27 Bab IV Hasil dan Pembahasan IV.1 Isolasi Enzim katalase dari kentang Enzim katalase terdapat dalam peroksisom, organel yang ditemukan pada jaringan tumbuhan di luar inti sel kentang sehingga untuk mengekstraknya cukup dengan homogenisasi menggunakan blender yang berkecepatan rendah supaya tidak menimbulkan buih karena buih dapat menurunkan tegangan permukaan akibatnya enzim yang terekstrak bisa rusak. Proses homogenisasi ini dilakukan dalam buffer fosfat untuk menjaga supaya ph tetap terjaga, selain itu ditambahkan PMSF sebagai inhibitor protease yang ikut terekstrak pada saat isolasi katalase. Dengan demikian, ekstrak kasar enzim katalase (EKE) yang diinginkan dapat diisolasi tanpa dirusak oleh protease. IV.2 Optimasi Reaksi Enzimatis katalase dari kentang Reaksi enzimatis katalase berlangsung optimum pada konsentrasi substrat 30mM sebagaimana data yang terlampir dalam Lampiran D. Hal ini sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya dimana secara umum reaksi enzimatis katalase berlangsung optimum pada konsentrasi substrat 11-40mM (Beaumont et al, 1990. Demir et al, 2005). IV.3 Penentuan Aktifitas Spesifik EKE Katalase Setelah diisolasi, EKE ditentukan aktivitas enzim dan kandungan proteinnya untuk dihitung nilai aktifitas spesifiknya. Unit aktivitas (unit/ml) enzim katalase ditentukan berdasarkan penurunan konsentrasi substrat (H 2 O 2 ) yang ditunjukkan dengan penurunan nilai serapan pada panjang gelombang 240nm. Hal ini disebabkan karena hidrogen peroksida dapat menyerap sinar UV yang ditunjukkan dengan nilai serapan pada panjang gelombang 240nm dimana jika hidrogen peroksida bereaksi dengan katalase maka sinar UV yang terserap berkurang yang ditunjukkan dengan penurunan nilai serapannya. Hasil
28 aktivitas total EKE adalah 47958,3 unit dengan kandungan protein 14001,39 mg sehingga aktivitas spesifik enzim katalasenya adalah 3,425 unit/mg protein (Lampiran E). IV.4 Pemurnian Enzim katalase dari kentang IV.4.1 Fraksinasi Amonium Sulfat Ekstrak kasar enzim katalase (EKE) pada tahap pertama dimurnikan dengan fraksinasi amonium sulfat. Keuntungan yang paling penting dari fraksinasi amonium sulfat dibanding teknik lain adalah menawarkan kestabilan yang tinggi pada protein yang diendapkan dan dapat menghambat aktivitas protease. Amonium sulfat memiliki sedikit sifat asam sehingga ditambahkan buffer posfat 50mM. Larutan enzim yang terjadi selanjutnya didialisis untuk menghilangkan kadar garam amonium sulfat. Dialisis dilakukan dengan menggunakan kantong dialisis berupa selofan yang mempunyai membran semipermiabel sehingga dapat dilalui oleh ion-ion garam tetapi dapat menahan molekul enzim/protein. Sebelum digunakan selofan dicuci dan diremas-remas untuk embuka kantong selofan kemudian direndam dalam larutan panas natrium hidrokarbonat dengan EDTA 2 % untuk mengkomplekskan ion-ion logam yang menempel serta direbus dalam aquades untuk membunuh mikroba. Untuk menguji apakah masih ada garam atau tidak dalam larutan enzim tersebut maka diteteskan larutan barium klorida kedalam larutan buffer sehingga membentuk endapan barium sulfat yang berwarna putih. Jika endapan sudah tidak terbentuk lagi berarti garam amonium sulfat sudah tidak ada lagi dan dialisis dihentikan. (NH 4 ) 2 SO 4 (aq) + BaCl 2 (aq) BaSO 4 (s) + 2NH 4 Cl (aq) Aktivitas spesifik katalase dari masing-masing fraksi amonium sulfat diuji sebagaimana data yang terlampir dalam lampiran F. Hasil setiap fraksi dapat dilihat dalam tabel IV-1 berikut : Tabel IV-1 Hasil fraksinasi ammonium sulfat Fraksi Volume (ml) Aktivitas spesifik (unit/mg protein) 0-20% 20-80% 80-100% 3,1 35,2 1,7 0,002 7,252 0,095
29 Hasil pengujian menunjukkan bahwa katalase diperoleh paling banyak pada fraksi amonium sulfat 20-80% jenuh. IV.4.2 Kromatografi Kolom Penukar Anion DEAE-Selulosa Larutan enzim fraksi 20-80% jenuh selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi kolom penukar anion DEAE-Selulosa. Sebelum digunakan DEAE-selulosa disetimbangkan dahulu phnya supaya sama dengan larutan buffer posfat. Hal ini dilakukan supaya selulosa sebagai matriks dan DEAE sebagai penukar anion tidak mengikat buffer. ph yang diinginkan sama dengan larutan buffer yaitu 7 karena enzim katalase mempunyai ph isoelektrik 5,5 (Beaumont et al, 1990). Matriks merupakan dekstran, selulosa atau agarosa yang berikatan silang sehingga mempunyai ukuran porositas tertentu. Pada penukar ion DEAE-selulosa, matriksnya adalah selulosa dan gugus fungsi penukar ionnya adalah dietilaminoetil-(deae-). Pada adsorben DEAE, proton