3 METODE PENELITIAN 3.1 Bahan 3.1.1 Bahan penelitian Cacing tanah P. excavatus diperoleh dari peternakan cacing milik Ir. Bambang Sudiarto. Substrat koagulan darah diambil dari darah milik S. Krisnawati di poliklinik Wyata Guna Bandung, dan darah untuk induksi cacing diperoleh dari pejagalan sapi Ciroyom. Substrat azokasein diperoleh dari Sigma, dan pereaksi Bradford diperoleh dari Bio-Rad. 3.1.2 Bahan kimia Semua bahan kimia yang digunakan memiliki derajat kemurnian proanalisis. Air yang digunakan selama penelitian adalah aquabides. Larutan bufer yang digunakan selama proses pemisahan, pemurnian, dan uji aktivitas enzim adalah bufer Tris-HCl 1 M, ph 8 dan Tris-HCl 20 mm, ph 8. Sedangkan pada proses karakterisasi digunakan bufer pada berbagai ph, yaitu bufer natrium asetat 20 mm, ph 4 5, bufer natrium fosfat 20 mm, ph 6 7, bufer Tris-HCl 20 mm, ph 9 10, dan bufer glisin- NaOH 20 mm, ph 11 12. Bahan kimia yang digunakan dalam proses induksi, pemisahan dan pemurnian adalah: Natrium oksalat (Na 2 C 2 O4), Natrium Klorida (NaCl), Natrium Azida (NaN 3 ), amonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ), dan aquabides yang telah disaring. Untuk uji kadar protein digunakan protein standar BSA (Bovine Serum Albumin), dan pereaksi Bradford. Sedangkan bahan kimia yang digunakan untuk uji aktivitas enzim adalah azokasein 2% dan asam trikloroasetat (TCA) 5%.
3.2 Alat Peralatan gelas umum yang digunakan terdiri atas: gelas ukur berbagai ukuran, labu ukur, gelas piala, pipet tetes, batang pengaduk, tabung reaksi, tabung sentrifuga, labu bundar, dan cawan petri. Peralatan laboratorium yang digunakan selama penelitian adalah: alat homogenisasi (Omni Mixer Homogenizer), sentrifuga (Beckman Ultracentrifuge), sentrifuga mikro (Biofuge fresco), alat pemurni air (Barnstead), alat pengaduk magnetik, kolom filtrasi gel Sephacryl S300HR, inkubator blok Thermolyne, Vortex (Genie), termometer, neraca analitik (Ohaus), ph meter (Orion), spektrofotometer sinar tampak (Genesys), Spektrofotometer UV (Smart SpecTM 3000), inkubator (Fisher M-503). Alat elektroforesis Bio-Rad mini protean II, power suply Bio-Rad, the Belly dancer (Stovall), pipet mikro dan tip ukuran 10 μl, 100 μl, 1000 μl, dan tabung mikro. 3.3 Metode Penelitian ini meliputi tahapan-tahapan sebagai berikut: pemeliharaan cacing tanah P. excavatus, induksi enzim menggunakan darah sapi segar, isolasi enzim, pemurnian parsial enzim, identifikasi enzim, dan karakterisasi enzim. Metode ini dapat digambarkan oleh bagan berikut: 20
Gambar 3.1 Diagram alir penelitian 21
3.3.1 Pembiakan dan induksi cacing P. Exavatus Pembiakan cacing tanah P. excavatus dilakukan dalam media kompos yang kaya akan sampah-sampah organik. Cacing diberi makanan ampas tahu dan kotoran sapi tiga hari sekali secara rutin. Pembiakan dilakukan selama sebulan, kemudian cacing diinduksi oleh darah sapi yang sudah diberi natrium oksalat agar tidak membeku. Penginduksian dilakukan dengan menyuntikan darah sapi ke dalam mulut cacing. Selain itu penginduksian dilakukan pula dengan mencampurkan darah sapi beku ke dalam makanan cacing. 