21 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini yaitu eksperimental. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimen, karena perlakuan terhadap objek dilakukan di bawah kondisi buatan (Nazir, 2005 : 63). B. Desain Penelitian Penelitian dilakukan dalam dua tahap yaitu tahap skala laboratorium dan tahap skala pilot. Tahap skala laboratorium dibagi menjadi dua yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Tahap penelitian pendahuluan meliputi tahap persiapan, kulit buah kakao dipotong, dikeringkan, dan digiling hingga berbentuk bubuk (Gambar 3.1). Pembuatan larutan H 2 SO 4 encer, pembuatan kurva standar alkohol, pembuatan kurva standar glukosa, serta pengujian kadar gula pereduksi tertinggi hasil hidrolisis kulit buah kakao menggunakan konsentrasi H 2 SO 4 0,5%, 1%, 1,5%, dan 2% (Balat et al., 2008). Kadar gula pereduksi dalam sampel diukur dengan metode Somogyi-Nelson untuk mengetahui konsentrasi yang paling optimal menghasilkan gula pereduksi tertinggi. Tahap penelitian utama meliputi tahap hidrolisis dan fermentasi. Tahap hidrolisis yaitu perendaman dan pemanasan kulit buah kakao dalam larutan H 2 SO 4 yang optimal menghasilkan gula pereduksi tertinggi pada penelitian pendahuluan. 21
22 Tahap fermentasi yakni fermentasi hidrolisat dari kulit buah kakao menggunakan variasi konsentrasi inokulum S. cerevisiae dan lama fermentasi. Gambar 3.1 Bubuk Kulit Buah Kakao (Sumber : Dokumentasi Pribadi) Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). RAL merupakan rancangan eksperimen yang perlakuannya diacak secara lengkap pada materi percobaan sehinga setiap unit eksperimen memiliki peluang yang sama untuk memperoleh setiap perlakuan. Karakterisik RAL yaitu unit eksperimen atau satuan percobaannya dan faktor lingkungannya homogen (Nazir, 2005). Banyaknya pengulangan untuk setiap perlakuan diperoleh dari rumus pengulangan RAL, yaitu t(r-1) 20, dimana t adalah perlakuan (treatment) dan r adalah pengulangan (replikasi) (Gomez dan Gomez, 1995). t (r-1) 20 5 (r-1) 20 5r-5 20 5r 25 r 5
23 Berdasarkan perhitungan di atas, maka diperoleh pengulangan sebanyak lima kali pada tiap perlakuan. Variasi inokulum S. cerevisiae yang digunakan adalah 0%, 1%, 3%, 5%, dan 7% (v/v) (Buckle et al., 2007). Lama waktu fermentasi ditentukan berdasarkan lama waktu fermentasi yang digunakan pada proses pembuatan bioetanol dari sari sampah yaitu selama enam hari hari. Pengujian parameter ph, kadar glukosa, dan kadar alkohol dilakukan setiap dua hari sekali (Kusnadi et al., 2009). Kadar alkohol pada sampel ditentukan dengan cara titrasi asam basa. Untuk mengetahui kadar alkohol pada sampel dengan membuat kurva standar alkohol yang terlebih dahulu yang menyatakan hubungan antara kebutuhan NaOH sebagai sumbu x dan kadar alkohol sebagai sumbu y. Prosedur titrasi akan dilakukan mengikuti Hidayat (1995: 44). C. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah semua kulit kakao yang berasal dari PT Perkebunan Nusantara VIII, Jalan Raya Raja Mandala, Kecamatan Cipatat, Bandung Barat. Sampel yang digunakan adalah kulit buah kakao yang digunakan dalam proses fermentasi. D. Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Mikrobilogi Universitas Pendidikan Indonesia Jl. Dr Setiabudhi No. 229 pada bulan Maret-Mei 2011.
