Lampiran 1 Sertifikat Kelaikan Etik

Lampiran 2.1 Surat Izin Melakukan Penelitian Pendahuluan

Lampiran 2.2 Surat Izin Melakukan Penelitian Pendahuluan

Lampiran 3.1 Surat Izin Melakukan Penelitian

Lampiran 4.1 Sertifikat Pengujian

Lampiran 4.2 Perhitungan Kadar Curcumin dalam Sampel vs Curcumin dalam Standar dan Perhitungan Kadar Curcuminoid dalam Sampel vs Curcuminoid dalam Standar

Lampiran 4.3 Hasil Pemeriksaan KLT

Lampiran 5.1 Laporan Hasil Pengujian/Standarisasi Alat Stresor Bising

Lampiran 5.2 Spesifikasi Alat Stresor Bising

Lampiran 6 Konversi Perhitungan Dosis pada Hewan Coba (Laurence & Bacharach, 1964) Mencit 20 g Tikus 200 g Marmut 400 g Kelinci 1.5 kg Kucing 2 kg Kera 4 kg Anjing 12 kg Manusia 70 kg Mencit 20 g Tikus 200 g Marmot 400 g Kelinci 1.5 kg Kucing 2 kg Kera 4 kg Anjing 12 kg Manusia 70 kg 1.0 7.0 12.25 27.8 29.7 64.1 124.2 387.9 0.14 1.0 1.74 3.9 4.2 9.2 17.8 56.0 0.08 0.57 1.0 2.25 2.4 5.2 10.2 31.5 0.04 0.25 0.44 1.0 1.08 2.4 4.5 14.2 0.03 0.23 0.41 0.92 1.0 2.2 4.1 13.0 0.016 0.11 0.19 0.42 0.45 1.0 1.9 6.1 0.008 0.06 0.10 0.22 0.24 0.52 1.0 3.1 0.0026 0.018 0.031 0.07 0.076 0.16 0.32 1.0

Lampiran 7 Volume Maksimum Larutan Sediaan Uji yang Dapat Diberikan pada Hewan Coba (Ritchel, 1974) Jenis Hewan Coba Volume Maksimum (ml) Sesuai Jalur Pemberian i.v i.m i.p s.c p.o Mencit (20-30 g) 0,5 0,05 1,0 0,5-1,0 1,0 Tikus (200 g) 1,0 0,1 2-5 2-5 5,0 Hamster (50 g) - 0,1 1-2 2,5 2,5 Marmut (300 g) - 0,25 2-5 5.0 10,0 Kelinci (2.5 kg) 5-10 0.5 10-20 5-10 20,0 Kucing (3 kg) 5-10 1,0 10-20 5-10 50,0 Anjing (5 kg) 10-20 5,0 20-50 10,0 100,0

Lampiran 8 Kelompok Perlakuan pada Hewan Coba Mulai Kelompok 1 Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok 5 29/10/2012 CMC (+) Bising (+) Bising (+) Bising (+) Curcuminoid (+) CMC (+) Curcuminoid (+) Curcuminoid (+) CMC (+) CMC (+) CMC (+) Terminasi 1 12/11/2012 Mulai 12/11/2012 Tikus tidak diberi perlakuan apapun Mulai 12/11/2012 Bising (+) Curcuminoid (+) CMC (+) Terminasi 2 26/11/2012 CATATAN - Bising yang diberikan: 100 db selama 2 jam perhari - Curcuminoid diberikan: 50 mg/ekor perhari 100 mg/ekor perhari - CMC yang diberikan (0.5%) = 0.5 gr/100cc larutan - Setiap kelompok perlakuan diberikan bising terlebih dahulu lalu diikuti pemberian curcuminoid