3.3.2 Isolasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus Cacing tanah 350 gr yang telah diinduksi dengan darah sapi tiga hari sebelumnya, dibersihkan dari media pertumbuhan kemudian ditambahkan 50 ml aquabides saring dan dihomogenkan pada suhu 4 o C. Setelah didapatkan bubur cacing tanah yang homogen, kemudian ditambahkan berturut-turut 2 ml bufer Tris-HCl 1 M, ph 8 sebagai suasana dalam pengkondisian enzim, 15 ml NaCl 1 M sebagai penstabil enzim, dan 1 g NaN 3 sebagai antibakteri. Campuran tersebut dihomogenkan dengan menggunakan pengaduk magnetik selama 1 malam. Homogenat yang didapatkan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 g selama 30 menit. Endapan dibuang dan supernatannya disentrifugasi kembali (30.000 g) selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim fibrinolitik (Sampel 1). Sampel diambil sebanyak 2 ml untuk pengujian kadar dan aktivitas. 3.4 Pemurnian enzim 3.4.1 Fraksinasi (NH 4 ) 2 SO 4 Sampel 1 sebanyak 50 ml difraksinasi dengan menggunakan garam amonium sulfat 60% jenuh. Sebanyak 18,05 gram amonium sulfat ditambahkan ke dalam campuran dan kemudian dihomogenkan pada gelas kimia selama 1 malam pada suhu 4 o C. Hasil fraksinasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 30.000 g selama 45 menit. Endapan yang didapatkan dari sentrifugasi dipisahkan dari supernatan dengan cara dekantasi. Endapan disuspensikan kembali menggunakan larutan bufer Tris-HCl 20mM, ph 8, dengan jumlah tertentu sampai protein melarut, dan kemudian disentrifugasi (30.000 g) selama 45 menit. Sentrifugasi dilakukan dua kali dan supernatan dipisahkan. Supernatan ini kemudian dimurnikan lebih lanjut dengan menggunakan kolom filtrasi gel. 22
3.4.2 Kromatografi filtrasi gel Sampel protein hasil dari langkah sebelumnya dimurnikan kembali dengan menggunakan FPLC kolom Sephacryl S300HR. Sebelum masuk ke dalam kolom, sampel harus disaring terlebih dahulu menggunakan filter dengan ukuran pori 0,02 µm. Sampel hasil penyaringan yang berwarna bening kecoklatan menunjukkan sampel siap dimasukan dalam kolom. Kolom filtrasi gel akan memisahkan molekul beradasarkan ukurannya. Hasil pemisahan protein terlihat dalam bentuk puncak-puncak absorbansi protein pada kromatogram. Protein yang keluar tertampung dalam tabung-tabung pengumpul fraksi. Fraksi-fraksi yang menunjukkan adanya absorbansi protein diuji aktivitas proteasenya menggunakan metode azokaseinolitik. Fraksi-fraksi yang memiliki aktivitas enzim tertinggi kemudian disatukan dan disebut sebagai Sampel 2. Sampel ini diambil 2 ml untuk uji aktivitas dan penentuan kadar protein. 3.5 Uji aktivitas fibrinolitik Tahap awal dari uji ini adalah penyiapan substrat koagulan darah. Darah segar yang didapat, diinkubasi selama 5 jam dalam suhu kamar sehingga didapatkan gumpalan darah. Cairan darah yang tidak membeku dipisahkan dari koagulan darah dengan cara sentrifugasi (12.000 g) selama 10 menit. Pemisahan cairan darah yang tidak membeku dilakukan dengan cara dekantasi. Prosedur ini dilakukan berulang kali sehingga substrat koagulan darah yang terpisah dari cairannya. Uji aktivitas fibrinolitik dilakukan untuk melihat kemampuan sampel enzim dalam melarutkan koagulan darah dan dibiarkan bereaksi pada suhu kamar selama tidak lebih dari 1,5 jam (Nakajima et al., 1993). 