24 E. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pada Tabel 3.1 dan Tabel 3.2 berikut : Tabel 3.1 Alat - Alat Penelitian No Alat alat Spesifikasi Jumlah 1. Alat destilasi - 1 unit 2. Alkoholmeter - 1 buah 3. Autoclave EYELA model HL36AE 1 unit 4. Kertas saring Whatman 1 unit 5. Botol fermentasi - 60 buah 6. Botol penampung bioetanol Pyrex 4 unit 7. Laminar Shimadzu 2 buah 8. Buret dan Statif - 1 buah 9. Ember - 5 buah 10. Gelas Beaker Pyrex 5 buah 11. Hotplate Eyela magnetic stirrer RCH 3 1 unit 12. Inkubator - 1buah 13. Kain penyaring - 5 buah 14. Kamera digital Sony 1 unit 15. Kompor gas Rinai 1 unit 16. Lemari es National 1 buah 17. Makropipet 2 ml dan 5 ml Eppendorf 1 unit 18. Panci Penangas - 2 buah 19. Pipet tetes dan volum - 6 buah 20. Pisau - 1 buah 21. Shaker EYELA model multi shaker 1 unit MMS 22. Spektrofotometer Milton Rey Spectronic 20 D 1 buah 23. Termometer - 2 buah 24. Timbangan Analitik AND HF-300 1 buah 25. Water bath Eyela Unithermo Shaker NTS-130 1 unit
25 Tabel 3.2 Bahan - Bahan Penelitian No Bahan bahan Spesifikasi Jumlah 1. Alkohol absolut p.a 100 ml 2. Anhidrat asetat p.a 200 ml 3. Aquades. Medilabs 10L 4. Gula pasir Gulaku 250 gram 5. Inokulum Saccharomyces Kultur murni 5 tabung reaksi cerevisiae 6. Medium PDA p.a 200ml 7. Medium PDB - 200ml 8. NaOH 1 M p.a 3 liter 9 ph Indikator - 1 pak 10. Phenolfltalein p.a 50 ml 11. Reagent Somogyi-Nellson p.a 2 liter 12. Asam sulfat - 30 ml 13. Bubuk kulit buah kakao - - F. Prosedur Penelitian Penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahapan : 1. Tahap Skala Laboratorium a. Tahap Penelitian Pendahulan 1) Persiapan Alat dan Bahan Alat-alat berupa botol fermentasi, erlenmeyer, gelas ukur, tabung reaksi dan lain lain, dibersihkan dengan cara merendam botol-botol tersebut dengan detergen dan bilas, lalu botol-botol tersebut direndam dengan larutan desinfektan berupa bayclin selama 30 menit dan dibilas lagi dengan air mengalir, dan dikeringkan.
26 2) Pembuatan Larutan H 2 SO 4 Konsentrasi H 2 SO 4 yang digunakan dalam hidrolisis adalah 0,5%, 1%, 1,5%, dan 2% (Balat et al., 2008). Larutan H 2 SO 4 0,5%, dibuat dengan cara melarutkan 5 ml H 2 SO 4 pekat dalam akuades hingga volume mencapai 1L. Langkah yang sama juga dilakukan dalam pembuatan larutan H 2 SO 4 1%, 1,5%, dan 2%. 3) Pembuatan Kurva Standar Alkohol a) Pembuatan Larutan Blanko Satu ml akuades dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian dimasukkan 1 ml asam anhidrida asetat dan 2 tetes phenolftalein. Selanjutnya NaOH 1 M dari buret diteteskan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer tersebut sambil digoyanggoyangkan sampai warnanya berubah, dari tidak berwarna menjadi warna merah muda. Kemudian dicatat kedudukan skala pada buret (Hidayat, 1995). b) Pengujian Larutan Alkohol Standar Sebanyak 1 ml larutan alkohol standar (20-200%) dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan 1 ml asam anhidrida asetat dan 2 tetes phenolftalein, setelah itu ditambahkan NaOH 1 M sambil digoyang-goyangkan sampai terjadi perubahan warna, dari tidak berwarna menjadi warna merah muda. Kemudian dicatat kedudukan skala pada buret (Hidayat, 1995)..
