BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan Bahan uji : Ekstrak air umbi bawang putih (Allium sativum L.), ekstrak etanol rimpang kunyit (Curcuma domestica Val.), ekstrak etanol rimpang jahe merah (Zingiber officinale Rosc. var. sunti Val.), ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L). Bahan-bahan lain: etanol 95 %, amil alkohol, serbuk magnesium, kloroform, pereaksi Dragendroff, pereaksi Mayer, besi (III) klorida, natrium hidroksida 1 N, eter, pereaksi Liebermann- Burchard, amoniak, toluena, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam klorida 2 N, gelatin, pereaksi Steasny, asam sulfat pekat, isopropanol, asam asetat glasial, etil asetat, n- heksan, natrium karboksimetilselulosa, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol, basa tris, kalium klorida, asam klorida 0,1 N, asam 2-tiobarbiturat (TBA), natrium lauril sulfat. 3.2 Alat Alat penetapan kadar air, alat refluks, lampu Ultraviolet (Desaga Sarstedt-Guppe), pelat silica gel GF 254, alat timbang mencit, jarum oral, alat bedah, tangas air, tabung reaksi, alat sentrifuga suhu dingin (GS-15R Centrifuge Beckmann), mikropipet, inkubator suhu, tabung sentrifuga, alat sentrifuga biasa, alat vortex, spektrofotometer UV-Vis (Hewlett- Packard AP 8452), kuvet. 3.3 Hewan Uji Mencit betina Swiss Webster usia 6-8 minggu dengan bobot 20-30 g yang diperoleh dari Laboratorium Hewan Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung. 3.4 Pengumpulan Bahan Uji Ekstrak air bawang putih diperoleh dari industri obat herbal Finzelberg, sedangkan ekstrak etanol kunyit diperoleh dari PT. Phytochemindo Reksa. Simplisia rimpang jahe merah diperoleh dari Kebun Percobaan Manoko, Lembang pada bulan Januari 2007, setelah itu dikeringkan dalam oven bersuhu 60-70 C kemudian diserbuk. 18
19 3.5 Pembuatan Ekstrak Uji Ekstraksi jahe merah dan mengkudu dilakukan di Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung menggunakan metode refluks kemudian dipekatkan dengan menggunakan penguap vakum berputar. 3.6 Karakterisasi Ekstrak Karakterisasi ekstrak yang dilakukan meliputi penentuan susut pengeringan, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, dan pengujian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) senyawa identitas. Dilakukan pula penetapan bobot jenis khusus untuk ekstrak kental. 3.6.1 Susut Pengeringan Ekstrak ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga menjadi lapisan dengan tebal lebih kurang 5-10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak kental, ekstrak diratakan dengan bantuan batang pengaduk. Botol dimasukkan ke dalam ruang pengering dengan tutup dibuka, lalu dikeringkan pada suhu 105 ºC hingga bobot tetap. Setiap sebelum pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin sebelum eksikator dalam suhu kamar. 3.6.2 Penetapan Kadar Air Sejumlah ekstrak yang diperkirakan mengandung 2-4 ml air ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu kering. Jika ekstrak berupa ekstrak kental, ekstrak ditimbang dalam sehelai lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher labu. Tabung penerima pendingin dibersihkan dengan asam, dibilas dengan air, lalu dikeringkan. Ke dalam labu kering dituangkan 200 ml toluena dan 2 ml air, disuling selama 2 jam, didinginkan selama 30 menit, kemudian volume dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Hasil yang diperoleh disebut sebagai volume destilat pertama. Ekstrak dan batu didih dimasukkan ke dalam labu destilasi kemudian dipanaskan perlahan hingga mendidih. Kecepatan penyulingan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, setelah sebagian besar air tersuling, kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik.
20 Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluena. Tabung penerima dibiarkan mendingin hingga suhu kamar. Lapisan air dan toluena dibiarkan memisah, kemudian dibaca volume airnya. Volume yang terbaca disebut sebagai volume destilat kedua. Kadar air dinyatakan dalam persen dengan persamaan : 100 Kadar air (%) = ( n n) W menyatakan berat ekstrak (g), n 1 sebagai volume destilat kedua atau volume total air dan n sebagai volume destilat pertama atau volume air setelah penyulingan pertama (Ditjen POM, 1978). W 1 3.6.3 Penetapan Kadar Abu Total Sebanyak 2 gram ekstrak ditimbang dan dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, lalu diratakan. Krus yang telah berisi ekstrak dipijarkan perlahanlahan hingga arang habis, lalu didinginkan. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1978). 3.6.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 ml air kloroform (larutan 2,5 ml kloroform P dengan air hingga 100 ml) selama 24 jam menggunakan labu bersumbat sambil berkalikali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi disaring lalu 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Kadar sari larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1978). 3.6.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 ml etanol 95 % selama 24 jam menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi disaring cepat dan dihindarkan dari penguapan etanol. Filtrat sebanyak 20 ml diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Kadar sari larut etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1978).
