1 ANALISA HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PCR KOLONI DAN RESTRIKSI PENDAHULUAN Polimerase Chain Reaction (PCR) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dntps yang mencakup datp (nukleotida berbasa Adenine), dctp (nukleotida berbasa Cytosine) dan dttp (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002). PCR adalah suatu metode yang menggunakan komponen komponen replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan diamplifikasi. Primer menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari setiap strand dari double strand DNA molekul. Primer menetapkan limit daerah yang akan diamplifikasi dan DNA polymerase mereplikasi DNA diantara primer menggunakan empat deoksiribonukelotida (dgtp, datp, dctp, dttp) yang disediakan di dalam tabung reaksi dengan penambahan dntps. Di dalam sebuah siklus amplifikasi (=replikasi), DNA template didenaturasi pada temperature tinggi, annealing primer dilakukan dengan menurunkan temperature dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan siklus denaturasi, annealing primer, dan sintesis DNA menghasilkan DNA melalui amplifikasi secara eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya digunakan di dalam thermalcycler, yaitu sebuah instrumen yang secara otomatis mengontrol temperature dan waktu. Suatu DNA polymerase khusus Taq polymerase, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di hot spring yang stabil pada temperature tinggi digunakan untuk mendenaturasi DNA template. Produk yang dihasilkan dari PCR dianalisa menggunakan elektroforesis gel agarose (Barnum, 2005). Beberapa komponen yang penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah : DNA target, primer, enzim Taq DNA polymerase, deoksinukleoside triphosphat dan larutan penyangga (buffer). Molekul DNA yang targetnya akan dilipatgandakan jumlahnya dapat berupa untai tunggal atau untai
2 ganda. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup. DAlam menentukan jumlah ini, dapat pula dilakukan ujicoba dengan berbagai ukuran, misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga diperoleh kualitas PCR yang paling baik. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genom, sebaiknya DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim Sal I atau Not I yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genom. Primer atau oligonukleotida sebaiknya berukuran paling pendek 16 basa dan biasanya berkisar antara 18 24 basa (Muladno, 2002). Restriksi Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Seperti diketahui, di dalam Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua molekul DNA dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi/diambil dari DNA dengan memotong sugar phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai gunting untuk memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar phosphat backbone DNA pada kedua utasnya. Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di dalam molekul DNA. Urutan yang spesifik tersebut pada umumnya terdiri dari 4 6 pasang basa dan bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5 3 (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3 ) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa
3 pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif (Suharsono dan Widyastuti, 2006). ALAT DAN BAHAN Alat Mesin PCR, Elektroforesis, Gel dock Bahan enzim restriksi Bakteri rekombinan hasil transformasi, X gal, IPTG, primer forward, primer reverse dan METODE Polimerase Chain Reaction Satu koloni putih yang tumbuh pada media LA, ampicilin, X gal, IPTG disuspensikan ke dalam tabung PCR yang telah berisi 8,5 µl ddh 2 O kemudian di kocok. Tusuk gigi yang digunakan untuk memindahkan bakteri ke dalam tabung PCR kemudian di goreskan kembali pada media baru sebagai stok. Tabung PCR kemudian diisi dengan campuran PCR yang terdiri dari 1 ul dntprimer 2 µm, 0,5 ul Primer F 10 µm, 0,5 ul Primer R 10 µm, 0,4 ul DMSO, 1 ul 10x Buffer Tag, 0,1 ul Tag DNA pol sehingga total larutan yang diperoleh adalah 3,5 ul. Lakukan PCR dengan kondisi Pra PCR pada suhu 94 o C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 menit, annealing (penempelan) pada suhu 56 o C selama 30 detik, pemanjangan 72 o C selama 1,5 menit, pasca PCR 72 o C selama 5 menit, semua proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus selama 2,5 jam. Hasil PCR kemudian di elektroforesis selama 30 menit. Restriksi Restriksi dilakukan dengan menggunakan 2 ul plasmid (50 µg/ml), 2 ul 10x buffer Eco RI, 0,5 ul enzim EcoRI 10 U/ul dan 15,5 ul ddh 2 O, sehingga larutan sampel yang diperoleh adalah 20 ul di dalam masing masing tabung. Kemudian, larutan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 jam, kemudian di elektroforesis selama 30 menit. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Dari hasil elektroforesis dapat diperoleh foto gel agarose seperti pada gambar 1. Dari penampakan yang terlihat pada foto diketahui bahwa hasil restriksi dengan menggunakan enzim
4 restriksi Eco RI terbentuk dua pita pada gel, sedangkan dengan menggunakan PCR koloni tidak terbentuk pita. Gambar 1. Gel agarose hasil elektroforesis pada pemeriksaan gen insert dengan menggunakan metode PCR koloni dan enzim restriksi. Pembahasan Enzim restriksi Eco RI berfungsi untuk memotong plasmid pada dua titik sehingga plasmid terbagi menjadi dua bagian DNA. Dua bagian tersebut adalah vektor yang berada paling dekat dengan sumur yang pasangan basanya lebih besar dan gen insert yang jauh dari sumur dan pasangan basanya lebih kecil. Maka dengan terbentuknya dua pita pada gel elektroforesis dapat disimpulkan bahwa proses rekombinasi berhasil karena bakteri yang ditransformasikan (dalam kasus ini hampir semua bakteri berwarna putih yang diambil) mengandung gen insert (G α dari kedelai) didalamnya sehingga bakteri stok dapat digunakan sebagai bakteri rekombinan yang dapat mengekspresikan gen G α dari kedelai. Tidak terbentuknya pita pada gel agarose hasil elektroforesis koloni PCR menandakan bahwa koloni bakteri yang diambil tidak mengandung gen insert. Padahal, pada prinsipnya, tujuan dari PCR koloni adalah untuk mengamplifikasi gen insert yang berada pada plasmid dari bakteri dengan menggunakan primer yang spesifik dari gen G α dari kedelai sehingga gen insert teramplifikasi dan ketika di lakukan elektroforesis akan membentuk pita pada gel agarose. Pita yang terbentuk hanya
5 satu karena amplifikasi hanya dilakukan pada gen insert. Tidak terbentuknya pita dapat diakibatkan primer yang digunakan tidak menempel pada Ori sehingga DNA polymerase tidak melakukan replikasi sehingga gen insert tidak teramplifikasi mungkin primer yang digunakan sudah tidak lagi berfungsi sebagaimana mestinya karena pengaruh lamanya penyimpanan. KESIMPULAN Dalam kondisi yang bertentangan maka dapat disimpulkan bahwa proses DNA rekombinasi berhasil apabila dilihat dari hasil elektroforesis dengan menggunakan metode restriksi dimana dengan menggunakan koloni PCR, proses DNA rekombinasi tidak berhasil. DAFTAR PUSTAKA Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. Thomson Brooks/Cole, USA. 323 pages. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation, Bogor. 123 halaman. Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI DIKNAS, Bogor.