Lampiran 9.1 Skema Pembuatan Preparat dengan Metode Parafin Deparafinisasi: 2-3 kali direndam dengan xylol 3 menit: 2-3 kali direndam dalam alkohol absolut dua kali selama 3 menit 2-3 kali direndam dalam alkohol 95% dua kali selama 3 menit 2-3 kali direndam dalam alkohol 80% dua kali selama 3 menit 2-3 kali direndam dalam alkohol 70% dua kali selama 3 menit Direndam dalam air Dikeringkan dengan tissue, diberi tanda dengan pena parafin Direndam dalam PBS selama 5 menit Diteteskan tripsin 0.025% selama 6 menit dalam 37 o C Dicuci dengan PBS 2-3 menit Diteteskan H 2 O 2 selama 2 menit, dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit Pemotongan dengan mikrotom, kemudian obyek diberi poliolesin

Lampiran 9.2 Pewarnaan Imunohistokimia Deparafinisasi: direndam dengan xylol 3 kali; direndam dalam alkohol Direndam dalam alkohol 95% tiga kali Direndam dalam alkohol 80% tiga kali Direndam dalam alkohol 70% tiga kali Preparat dicuci 2 kali dengan PBS Dilakukan bloking dengan BSA 3% selama 10 menit Preparat direaksikan dengan anti mouse sesuai variabel Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 4 o C dalam humidity chamber Preparat direaksikan dengan biotylized secondary Ab (anti rabbit) selama 1 jam Preparat dicuci dengan PBS 3 kali masing-masing 5 menit Ditambahkan streptavidin berlabel peroksidase dan diinkubasi selama 1 jam, kemudian dicuci dengan PBS 3 kali Direaksikan dengan substrat DAB yang dibuat baru dan diinkubasi 30 menit pada suhu kamar sambil digoyang-goyang Preparat dicuci akuades, kemudian ditambahkan pewarna meyer-he selama 10 menit Dicuci dengan air kran, kemudian dengan akuades Preparat diangin-anginkan, kemudian dengan akuades Preparat diangin-anginkan, kemudian diteteskan entelan dan ditutup cover glass Lampiran 9.3 Skema Cara Penghitungan Sel

Hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan 10% formalin Sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal 2-4 µm, kemudian dilakukan pewarnaan Semua slide yang sudah berkode, ditutup nomer kodenya dan diberi nomor baru secara acak Pemeriksa terdiri dari 3 orang dan dilakukan terpisah Pemeriksaan dan penghitungan sel-sel dilakukan terhadap masing-masing slide pada bidang pandang di dinding lateral sediaan, yaitu daerah yang ditandai dengan adanya makrofag, dengan pembesaran 400, 1 lapangan pandang menggunakan gratikuli Hasil penghitungan sel-sel untuk setiap lapangan pandang sesuai dengan slide yang diperiksa ditulis di lembar kerja pada kotak yang sesuai dan hasil akhirnya dijumlah pada kotak kanan bawah

Lampiran 10.1 Gambar Alat Stresor Bising A B C D Keterangan: A. Kotak perlakuan terbuat dari gabus dilapis oleh busa, speaker diletakkan menempel pada atap penutup kotak dan pada dasar kotak dibuat lubang untuk mengukur intensitas B. CD Player dan Amplifier untuk mengatur intensitas (db) sesuai tombol volume dan dipastikan suara yang dihasilkan yang diukur dengan sound level meter C. Kotak perlakuan, CD Player dan Amplifier D. Sound level meter digital

Lampiran 10.2 Gambar Prosedur Penelitian A B C D Keterangan: A. Penimbangan berat badan tikus sebelum dan sesudah perlakuan B. Kandang tempat pemeliharaan tikus C. Curcuminoid yang sudah disuspensikan dengan CMC 0.5% D. Pemberian larutan curcuminoid pada tikus personde

A B C D Keterangan: A. Tikus yang sedang berada dalam kandang perlakuan B. Proses pengambilan tulang Temporal tikus C. Tulang Temporal tikus D. Tulang Temporal tikus dalam buffer Formalin 10%

