebesar 50%. Staphylococcus aureus yang disolasi dari mastitis pada sapi perah desa Bremi kebanyakan resisten terhadap penisilin sebesar 66,66%, Staphylococcus aureus yang disolasi dari mastitis pada sapi perah desa Kalianang tidak menunjukkan resistensi terhadap kelima antibiotika, Staphylococcus aureus yang disolasi dari mastitis pada sapi perah desa Kertosuko kebanyakan resisten terhadap penisilin sebesar 66,66%, Staphylococcus aureus yang disolasi dari mastitis pada sapi perah desa Watu panjang kebanyakan resisten terhadap penisilin, ampisilin, dan eritromisin sebesar 66,66%. Daftar Pustaka Ahrenz, F.A. 1996. Pharmacologi. The national veteriner medical series. A Wolters Kluwer Company. USA. ISBN 0-683- 00085-3. Alexander, S.K., D. Strete and M.J. Niles. 2004. Laboratory exercises in organismal and molecular microbiology. Mc Graw-Hill Companies. 1 st edition. USA. ISBN : 0-07-24874-5. 188. CFSPH. 2011. Methicillin Resistant Staphylococcus aureus. http://www.cfsph.iastate. edu/factsheets/pdfs/mrsa.pdf. 31 Agustus 2012. Djajalogawa, S.D. 2000. Epidemologi dan Ekonami Veteriner. Yayasan Agribisnis Indonesia Mandiri. Jakarta. ISBN : 979-97639-1-6. 19 Estoepangesti, A.T.S., S. Prawesthirini, dan Budiarto. 2003. Peta resistensi antibiotika kuman penyebab mastitis pada sapi perah di wilayah kerja KUD Dadi Jaya Purwodadi Kabupaten Pasuruan Propinsi Jawa Timur. MKH; 19 (3) : 129-134. Effendi, M.H. 2009. Peta Resistensi Antibiotika Staphylococcus aureus dari Kasus Mastitis Sapi Perah di Beberapa Daerah Peternakan. Media Kedokteran Hewan. Vol.24. No.3. Hermawan, A. 2007. Pengaruh Ekstrak Daun Sirih (Piper betle Linn.) Terhadap Pertumbuhan Staphilococcus aureus dan Escherichia coli dengan Metode Difusi Disk. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga Surabaya. Jawetz., E., J. Melnick and E. Adelberg. 2008. Mikrobiologi kedokteran. 23 th editor R.N. Elferia. EGC. Jakarta. 164-168, 170, 225. Mallenberger, R. 2000. California Mastitis Test. Dept. of Animal Sciences, Michigan State University. Pollck. R.A., L. Findlay, W.M. Chein and R.R. Modesto. 2005. Laboratory Exercises in Microbiology. John Wiley and Sons Inc.USA. ISBN : 0-471-42082-4. 102. Rice, and N. Duane. 1981. "G81-556 Using the California Mastitis Test (CMT) to Detect 185
Soetji Prawesthirini. Pola Resistensi Staphylococcus Aureus... Subclinical Mastitis" (1981). Historical Materials from University of Nebraska- Lincoln Extension. Paper 483. Rosilawati, E., N. Apriantini dan E.B. Sasongko. 2009. Uji Beberapa Bahan Antimikrobial Terhadap Staphylococcus aureus Penyebab Mastitis pada sapi Perah di Wilayah Kerja KUTT Suka Makmur Grati Pasuruan. Veteriner Medika. 2(1). Setiawan, N. 2005. Teknik Sampling. Diktat Metodologi Penelitian Sosial. Universitas Padjadjaran. Bogor. Subronto. 2003. Ilmu Penyakit Ternak I. Edisi Keempat. Gajah mada University Press. Yogyakarta. 309-351. Wasitaningrum, I.D.A. 2009. Uji Resistensi Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dari Isolat Susu Sapi Segar Terhadap Beberapa Antibiotika [skripsi]. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiah Surakarta. 186