27 4) Pembuatan Kurva Standar Glukosa Sebelum dilakukan analisis kadar gula pereduksi pada sampel, maka terlebih dahulu dibuat kurva baku glukosa. Kurva baku glukosa menyatakan hubungan antara konsentrasi glukosa dengan optical density (OD) pada panjang gelombang 520 nm. Kurva ini dibuat untuk menentukan suatu persamaan dari konsentrasi larutan glukosa dengan pengukuran transmisi cahaya menggunakan spektrofotometer dengan metode Somogyi-Nelson (Somogyi, 1952). Pembuatan kurva baku glukosa dimulai dengan menimbang glukosa murni sebanyak 200 mg dan dilarutkan dalam 1000 ml akuades dan dikocok sampai homogen. Langkah selanjutnya yaitu larutan tersebut diambil menggunakan mikropipet dan dimasukan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1.0 ml; 1,2 ml; 1,4 ml; 1,6 ml; 1,8 ml dan 2,0 ml. Selanjutnya ditambahkan aquades masing-masing sebanyak 1,8 ml; 1,6 ml; 1,4 ml; 1,2 ml; 1.0 ml; 0,8 ml; 0,6 ml; 0,4 ml; 0,2 ml; dan 0 ml sehingga volume masing-masing tabung 2 ml. Sehingga pada masing-masing tabung diperoleh konsentrasi glukosa 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200 µg/ml. Tahap selanjutnya yaitu ke dalam masing-masing tabung ditambahkan sebanyak 1,6 ml larutan Somogyi I dan 0,4 ml Somogyi II. Kemudian tabungtabung tersebut ditutup dengan kelereng dan dikocok hingga homogen. selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air mendidih selama 10 menit, lalu diangkat dan didinginkan dalam penangas es yang memiliki suhu ± 20ºC. Kemudian ditambahkan 2 ml larutan Nelson dan 4 ml akuades, maka volume total adalah 10 ml. Tabung reaksi ditutup dengan ibu jari dan kocok dengan baik dan
28 kuat, hingga gas CO 2 tidak keluar lagi. Masing-masing larutan diukur optical density (OD) dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Nilai absorbansi dari kadar glukosa standar dibuat grafik linier. Dari kurva baku glukosa dapat diperoleh persamaan yang akan digunakan dalam penentuan kadar gula pereduksi dari sampel (Somogyi, 1952 ; Nelson, 1944). 5) Penentuan Konsentrasi H 2 SO 4 yang Optimum Bahan berupa bubuk kulit buah kakao sebanyak 200 gram dan larutan H 2 SO 4 masing-masing 500 ml pada konsentasi 0,5%, 1%, 1,5%, dan 2%. Bubuk kulit buah kakao direndam dalam H 2 SO 4 pada perbandingan 1:10 (b/v) selama 15 jam (Fanaei et al., 2008). Sebanyak 50 gram sampel direndam menggunakan 500 ml larutan H 2 SO 4 dalam glas beaker, ditutup rapat dan dididihkan selama 120 menit menggunakan hot plate. Hidrolisat disaring dan dimasukkan ke dalam botol yang telah disiapkan dan diberi label. Pengujian kadar gula pereduksi dilakukan sebanyak lima kali pengulangan. Untuk mendapatkan konsentrasi yang tepat, data yang diperoleh diolah dengan uji One Way Anova untuk melihat pengaruh signifikan dari perlakuan dan dilanjutkan dengan uji Tukey untuk mengetahui konsentrasi yang menghasilkan gula pereduksi paling tinggi.