3.6 Uji aktivitas azokaseinolitik Untuk pengujian aktivitas azokaseinolitik dari sampel enzim disiapkan beberapa pereaksi dan bahan kimia sebagai berikut: TCA 5%, azokasein 2%, dan bufer Tris-HCl 20 mm, ph 8. Enzim sebanyak 50 µl ditambah dengan 100 µl azokasein dan 550 µl larutan buffer, campuran ini kemudain diinkubasi pada suhu 55 o C dengan selang waktu reaksi tertentu. Untuk menghentikan reaksi ditambahkan 300µL TCA 5% pada akhir waktu inkubasi. Campuran larutan kemudian disentrifugasi pada suhu kamar selama 20 menit dengan kecepatan 12.000 g. Supernatan yang didapat kemudian dipisahkan dan diukur serapannya pada panjang gelombang 340 nm. Komposisi larutan blanko sama dengan komposisi larutan sampel tetapi aktivitas enzim telah dimatikan terlebih dahulu. Azokasein 2%, bufer Tris-HCl 20 mm, ph 8, dan TCA 5% 23
ditambahkan sebelum larutan enzim dimasukan ke dalam larutan. Kemudian larutan disentrifugasi dan diukur serapannya panjang gelombang 340 nm sebagai absorbansi nol. 3.7 SDS-PAGE 3.7.1 Penyiapan bahan Akrilamid-bisakrilamid (30%, 2,7%): sebanyak 29,2 gr akrilamid dan 0,8 gr bisakrilamid dilarutkan dalam H 2 O sehingga volume total larutan 100 ml. larutan kemudian disimpan dalam botol gelap dengan jangka waktu penyimpanan selama 1 bulan. Tris-HCl 1,5 M, ph 8,8: sebanyak 18,2 gr basa Tris dilarutkan ke dalam 80 ml air. Pengaturan ph dilakukan dengan penambahan HCl pekat sedikit demi sedikit disertai dengan pengadukan sampai tercapai ph 8,8 dengan volume akhir larutan 100 ml. Tris-HCl 1 M, ph 6,8 : sebanyak 6,7 gr basa Tris dilarutkan ke dalam 20 ml air. Pengaturan ph dilakukan dengan penambahan HCl pekat sedikit demi sedikit disertai dengan pengadukan sampai tercapai ph 6,8 dengan volume akhir larutan 50 ml. SDS (sodium dodecyl sulphate) 10 %: sebanyak 10 gr SDS dilarutkan dalam air sehingga volume akhir larutan 100 ml. Sediaan bufer sampel terdiri dari 1,2 ml Tris-Cl 0,5 M, ph 6,8; 2 ml SDS 10%; 1mL gliserol; 0,5 ml bromfenol biru 0,5%; dan 4,8 ml air yang dicampur disertai dengan pengadukan. Larutan disimpan dalam suhu kamar. Untuk membuat larutan bufer sampel siap pakai, 50 µl 2-merkaptoetanol dan 0,95 ml sediaan bufer sampel dicampur sebelum digunakan. Katalis APS (amonium persulfat) 10% dan TEMED : dilarutkan 100 mg APS dalam 1 ml air dengan jangka waktu pemakaian selama 1 minggu, sedangkan larutan TEMED (N,N,N,N tetrametil diamin) tidak perlu diencerkan. Untuk menjaga agar kondisinya tetap baik, TEMED disimpan dari tempat yang dilindungi dari cahaya. Bufer elektroda terdiri dari 0,3 gr basa Tris, 1,4 gr glisin dan 1 ml SDS 10% yang dilarutkan dalam air sehingga volume total larutan 100 ml dari campuran ini diperoleh larutan bufer elektroda dengan ph 8,3. Pewarnaan SDS-PAGE dilakukan dengan metode silver staining. Pereaksi-pereaksi yang harus disiapkan adalah sebagai berikut: Larutan fiksasi 40% etanol: terdiri dari 100 ml etanol, 25 ml asam asetat glasial kemudian ditambahkan air sampai volume 250 ml. 24
