Prosedur Pengujian Mikrobiologi untuk Identifikasi gen Penyebab Mastitis Subklinis pada Sapi Perah lpha-eta hemolytic Staphylococcus aureus
aftar Isi Pendahuluan 1 ab 1 ara Penanganan dan Pengambilan contoh 2 1. ahan pengambilan contoh 2 2. Teknik pengambilan contoh 3 3. Penanganan dan penyimpanan contoh 4 ab 2 ahan dan lat iagnostik 5 1. Pendahuluan dan informasi umum 5 2. Peralatan yang dibutuhkan 5 3. Lembar kerja (format isian) 6 ab 3 Prosedur Pengujian 10 1. Pewarnaan Gram 10 2. Uji Katalase 12 3. Uji KOH 13 4. Uji MP-Esculin 14 5. Uji oagulase 15 ab 4 Prosedur iagnostik 16 1. Inokulasi contoh susu 16 2. Prinsip kerja 18 3. ontoh yang terkontaminasi 18 ab 5 Identifikasi Penyebab Mastitis Subklinis 19 1. Proses identifikasi 19 2. Prosedur Identifikasi Penyebab mastitis Subklinis 20 ab 6 Streptococci 21 1. Pola Hemolysis 21 2. Identifikasi Streptococcus 21 3. Streptococcus canis (S) 22 ab 7 Staphylococci 23 1. Pola Hemolysis 23 ab 8 oliforms (O) 24 ab 9 orynebacterium bovis () 25
ab 10 Uji Sensitivitas ntibiotik (dimodifikasi) 26 1. Tujuan 26 2. Uji isk diffusion susceptibility 26 3. atatan 26 ab 11 Kultur biakan dari ulk Tank (TPS) 27 1. Prosedur kultur biakan ulk Tank 27 2. Hasil kultur biakan ulk Tank 27 3. Hal yang perlu diperhatikan 28 ab 12 Klasifikasi dan Karakter Mikroba Penyebab 29 Mastitis Subklinis 1. Klasifikasi 29 2. Karaktaeristik dan pengendalian 29 3. Mikroba Penyebab Mastitis yang infeksius 30 4. Penyebab Mastitis dari Lingkungan 35 aftar Singkatan Staphylococcus aureus Staphylococci oagulase Negative Staphylococci Streptococcus agalactiae Streptococci Streptococcus canis Other Streptococci (Environmental Streptococci) oliforms orynebacterium bovis Others (mikroba lainnya) S NS SG S OS O OTH Sumber Tulisan; LORTORY HNOOK ON OVINE MSTITIS (NM) Microbiological Procedures for Use in the iagnosis of ovine Mastitis (NM)
Pendahuluan Mastitis merupakan masalah yang sering ditemui diseluruh dunia. Kondisi mastitis berbeda-beda tergantung pada daerah/ Negara, tapi metode yang digunakan untuk pengendalian mastitis pada dasarnya sama. Penyebab utama mastitis adalah mikroorganisme, oleh karena itu sangat penting untuk melakukan proses identifikasi mikroba dari susu dan sapi yang terkena mastitis sehingga pada akhirnya bisa dibuat satu program untuk pengendalian mastitis tersebut. Jika anda ingin melaksanakan program pengendalian mastitis, pengujian bakteriologis susu santa penting dilakukan karena mastitis merupakan penyakit yang infeksius (menular). ontoh susu dari seluruh sapi dari satu kelompok ternak yang bermasalah harus diambil dan kemudian dibiakan di laboratorium. an perlu juga ditambahkan dalam mengidentifikasi mikroba penyebab mastitis di suatu kelompok ternak maka perlu juga dilakukan pengujian sensitivitas antibiotika untuk menentukan jenis antibiotika mana yang ampuh dan efektif dalam pengobatan mastitis nanti. Selain itu tujuan lain dari pengujian bakteriologis ini adalah untuk mengetahui ternak mana saja yang menghasilkan prognosis mastitis yang jelek, sehingga bisa diambil langkah selanjutnya pada ternak sakit tersebut. Pengujian untuk identifikasi mikroba penyebab mastitis yang cepat dan murah sangat penting sekali dilakukan. alam buku petunjuk ini terdapat metode identifikasi dan pengujian mikroba penyebab mastitis yang murah, mudah dan cepat yang bisa dilakukan oleh para praktisi. Juli 2009 JI Short-term Expert NRI kira, VM, Ph JI ounterpart rh. Yoni armawan Sugiri 1
2
ab 1 Penanganan dan Pengambilan ontoh Susu Pengambilan contoh harus dilakukan se-aseptik mungkin. Kualitas contoh sangat penting dalam prsedur diagnostic. 1. ahan dan lat Pengambilan ontoh Sterile tubes Kapasitas 5-15ml Glove Mencegah kontaminasi dari tangan Kapas steril irendam dalam alcohol 70% Ice Pendinginan contoh Rak Menyimpan contoh Teat dip esinfeksi putting setelah pemerahan Lap bersih Mengeringkan putting sebelum pemerahan Spidol marker Identifikasi sampel Syringe 5-10 ml Pengambilan sampel air atau lainnya MT paddle MT reagent 3