21 3.6.6 Pengujian Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Identitas Pola kromatogram dibuat dengan cara kromatografi lapis tipis (KLT) pada lempeng silika gel GF 254 dengan berbagai fase gerak sesuai dengan golongan kandungan kimia sebagai sasaran analisis. Senyawa pembanding pola kromatogram menggunakan senyawa identitas alliin untuk ekstrak air umbi bawang putih (Allium sativum L.), kurkuminoid untuk ekstrak etanol rimpang kunyit (Curcuma domestica Val.), dan skopoletin untuk ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L.). Sistem KLT menggunakan pelat silica gel GF 254 dengan pengembang butanol-asam asetat glasial-air (4:3:3) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm untuk ekstrak bawang putih. Untuk ekstrak kunyit digunakan pengembang kloroform-etanol 95 %-asam asetat glasial (95:5:1) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm (Rustyawati, 1991). Untuk ekstrak jahe merah digunakan pengembang toluena-etil asetat (93:7) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm. Untuk ekstrak mengkudu digunakan pengembang n-heksan-etil asetat (6:4) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 366 nm. 3.7 Pemeriksaan Kandungan Kimia Ekstrak Pemeriksaan kandungan kimia ekstrak meliputi pemeriksaan terhadap golongan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon dan steroid/triterpenoid. 3.7.1 Pemeriksaan Alkaloid Sebanyak 2 g ekstrak dilembabkan dengan 5 ml amonia 25 %, digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan 20 ml kloroform dan digerus kuat-kuat. Campuran disaring lalu filtrat diteteskan pada kertas saring kemudian ditetesi pereaksi Dragendorff. Reaksi positif jika terbentuk warna merah/jingga. Filtrat yang sama diekstraksi dua kali dengan larutan asam klorida 10 %, dimasukkan ke dalam dua tabung masing-masing 5 ml dan diuji dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff. 3.7.2 PemeriksaanFlavonoid Sebanyak 5 ml filtrat air dalam tabung reaksi ditambahkan serbuk magnesium, 2 ml campuran etanol-asam klorida pekat (1:1) dan 3 ml amil alkohol. Tabung dikocok kuat dan
22 dibiarkan memisah. Jika terbentuk warna merah, jingga, atau kuning pada lapisan amil alkohol, berarti filtrat mengandung senyawa flavonoid. 3.7.3 Pemeriksaan Saponin Sebanyak 10 ml filtrat air dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikocok vertikal selama 10 detik. Jika busa yang terbentuk di tabung stabil selama tidak kurang dari 10 menit dengan tinggi 1-10 cm dan busa tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N pengujian menunjukkan adanya saponin. 3.7.4 Pemeriksaan Tanin Sebanyak 10 g ekstrak dicampur dengan 100 ml air panas, kemudian dididihkan selama 15 menit. Campuran tersebut setelah dingin kemudian disaring dan filtrat air dibagi menjadi tiga bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya golongan senyawa tanin. Ke dalam filtrat kedua ditambahkan larutan gelatin 1 %. Terbentuk endapan menunjukkan adanya senyawa tanin. Ke dalam filtrat ketiga ditambahkan 15 ml pereaksi Steasny dan dipanaskan dalam penangas air suhu 90 C. Terbentuknya endapan warna merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Kemudian endapan dipisahkan dan filtrat dijenuhkan dengan natrium asetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan besi (III) klorida 1 %. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat. 3.7.5 Pemeriksaan Kuinon Sebanyak 5 ml filtrat air ditambahkan dengan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya golongan senyawa kuinon. 3.7.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam. Hasil maserasi disaring dan diambil filtratnya. Sebanyak 5 ml filtrat diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu. Residu tersebut ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah-ungu menunjukkan adanya golongan senyawa triterpenoid dan warna biru-hijau menunjukkan adanya golongan senyawa steroid.