pada atom nitrogen berdisosiasi pada ph yang tinggi membentuk suatu matriks yang tidak bermuatan di atas ph 9,5. Selain itu, adsorben DEAE tidak bemuatan sebagian pada ph netral, dan bahkan tidak sepenuhnya terprotonisasi pada ph 6. Meskipun ini berarti pada kondisi operasi (ph 7 sampai 8), adsorben ini hanya sebagian terprotonisasi, matriks ini dapat bertindak sebagai penyangga kuat, dan ini merupakan suatu hal yang mendukung pemisahan yang tidak dapat terjadi pada substituen kuartener (Scopes, 1994). Setiap efluen yang tertampung diukur serapannya pada panjang gelombang 280nm (A 280) untuk mengetahui kandungan protein dalam efluen tersebut. Pada saat nilai A280 mengalami penurunan yang tajam eluen diganti dengan penambahan larutan NaCl pada buffer karena dimungkinkan muatan protein sudah tidak dapat digantikan oleh matriks sehingga diperlukan ion dengan kekuatan yang lebih besar. Dari data A280 setiap efluen terdapat puncak-puncak nilai A280 setiap fraksi. Setiap puncak nilai A280 diukur aktivitas spesifiknya untuk menentukan apakah protein yang terkandung dalam sfluen tersebut merupakan enzim katalase atau bukan. Jika nilai aktivitas spesifiknya tinggi, maka dimungkinkan efluen tersebut larutan yang mengandung enzim katalase. Data hasil
30 kromatografi penukar anion DEAE-selulosa terdapat dalam lampiran G dan kromatogramnya dapat dilihat pada gambar IV-1 berikut : 1 60 0.9 0.8 A280 Aktivitas spesifik 50 A280 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 b u f f e r NaCl 0,2M NaCl 0,4M NaCl 0,6M 40 30 20 Aktivitas spesifik 0.2 0.1 10 0 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 Tabung ke- 0 Gambar IV-1 Kromatogram penukar anion DEAE-Selulosa Gambar IV.1 melukiskan profil kromatogram penukar anion DEAE-selulosa dari pemisahan protein enzim katalase. Gambar IV.1 ini menjelaskan bahwa katalase dapat dipisahkan dengan baik dari protein lainnya. Dari gambar tersebut dapat dilihat bahwa pada tahap pertama protein yang dipisahkan bermuatan sama dengan muatan gugus pada matriks sehingga protein tersebut terelusi dengan mudah oleh buffer awal dan keluar terlebih dahulu dari kolom, tetapi protein tersebut bukan enzim katalase terlihat dari sangat kecilnya nilai aktifitas spesifiknya.. Tahap kedua, muatan pada protein berlawanan dengan muatan pada gugus matrik sehingga protein terikat pada matrik oleh gaya elektrostatik yang berbeda. Untuk melepaskan protein tersebut diperlukan eluen dengan kekuatan ion yang berbeda pula. Dalam hal ini ditambahkan NaCl 0,2M kedalam buffer posfat sebagai eluen. Protein yang terelusi ternyata masih bukan enzim katalase terlihat dari masih kecilnya nilai aktivitas
31 spesifik enzim. Tahap ketiga, muatan pada protein semakin kuat dan protein terikat lebih kuat pada matrik sehingga diperlukan eluen dengan kekuatan ion yang semakin besar yaitu NaCl 0,4M. Ternyata protein yang terelusi adalah enzim katalase terlihat dari besarnya nilai aktivitas spesifik enzim sesuai dengan data pada lampiran H. Fraksi yang mempunyai aktivitas spesifik besar disatukan dan didialisis untuk menghilangkan kadar garam NaCl dalam larutan menggunakan membran selofan dengan uji perak nitrat. AgNO 3 (aq) + NaCl (aq) AgCl (s) + NaNO 3 (aq) Larutan enzim yang dihasilkan dipekatkan dengan freez drying dan dari semua tahap pemurnian selanjutnya ditentukan parameter kemurniannya berdasarkan uji aktivitas dan kandungan protein pada waktu yang bersamaan untuk ketiga hasil (EKE, fraksi 20-80%, hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa) seperti data yang terdapat dalam Lampiran I. Hasil penentuan parameter kemurnian katalase tercantum dalam tabel IV-2 dibawah ini : Tabel IV-2 Hasil akhir Tahapan EKE Volume (ml) Total Protein (mg) Aktivitas total (unit) Aktivitas spesifik (unit/mg) Tingkat kemurnian Prosentase hasil 100 12016,7 40990 3,41 1,00 100 Fraksi 20-80% 35,2 2352,4 16868,1 7,17 2,10 41,15 Kromatografi DEAEselulosa 23,3 197,7 11442,4 57,88 16,97 27,92 Tabel IV.2 memperlihatkan bahwa pemurnian katalase yang dilakukan hanya dengan fraksinasi amonium sulfat memperoleh hasil sekitar 2 kali lebih murni daripada ekstrak kasarnya, sedangkan jika dilanjutkan dengan kromatografi kolom penukar anion DEAEselulosa berhasil diperoleh sekitar 17 kali lebih murni daripada ekstrak kasarnya. Hal ini menunjukkan bahwa pemurnian bisa dilakukan hanya dengan dua tahap saja. Tetapi jika melihat hasil yang diperoleh masih rendah hanya sekitar 30 %, maka diperlukan cara lain yang lebih efisien sehingga diperoleh hasil yang lebih besar.