2. Teknik Pengambilan contoh Sangat direkomendasikan untuk mengikuti prosedur di bawah ini ketika mengambil contoh susu untuk dibiakkan di laboratorium. (1) mbil sampel susu pada pemerahan terakhir. (2) lap/ bersihkan seluruh putting menggunakan kertas tisu, dimulai dari putting yang terjauh dari pengambil sampel. (3) Gosok lubang putting menggunakan kapas beralkohol dimulai dari putting terjauh dari pengambil sampel. (4) jika sampel yang diambil adalah sampel quarter (jumlah ternak sedikit), ambil sekitar 2,5 ml setiap putting, jika mengambil sampel komposit (jumlah ternak banyak) ambil jumlah yang sama dari setiap putting dimulai dari putting yang terdekat dengan pengambil sampel. Usahakan tabung sampel dengan posisi miring 45-60 derajat dan tidak menyentuh permukaan putting atau tangan pengambil sampel. (5) celup putting dengan desinfektan setelah pengambilan sampel selesai. Sangat penting untuk menyiapkan putting yang kering dan bersih sebelum pengambilan sampel serta cara pengambilan sampel yang benar untuk mencegah terjadinya kontaminasi sampel, karena jika terjadi kontaminasi akan menyebabkan hasil yang diharapkan menjadi bias. Ikuti cara pengambilan sampel seperti yang tercantum di atas. 4
3. Penanganan dan Penyimpanan ontoh Setelah pengambilan sampel, tempatkan tabung sampel pada rak didalam coolbox yang diisi dengan es. Secepat mungkin kirim sampel ke lab dalam suhu 5. 5
ab 2 ahan dan lat iagnostik 1. Pendahuluan dan Informasi Umum Peralatan yang dibutuhkan untuk identifikasi dan diferensiasi kuman penyebab mastitis tergantung pada kebutuhan dan tingkatan/ kemampuan pengujian yang akan dilakukan. Peralatan yang canggih/ kompleks tidak diperlukan untuk pengujian rutin mastitis pada sapi perah. Namun sekarang sudah banyak media-media diagnostic yang khusus untuk identifikasi kuman penyebab mastitis. Staphylococci, Streptococci, O dan dapat tubuh pada 5% sheep blood agar. 2. Peralatan yang diperlukan: (1) incubator (37 ), Refrigerator, Microscope, utoclave (2) Peralatan lain yang dibutuhkan (optional): Ose (10 dan 1 micro litter), otton swab, tabung untuk coagulase test, Microscope slides, Spreader (batang penyebar), pinset, unsen burner (lcohol bunsen), MT paddle, gelas eaker, Pipette, sterilized tips, Syringe dengan jarum 18G, kaca pembesar (3) Media agar: 5% sheep blood agar, Muller-Hinton agar (4) Reagent: MT reagent, Rabbit plasma, Esculin discs#, ntibiotic sensitivity discs, quadest sterile, ethanol murni/ alcohol 96%, alcohol 70% (5) Others: iakan S. aureus dengan beta hemolysin dan Strep. galactiae (untuk MP test) # Prosedur pembuatan esculin discs 1. Sterilisasi cakram kertas (diameter 6mm) yang dibungkus dengan alumunium foil (1 bungkus 50 cakram) menggunakan autoclave (121, 15 menit) (1) 2. Menyiapkan larutan Pepton (100 ml) : aquadest 100 ml+ Pepton 1 gr + Garam 0,5 gr.. (2) 3. (2) + esculine 0,1 gr + Ferric itrate 0,05 gr kemudian larutkan dengan cara dididihkan.. (3) 4. Sterilsasi (3) dengan autoclave (121, 15 menit) (4) 5. Simpan (1) dalam petri dish steril 6
6. Tuangkan (4) ke (5) dan sisa laturan dibuang. 7. Keringkan menggunakan sterilisasi panas (55 selama 2 hari) (6) 8. Setelah kering kemudian disimpan dalam lemari pendingin. 3. Lembar Kerja / Format isian da tiga jenis lembar kerja (contoh kuartir, contoh komposist, dan contoh bulk tank). 7
8 :LF :LR :RF :RR No. No. MP Esc. No. oag. S NS SG OS O OTH P X E K T Z ulture: / / Work Sheet for the Identification of Mastitis ausative Pathogens (Quarter milk samples) ow I ntibiotic Sensitivity Remark Owner: Strep. Staph. Mastitis ausative Pathogen Q