29 b. Tahap Penelitian Utama 1) Persiapan Bahan Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah bubuk kulit buah kakao. Sebelum perlakuan terlebih dahulu kulit buah kakao dikeringkan di bawah sinar matahari, hingga diperoleh berat kering yang konstan dan sebanyak 2 kg digiling hingga berbentuk bubuk. 2) Hidrolisis Kulit Buah Kakao Sebanyak 600 gram bubuk kulit buah kakao direndam dalam 6 L H 2 SO 4 yang optimal dari penelitian pendahuluan selama 15 jam dan dipanaskan hingga mendidih selama 120 menit. Hidrosilat disaring dan diatur ph hingga ph 5 menggunakan NaOH 1 M. Hidrolisat dimasukkan ke dalam 25 botol fermentor yang berukuran 100 ml. Sterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 15 lbs, suhu 121 0 C selama 15 menit. 3) Persiapan Inokulum Saccharomyces cerevisiae Terdapat dua macam media yang digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara S. cerevisiae yaitu medium Potatoes Dextrose Agar (PDA) dan medium kultur Potatoes Dextrose Borth (PDB). Subkultur S. Cerevisiae dilakukan dalam medium PDA, sedangkan medium aktivasi dilakukan dalam medium PDB. S. cerevisiae yang akan digunakan dalam penelitian ditumbuhkan dalam medium agar miring. Medium agar miring yang digunakan adalah medium PDA
30 (Potatoes Dextrose Agar) dibuat dengan cara sebagai berikut: sebanyak 3,9 gram PDA instan dilarutkan dalam 100 ml akuades dan didihkan. Lalu masukan ke dalam tabung reaksi masing-masing 5-7 ml kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 15 lbs, suhu 121 C selama 15 menit dan dinginkan dalam keadaan miring. Sebelum dimasukkan ke dalam medium fermentasi, inokulum S. cerevisiae diaktivasi terlebih dahulu. Medium aktivasi yang digunakan adalah medium PDB (Potatoes Dextrose Broth). Medium PDB dibuat dengan cara sebagai berikut: 200 gram kentang dididihkan dalam akuades 1 L hingga volumenya tinggal 1/2 atau 2/3, lalu disaring dengan menggunakan kertas saring. Setelah disaring ditambahkan dextrose sebanyak 2 gram. Masukan kedalam tabung erlenmeyer kemudian ditutup dengan sumbat. Sterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 15 lbs, suhu 121 0 C selama 15 menit. Pembuatan kurva tumbuh S. cerevisiae dilakukan dengan menghitung jumlah sel dari biakan cair (medium PDB) menggunakan haemocytometer. Jumlah sel dihitung setiap 2 jam selama 10 jam pada pengenceran 10-1 Pertambahan jumlah sel ditentukan dengan menghitung absorbansi setiap 2 jam selama 14 jam pada panjang gelombang 625 nm (Hatmanti, 2000). 4) Aktivasi Saccharomyces cerevisiae a) Aktivasi I Persiapan alat dan bahan (alkohol, bunsen, medium PDB 10 ml, jarum ose), semua bahan disimpan di dalam laminar dan dipaparkan sinar UV selama 15
31 menit. Sebanyak 1 ose kultur murni S. cerevisiae diinokulasikan ke dalam medium PDB 10 ml. Medium yang telah diinokulasikan ditutup rapat dengan sumbat dan plastic wrap kemudian diinkubasikan di atas shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. b) Aktivasi II Setelah diinkubasi selama 24 jam (aktivasi I) medium PDB yang berisi S. cerevisiae dipindahkan ke dalam medium aktivasi ke-ii (PDB 90 ml), Setelah dipindahkan ke medium aktivasi ke-ii, medium tersebut diinkubasi kembali selama 6 jam. 5) Proses fermentasi Sebanyak 25 buah botol fermentor, tiap 5 botol diisi hidrolisat masingmasing sebesar 90 ml, 95 ml, 92 ml, 90 ml, dan 88 ml bertutut-turut pada konsentrasi 0%, 1%, 3%, 5%, dan 7%. Isolat S. cerevisiae yang telah diaktivasi dimasukan masing-masing sebanyak 0 ml, 3 ml, 5ml, dan 7 ml. Gula starter yang digunakan untuk semua perlakuan adalah sebanyak 5 ml. Penambahan gula awal bertujuan untuk mempercepat masa adaptasi S. cerevisiae dalam medium baru (Anggara, 2010). Seluruh perlakuan menggunakan ph 5 dan suhu 28-31 0 C, kondisi tersebut sesuai dengan kondisi pertumbuhan S. cerevisiae (Hidayat et al., 2006). Fermentasi dilakukan selama 6 hari, pengujian parameter ph, kadar glukosa, dan kadar alkohol dilakukan setiap dua hari sekali (Kusnadi et al., 2009).