32 Langkah berikutnya adalah menguji kemurnian enzim yang dihasilkan dengan SDS- PAGE seperti pada gambar IV-2 225 kda 150 kda 100 kda 75 kda 50 kda 35 kda 1 2 3 4 5 6 59 kda 25 kda 15 kda 10 kda Gambar IV-2 Elektroferogram SDS-PAGE dari 1. Protein marker, 2. Ekstrak kasar enzim katalase 3. Fraksi 0-20%, 4. Fraksi 20-80%, 5. Fraksi 80-100%, dan 6.Hasil kromatografi kolom DEAE-selulosa. Dari hasil SDS-PAGE terlihat ada satu pita pada larutan enzim hasil kromatografi kolom penukar anion DEAE-selulosa yang menunjukkan bobot molekul 59 kda sesuai dengan kurva standar protein marker (Lampiran J). Hal ini menunjukkan bahwa enzim sudah cukup murni. IV.5 Penentuan Parameter Kinetika Katalase Dengan Metode kecepatan awal diperoleh V maks dan K M dari katalase yaitu V maks = 4,89.Ms -1 dan K M = 1,13.10-3 M sesuai dengan data pada lampiran K. Nilai tersebut menunjukkan bahwa pada kondisi penelitian yang dilakukan kemampuan katalase yang dihasilkan cukup besar untuk mengikat substrat (H 2 O 2 ).
33 IV.6 Percobaan kinetika enzim katalase IV.6.1 Demonstrasi Kinetika Enzim katalase dari kentang Hasil demonstrasi menunjukkan nilai untuk setiap percobaan seperti ditunjukkan dalam lampiran L. Dari data tersebut diperoleh V maks dan K M dari katalase seperti dalam tabel berikut: Tabel IV-3 Hasil percobaan kinetika enzim katalase Demonstrasi di- V maks (Ms -1 ) K M (M) MGMP 1,38 1,09 SMU 23 1,56 1,27 SMU 1 1,36 1,06 MAN 2 1,39 1,11 SMUT Krida Nusantara 1,38 1,10 Dari Tabel IV.3 dapat dilihat secara umum V maks yang dihasilkan dari percobaan kinetika enzim katalase yang didemonstrasikan di MGMP, SMU/MA kota Bandung jika dibandingkan dengan V maks yang dihasilkan dari penelitian diatas jauh lebih besar. Artinya molekul yang terbentuk atau substrat yang diolah secara maksimum dalam katalase murni (hasil penelitian) lebih besar daripada katalase dalam ekstrak kentang. Demikian juga halnya dengan K M yang dihasilkan dari percobaan kinetika enzim katalase yang didemonstrasikan di MGMP, SMU/MA kota Bandung jika dibandingkan dengan K M yang dihasilkan dari penelitian diatas jauh lebih besar. Artinya katalase murni (hasil penelitian) mempunyai kemampuan untuk mengikat substrat jauh lebih besar daripada katalase dalam ekstrak kentang. Kedua hal tersebut diatas sangat mudah dipahami karena dalam ekstrak kentang masih banyak protein lain selain enzim katalase yang dapat menghalangi, mengganggu atau bahkan menghambat reaksi enzimatis katalase dengan substrat (H 2 O 2 ). Perbedaan alat yang digunakan untuk menentukan kedua parameter kinetika katalase juga sangat berpengaruh. Jelas sekali bahwa spektrofotometer lebih sensitif daripada metoda gelembung sabun yang digunakan dalam percobaan di SMU/MA.