23 3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan Pengujian aktivitas antioksidan yang dilakukan meliputi uji peredaman radikal bebas DPPH, uji peredaman peroksidasi lipid secara in vitro, dan uji peredaman peroksidasi lipid secara ex vivo. 3.8.1 Uji Peredaman radikal bebas DPPH Ekstrak atau pembanding dilarutkan dalam air suling atau metanol sehingga diperoleh konsentrasi 2, 25, 50, 100, 200 dan 500 μg/ml untuk melihat kisaran konsentrasi yang diperlukan agar serapan DPPH dapat terukur dengan baik. Konsentrasi ekstrak dipersempit sedemikian rupa agar diperoleh serapan untuk mendapat nilai EC 50 yang lebih akurat. Larutan pereaksi DPPH dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol yang telah didestilasi dengan konsentrasi 40 μg/ml, dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya. Sebanyak 1,5 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 3,0 ml larutan DPPH dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit, kemudian diukur serapannya pada λ max 516 nm. Sebagai kontrol digunakan 1,5 ml metanol yang direaksikan dengan 3,0 ml larutan pereaksi DPPH. Persen peredaman radikal bebas dihitung dengan rumus: % peredaman = (A kontrol - A uji ) A kontrol x 100 % 3.8.2 Uji Peredaman Peroksidasi Lipid secara in vitro Ekstrak atau pembanding dilarutkan dalam suspensi natrium karboksimetilselulosa 0,5% sehingga diperoleh konsentrasi 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 μg/ml. Sebanyak 1 g hati mencit betina dihomogenasi dalam 10 ml dapar tris-kalium klorida 150 mm:50 mm ph 7,2 yang dijaga pada suhu dingin kemudian disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 ºC selama 10 menit. Sebanyak 0,2 ml supernatan homogenat diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 jam, lalu ditambahkan 2 ml asam klorida 0,1 N, 0,1 ml natrium lauril sulfat 10 % b/v dan diaduk dengan vortex selama 2 menit. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan 2 ml asam 2-tiobarbiturat 0,5 % b/v dan setelah diaduk dengan vorteks selama 30 detik, dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air suhu 95 ºC, kemudian didinginkan dengan air es. Sampel disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, kemudian serapan supernatan diukur pada λ max 532 nm. Semakin banyak TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substance), yaitu hasil reaksi malondialdehid dengan asam
24 2-tiobarbiturat yang terbentuk maka serapan akan semakin besar dan ekstrak yang memiliki efek antioksidan paling tinggi akan memberikan serapan yang paling rendah. Persen peredaman peroksidasi lipid dihitung dengan rumus seperti pada pengujian peredaman DPPH. Dari hasil percobaan ditentukan EC 50, yaitu konsentrasi efektif larutan uji yang mampu meredam 50 % radikal bebas peroksidasi lipid. (Yang, 1991; Navarro, 1993). 3.8.3 Uji Peredaman Peroksidasi Lipid secara ex vivo Mencit dikelompokkan menjadi tiga kelompok yaitu kelompok uji, kelompok kontrol dan kelompok pembanding. Ekstrak uji dan pembanding diberikan secara oral satu kali sehari selama 7 hari berturut-turut. Pada hari ke-8 mencit dikorbankan untuk diambil hatinya. Prosedur selanjutnya sama seperti pada uji peroksidasi lipid in vitro. Sebanyak 1 g hati mencit betina dihomogenasi dalam 10 ml dapar tris-kalium klorida 150 mm:50 mm ph 7,2 yang dijaga pada suhu dingin kemudian disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 ºC selama 10 menit. Sebanyak 0,2 ml supernatan homogenat diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 jam, lalu ditambahkan 2 ml asam klorida 0,1 N, 0,1 ml natrium lauril sulfat 10 % b/v dan diaduk dengan vortex selama 2 menit. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan 2 ml asam 2-tiobarbiturat 0,5 % b/v dan setelah diaduk dengan vorteks selama 30 detik, dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air suhu 95 ºC, kemudian didinginkan dengan air es. Sampel disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit, kemudian serapan supernatan diukur pada λ max 532 nm. Persen peredaman peroksidasi lipid dihitung dengan rumus seperti pada pengujian peredaman DPPH. Data kelompok uji dibandingkan menggunakan uji statistik ANOVA.