32 6) Pengukuran kadar Glukosa (Somogyi-Nelson) Pada pengukuran kadar glukosa, 2 ml sampel dimasukan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1,6 ml larutan Somogyi I dan 0,4 larutan Somogyi II kemudian dihomogenkan. Tabung ditutup dengan menggunakan kelereng lalu dipanaskan dalam penangas selama 10 menit. Setelah 10 menit pindahkan tabung ke dalam es, kemudian ditambahkan sebanyak 2 ml larutan Nelson dan 4 ml akuades, dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan dimasukkan dalam cuvet dan diukur kadar glukosa menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Jika larutan terlalu pekat dan tidak terbaca pada spektrofotometer, maka larutan tersebut diencerkan dengan cara mengambil 1 ml larutan kemudian ditambahkan 9 ml akuades. 7) Pengukuran kadar Alkohol Pengukuran kadar alkohol akan dilakukan setiap dua hari selama enam hari. Hasil fermentasi diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berukuran 100 ml. Kemudian ditambahkan 1 ml anhidrat asetat dan 2 tetes phenolftalein kemudian titrasi dengan NaOH 1 M dengan buret sampai terlihat perubahan warna menjadi warna merah muda. Kadar alkohol yang telah digunakan pada sampel ditentukan dengan cara memasukkan jumlah NaOH yang digunakan ke dalam persamaan yang diperoleh pada kurva standar alkohol. 8) Pengukuran ph Pengukuran ph pada hasil fermentasi dengan menggunakan ph indikator.
33 2. Tahap Perlakuan Skala Pilot a. Perlakuan Sebanyak 500 gram bubuk kulit buah kakao direndam dalam 5 L H 2 SO 4 menggunakan konsentrasi yang optimum pada penelitian pendahuluan dan penelitian utama dengan perbandingan 1:10 (b/v). Dipanaskan selama 120 menit menggunakan kompor. Hidrolisat yang diperoleh disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 15 lbs, suhu 121 0 C selama 15 menit. Hidrolisat ditambahkan gula awal sebesar 5%, dihomogenkan, dan dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer. Setelah larutan dingin, inokulum S. cerevisiae diinokulasikan berdasarkan konsentrasi inokulum dan lama fermentasi optimum dari penelitian utama (skala laboratorium). b. Destilasi Alkohol yang terbentuk dari hasil fermentasi dari pilot plan kemudian akan didestilasi dengan menggunakan destilator. c. Uji Gas Chromatograph-Mass Spectrometry (GC-MS) Uji GC-MS hasil destilasi dilakukan di laboratorium Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor. G. Analisis Data Analisis data yang digunakan untuk menentukan bahwa terdapat perbedaan dari setiap perlakuan yang diberikan, dilakukan dengan menggunakan
34 Uji Anova dua jalur (Two way ANOVA) jika data berdistribusi normal dan homogen. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan software SPSS 16.0 for windows. Untuk olah data perlakuan terdiri dari faktor lama fermentasi dan konsentrasi inokulum S. cerevisiae (0%, 1%, 3%, 5% dan 7%). Tahap analisis statistik yang dilakukan adalah sebagai berikut : 1. Uji Normalitas dan Homogenitas. 2. Uji Anova satu jalur (One way ANOVA) untuk menentukan bahwa terdapat perbedaan jumlah gula pereduksi yang diperoleh dari hidrolisis kulit buah kakao pada berbagai konsentrasi H 2 SO 4. 3. Uji Anova dua jalur (Two way ANOVA), untuk menentukan bahwa terdapat perbedaan banyaknya kadar gula pereduksi dan kadar alkohol yang diperoleh dari faktor-faktor setiap perlakuan yang diberikan. 4. Uji lanjutan dengan menggunakan Uji Tukey, untuk menentukan faktor-faktor dari perlakuan mana saja yang menghasilkan kadar gula pereduksi dam kadar alkohol paling banyak 5. Analisis Korelasi, untuk melihat tingkat signifikansi antara kadar gula dengan kadar alkohol, ph dengan kadar alkohol, dan ph dengan kadar gula.
35 H. Alur Penelitian Gambar 3.2 Diagram Alur Penelitian