Larutan pemekaan: terdiri dari 75 ml etanol, natrium tiosulfat (5%) 10 ml kemudian ditambahkan air sampai 250 ml. Sebelum pemakaian ditambahkan 1,25 ml glutaraldehid 25%. Larutan perak: larutan AgNO 3 25 ml dicampurkan dengan air sampai 250 ml. Sebelum pemakaian ditambahkan 0,1 ml formaldehid 37%. Larutan pengembang: natrium karbonat 6,25 gr dilarutkan dalam air 250 ml. Sebelum penggunaan ditambahkan 0,2 ml formaldehid 37%. Larutan pemberhenti : sebanyak 3,65 gr EDTA-Na 2.2H 2 O dilarutkan dalam air 250 ml. 3.7.2 Prosedur SDS-PAGE Persiapan gel Semua larutan untuk membuat gel pemisahan 15% dicampurkan dengan urutan penambahan berdasarkan tabel. Larutan tersebut kemudian dituangkan diantara 2 plat kaca sampai 1,5 cm dari batas atas kaca dan dibiarkan berpolimerisasi dengan komposisi seperti pada Tabel 3.1. yang dilanjutkan dengan pemasangan sisir untuk membuat sumur gel. Gel dibiarkan selama 30 menit sampai reaksi polimerisasi berlangsung sempurna. Tabel 3.1 Komposisi gel poliakrilamid Larutan Induk Gel Pemisah Gel Pemekat Air 2,35 ml 1,4 ml Akrilamid/bis 30% 5,0 ml 0,33 ml Tris-HCl 1,5 M, ph 8,8 2,5 ml Tris-HCl 1 M, ph 6,8 0,25 ml SDS 10% 100 µl 20 µl APS 100 µl 20µL TEMED 4 µl 2 µl Persiapan sampel Larutan protein standar dan sampel protein enzim masing-masing ditambahkan larutan bufer sampel. Larutan sampel tersebut kemudian didihkan di atas penangas air 100 o C selama 5 menit dan disentrifuga selama 10 menit. 25
Elektroforesis gel Gel yang telah disiapkan dipasang pada alat elektroforesis. Kemudian bufer elektroda dituangkan ke dalam wadah elektroforesis. Setelah itu masing-masing larutan protein (sampel dan standar) sebanyak 15 µl dimasukan ke dalam sumur yang telah dibuat dengan menggunakan ujung pipet mikro. Alat elektroforesis kemudian dijalankan pada tegangan tetap 110 volt selama 110 menit. Pewarnaan dan penghilangan warna Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan dari alat elektroforesis dan direndam dalam larutan fiksasi selama 30 menit sambil digoyang halus dengan alat belly dancer. Setelah itu, larutan fiksasi pada gel dibuang dan diganti dengan larutan pemekaan. Perendaman dilakukan selama 30 menit. Kemudian, gel dicuci dengan air sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit. Larutan perak dituangkan pada gel dan dibiarkan di atas belly dancer selama 20 menit. Kemudian gel dicuci kembali menggunakan air sebanyak dua kali masing-masing 1 menit. Untuk memunculkan hasil pewarnaan, gel diberi larutan pengembang dan dibiarkan selama 2-5 menit. Setelah seluruh pita-pita protein tampak, reaksi dihentikan dengan penambahan larutan pemberhenti. 3.8 Penentuan kadar protein dengan metode Bradford Sampel protein sebanyak 800 μl ditambahkan dengan 200 μl pereaksi Bradford, larutan dihomogenkan dengan vortex kemudian diinkubasi pada suhu kamar dengan waktu inkubasi 15 menit. Setelah inkubasi selesai larutan diukur pada panjang gelombang 595 nm dengan menggunakan spektrofotometer sinar tampak. Adapun sampel protein yang diukur meliputi : standar protein BSA dengan konsentrasi 2 μg/ml, 4μg/mL, 6 μg/ml, 8 μg/ml, 10 μg/ml, dan sampel enzim 1 dan 2. 3.9 Optimasi suhu dan ph Optimasi suhu dilakukan dengan metode uji aktivitas azokaseinolitik terhadap enzim ekstrak kasar pada suhu inkubasi yang bervariasi antara suhu 34 dan 62 o C. Bufer yang digunakan adalah bufer Tris-HCl 0,02 M, ph 8. Optimasi ph dilakukan terhadap ekstrak kasar enzim yang proses isolasinya menggunakan air fisiologis (larutan NaCl 10 %) tanpa penambahan bufer ph. Optimasi ini menggunakan metode uji aktivitas azokaseinolitik dengan suhu inkubasi 50 o C dan variasi ph antara 4 dan 12. 26