Work Sheet for the Identification of Mastitis ausative Pathogens (omposite milk samples) Owner: ulture: / / / No. No. Farm Strep. Staph. Mastitis ausative Pathogen ntibiotic Sensitivity Remark No. MP Esc. No. oag. S NS SG OS O OTH P X E K T Z 9
Work Sheet for the Identification of Mastitis ausative Pathogens (ulk milk samples) ulture: / / / No. No. Farm Rank Strep. Staph. Mastitis ausative Pathogen ntibiotic Sensitivity No. MP Esc. No. oag. S NS SG OS O OTH P X E K T Z 10
ab 3 Prosedur Pengujian 1. Pewarnaan Gram uat/ siapkan preparat ulas yang sudah dikeringkan: (1) uat preparat ulas dari biakan murni dengan cara mencampur biakan dengan 2-3 mata ose aquades steril. (2) Tandai preparat ulas dengan pensil. (3) Kering udarakan dan kemudian difiksasi dengan cara melewatkan pada api. Prosedur: (1) Teteskan crystal violet pada preparat ulas selama 60 detik. (2) uci dengan air mengalir (3) Teteskan Gram s iodine dua kali selama 60 detik. Keringkan jangan dicuci. (4) Lakukan proses pemucatan 95% alcohol sampai warna menjadi pucat. (5) bilas dengan air mengalir. (6) Teteskan larutan safranin (fuchsin) dan diamkan selama 30 detik. (7) ilas dengan air mengalir. (8) Keringkan dengan kertas saring kemudian amati di bawah mikroskop. 11
ONTOH TEMUN MIKROSKOPIK KTERI SUSU Gram positive cocci (Staphylococci) Sama seperti gambaran histologis paru-paru atau kelenjar ambing Gram positive cocci (Streptococci) occi atau ovoid Gram negative batang (Escherichia coli) atang pendek Gram positive batang (orynebacterium bovis) erbentuk club 12
2. atalase test Prosedur: (1) Satu tetes larutan 3% hydrogen peroxide (Oxydol) pada microscope slide. (2) ambil satu koloni kuman dengan larutan hydrogen peroxide tersebut. Positive Negative Interpretasi: + Staphylococci, - Streptococci +: terbentuk gelembung gas - : tidak ada reaksi Perhatian: Sel darah merah menghasilkan katalase. Hindari mengambil agar darah dengan koloni kuman, karena akan memberikan reaksi positif palsu. 13
3. KOH test Metode yang sederhana dan efektif untuk melanjutkan proses pewarnaan Gram adalah Uji KOH. ahan yang digunakan hanya KOH 3% dan biasanya hasilnya sangat berhubungan erat sekali dengan hasil pewarnaan Gram. KOH 3% dalam jumlah yang sedikit diteteskan pada slide glass. Satu mata ose koloni kuman dicampurkan dengan larutan KOH tersebut. Jika menghasilkan larutan yang kental dalam waktu 5 30 detik, dan jika ose diangkat menghasilkan seperti benang maka bakteri yang diperiksa adalah oliform. Jika tidak maka adalah bakteri gram positif. Positive Negative + Gram Negative (O) - Gram Positive (Staphylococci) +: campuran menjadi kental dan seperti gel - : campuran tetap cair 14
4. MP-Esculin test Untuk identifikasi Streptococus, lakukan uji MP pada seluruh koloni yang diduga koloni Strep. S. ureus yang beta hemolysis di goreskan pada bagian tengah plate agar darah domba 5%. Satu atau dua koloni dari suspek strep di goreskan tegak lurus terhadap gorean S tadi dengan jarak 5 mm dari tengah ke pinggir., sebagai control positif maka lakukan goresan SG murni pada agar tersebut dengan cara yang sama dengan suspek. Jika hasil uji MP positif, lanjutkan uji eskulin pada koloni yang positif dengan cara menempelkan cakram eskulin pada koloni tadi (tengah-tengah goresan). 30 menit kemudian diamati hasilnya. Jika warna cakram berubah dari putih menjadi coklat atau hitam berarti ujinya positif. Jika MP positif dan eskulin negative maka koloni suspek adalah koloni Strep. galactiae. MP positive Esculin positive MP Esculin hydrolysis Species + + OS + - SG - + OS - - OS MP+: bentuk mata panah dengan hemolisis komplit pada daerah hemolisis beta S MP- : tidak ada reaksi Esculin hydrolysis+: berubah warna dari putih jadi coklat/hitam Esculin hydrolysis-: tidak ada reaksi (putih) 15