34 Selanjutnya, untuk mengetahui tanggapan guru/siswa terhadap pelaksanaan demonstrasi percobaan kinetika enzim katalase di SMU/MA kota bandung dilakukan kuisioner tanpa paksaan. Tanggapan guru terhadap demonstrasi percobaan kinetika enzim katalase yang telah dilakukan dapat dilihat dalam gambar diagram batang IV-3 berikut : Kuisioner Guru 35 Responden 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 Pernyataan ke- Sangat Setuju Setuju Kurang Setuju Tidak setuju Sangat tidak setuju Gambar IV-3 Diagram batang hasil kuisioner guru Sebanyak 16 % guru menyatakan sangat setuju jika percobaan kinetika enzim katalase didemonstrasikan didepan siswa kelas XII SMU/MA tempatnya mengajar, 34 % setuju, 32 % kurang setuju, 12 % tidak setuju dan 6 % sangat tidak setuju. Alasan mereka yang setuju karena percobaan ini dapat menggabungkan konsep kimia dan biologi yang telah dipelajari siswa sehingga dapat meningkatkan pemahamannya. Sementara alasan yang tidak setuju karena dianggap konsep yang digunakan dalam percobaan ini terlalu tinggi dan rumit untuk siswa SMU/MA sehingga kurang tepat penerapannya. Tetapi 12 % menyatakan sangat mampu untuk mendemonstrasikan percobaan tersebut, 52 % mampu, 24 % kurang mampu, 10 % tidak mampu, dan hanya 2 % yang menyatakan benar-benar tidak mampu. Hal ini menunjukkan bahwa guru merasa cukup kompeten untuk mendemonstrasikan percobaan. Tidak ada yang sangat setuju dengan pernyataan mengenai ketidakberatan pihak sekolah/madrasah atas biaya yang harus dikeluarkan karena percobaan ini. Alasan
35 mereka sekolah/madrasah sangat keberatan jika harus membeli/mengadakan alat-alat yang belum ada seperti pengaduk magnetik yang tidak bisa tergantikan dalam percobaan ini karena harganya yang cukup mahal dan penggunaannya yang tidak meluas di SMU/MA. 32% setuju, 12% kurang setuju, 34 % tidak setuju dan 22 % sangat tidak setuju. Secara umum 63,87 % guru menerima percobaan ini untuk didemonstrasikan di SMU/MA tempatnya mengajar jika alat yang dipergunakan sudah tersedia. Tanggapan siswa terhadap demonstrasi percobaan kinetika enzim katalase yang telah dilakukan dapat dilihat dalam gambar diagram batang IV.4 berikut : Kuisioner Siswa Responden 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Pernyataan ke- Sangat Setuju Setuju Kurang Setuju Tidak Setuju Sangat Tidak Setuju Gambar IV-4 Diagram batang hasil kuisioner siswa Gambar IV-4 memperlihatkan bahwa sebanyak 36 % siswa sangat tertarik mempelajari percobaan ini, 27 % tertarik, 23% kurang tertarik, 5 % tidak tertarik, dan 9 % sangat tidak tertarik karena banyaknya materi pelajaran yang harus dikuasai sehingga 22 % siswa sangat mudah memahami prinsip dasar percobaan ini, 40 % mudah, 23 % kurang memahami, 8 % tidak memahami, 7 % sangat tidak memahami.
36 Sementara itu, 28 % siswa sangat setuju jika konsep yang digunakan dalam percobaan ini berhubungan dengan konsep kimia/biologi yang telah dipelajari, 37 % setuju, 18 % kurang setuju, 11 % tidak setuju, 6 % sangat tidak setuju. Tetapi hanya 16 % siswa yang memperoleh gambaran nyata tentang konsep kinetika enzim dari percobaan ini, 27 % menyatakan ragu, 32 % kurang memperoleh gambaran nyata, 13 % tidak memperoleh gambaran nyata, 12 % sangat tidak memperoleh gambaran bahwa percobaan ini menjelaskan tentang konsep yang telah mereka pelajari. Namun sebanyak 10 % siswa sangat tidak keberatan jika kentang yang digunakan dalam percobaan ini mereka bawa sendiri, 23 % tidak keberatan, walaupun 30 % agak keberatan, 27 % keberatan, 10 % sangat keberatan karena suka lupa alasannya. Secara umum 69,04 % siswa menerima percobaan ini untuk didemonstrasikan. Dari gambaran diatas dapat diperoleh anggapan bahwa percobaan kinetika enzim katalase di SMU/MA kota Bandung menghasilkan V maks dan K M dari katalase dalam ekstrak kentang yang cukup baik secara kuantitatif. Pelaksanaan demonstrasi percobaan inipun mendapat tanggapan yang cukup baik dari guru dan siswa beberapa sekolah/madrasah yang ada di kota Bandung.