5. oagulase test Uji Koagulase untuk membedakan antara S dengan NS (koagulase negative Staph) prosedur: Inokulasi 0.5 ml coagulase rabbit plasma dengan inokulum Staphylococci dari plate biakan kuman. Inkubasikan 37 selama 1-2 hari. Hasil: Hasil positif (terjadi koagulase) dapat terlihat dalam 2-4 jam atau sampai dengan 24 jam. Negative Positive + S - NS oagulase+: terjadi koagulasi oagulase-: tetap cair setelah 24 jam 16
hapter 4 Prosedur iagnosa 1. Inokulasi ontoh Susu (1) Penyebaran Inokulum Sampel susu kuartir : satu plate agar darah 5% untuk satu sapi Teteskan 0,01 ml susu dengan menggunakan ose, kemudian susu digoreskan di tiap kuadran plate agar darah 5% Sampel susu komposit : satu plate agar darah 5% untuk dua sapi. Teteskan 0,05 ml dengan pipet steril dan kemudian disebarkan menggunakan batang penyebar ke setengah permukaan agar dengan perbandingan yang sama. Quarter Milk Sample ow I omposite Milk Sample ow I ow I :LF, :LR, :RF, :RR ontoh susu Kuartir ontoh susu komposit 17
(2) Inkubasi iakan Suhu yang digunakan untuk inkubasi biakan adalah 37. iakan diamati setelah 20 jam untuk koloni Streptokokki, Staphylokokki, Koliform dan kemudian diinkubasikan lagi selama 24 jam untuk mendeteksi adanya orynebacterium bovis. Mikroorganisme Staphylococci Streptococci oliforms orynebacterium bovis Masa Inkubasi 20 jam 1.5 hari 18
2. Prinsip-Prinsip anyak bakteri penyebab mastitis bisa diisolasi dari lingkungan sekitar sapi. akteri bakteri tersebut jika jumlah koloniyang tumbuh di atas 5 koloni dengan ukuran dan warna yang sama, hasil diagnosanya signifikan. Pada kasus Staphylococcus aureus, jika hanya satu koloni yang tumbuh ini merupakan hasil yang signifikan. Infeksi campuran biasanya jarang terjadi (di bawah 5%). Jika hasil dari pembiakan sering ditemukan dua atau lebih jenis bakteri dari sampel susu kuartir, mungkin hal ini disebabkan adanya kontaminasi atau cara pengambilan sampel yang salah (tidak hygiene). Setelah 20 jam amati hasil dari pembiakan. Pada waktu itu, hampir semua bakteri yang terdeteksi adalam gram positif kokus. Jadi sangat penting untuk dilakukan klasifikasi antara Staphylokoki dengan Streptokoki berdasarkan ukuran dan bentuk koloni. Kolofirm (O) jarang terdeteksi pada saat ini. Jika O menginvasi alveoli, akan berkembang dengan cepat dan menghasilkan gejala klinis. tidak biai terdeteksi dalam 20 jam pembiakan. Untuk mendeteksi diperlukan waktu inkubasi di atas 36 jam. 3. Sampel Yang Terkontaminasi ontoh susu yang tidak terkontaminasi dari sapi yang sehat, ambing yang sehat biasanya tidak mengandung bakteri. Pada saat ditemukan jenis bakteri lebih dari tiga yang berasal dari susu kuartir, hal ini kemungkinan disebabkan adanya kontaminasi dan contoh tidak bisa diuji karena terkontaminasi. 19
5 Proses Identifikasi agen Penyebab Mastitis Sub Klinis 1. Proses Identifikasi Gambar di bawah ini sangat bermanfaat dalam mengidentifikasi agen penyebab mastitis subklinis, dengan menggunakan bahan sederhana, cepat dan murah. Hal yang paling dasar dalam identifikasi agen penyebab mastitis subklinis adalah karakteristik koloni (ukuran, warna, pola hemolisis). Karakteristik Koloni Species Warna Warna Staphylococci Kecil- sedang Putih atau kuning Streptococci kecil Tidak berwarna (basah, cembung, tembus pandang) atalase Test + Staphylococci ー Streptococci KOH Test + O ー NS Jika tidak bisa membedakan antara Staphylokokus dengan Streptokokus berdasarkan koloni, maka dilanjutkan pengujian Katalase (pengujiannya sangat mudah) dan selanjutnya untuk membedakan antara Koliform dengan Staphylokoki dengan menggunakan uji KOH. 20