Lampiran 11 Data Sampel Penelitian No Imunohistokimia Kel. HSP-70 MMP-9 TLR-2 TLR-4 NFκB Kolagen Tipe IV 1 1 3 0 2 3 2 12 2 1 2 2 4 2 3 16 3 1 3 3 3 0 3 10 4 1 2 3 2 3 2 13 5 1 4 0 3 4 3 15 6 2 18 23 15 20 16 3 7 2 21 20 13 23 18 4 8 2 23 21 12 20 21 6 9 2 19 18 17 18 24 6 10 2 15 17 14 24 23 3 11 3a 13 18 15 19 18 11 12 3a 12 16 16 20 17 13 13 3a 10 19 14 21 20 14 14 3a 9 20 14 20 18 12 15 3a 8 21 15 18 19 14 16 3b 11 10 9 13 11 18 17 3b 13 9 12 10 13 23 18 3b 14 8 10 12 15 20 19 3b 13 9 13 9 11 23 20 3b 10 8 15 13 17 20 21 4a 3 11 8 6 11 16 22 4a 4 13 6 4 18 23 23 4a 6 10 11 3 15 20 24 4a 3 13 13 2 17 18 25 4a 6 9 14 2 10 23 26 4b 1 6 3 2 2 23 27 4b 1 8 4 3 4 24 28 4b 2 8 5 3 3 25 29 4b 1 8 3 3 2 23 30 4b 1 6 4 3 3 24 31 5a 6 11 11 13 13 13 32 5a 8 12 10 12 15 12 33 5a 6 8 13 11 10 14 34 5a 7 8 12 13 11 11 35 5a 6 8 8 12 15 13 36 5b 2 3 4 5 3 31 37 5b 4 2 4 3 5 34 38 5b 3 1 5 5 3 30 39 5b 2 3 3 5 5 32 40 5b 2 1 4 3 6 34

Lampiran 10.3 Gambar prosedur pemeriksaan Imunohistokimia 1. Prestaining A Keterangan: A. Preparasi sampel dan memanaskan pada inkubator 37 0 C selama 24 jam

2. Deparafinisasi C B Keterangan: B. Menggunakan xylol dan alkohol berseri. Simpan pada suhu 4 0 C sampai dilakukan immunostaining C. Bilas dengan dh 2 O selama 5 menit dan lakukan pencucian dengan PBS ph 7.4 satu kali selama 5 menit dan tiriskan

D Keterangan: D. Blocking endogenous peroksida menggunakan 3% H 2 O 2 selama 20 menit. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit. Blocking unspecific protein menggunakan 5% FBS yang mengandung 0.25% Triton X-100 dan cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit E Keterangan: E. Inkubasi menggunakan monoklonal anti (antibodi primer) selama 24 jam pada 4 0 C

F Keterangan: F. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit. Kemudian inkubasi menggunakan anti mouse biotin conjugated selama 2 jam. G Keterangan: G. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit dan inkubasi menggunakan SA-HRP selama 40 menit pada temperatur ruangan

H Keterangan: H. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit dan tetesi dengan DAB (Diamino Benzidine) dan inkubasi selama 10 menit

J I Keterangan: I. Cuci menggunakan PBS ph 7.4 tiga kali selama 5 menit dan dh 2 O 2 selama 5 menit, kemudian counterstaining menggunakan Mayer Hematoxilen yang diinkubasi selama 10 menit dan cuci dengan tap water J. Bilas menggunakan dh 2 O dan kering anginkan. Mounting menggunakan entelan dan tutup dengan cover glass. Amati pada mikroskop cahaya

Lampiran 12 Hasil Analisis Statistik 1 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values Perlakuan 8 K1 K2 K3A K3B K4A K4B K5A K5B Number of observations 40 2 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: HSP70 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Error 32 84.000000 2.625000 Corrected Total 39 1401.775000 R-Square Coeff Var Root MSE HSP70 Mean 0.940076 21.82068 1.620185 7.425000 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 122.2321429 122.2321429 46.56 K2 VS K3 1 208.0333333 208.0333333 79.25 K2 VS K4 1 896.5333333 896.5333333 341.54 K2 VS K5 1 710.5333333 710.5333333 270.68 K3A VS K3B 1 8.1000000 8.1000000 3.09 K4A VS K4B 1 25.6000000 25.6000000 9.75 K5A VS K5B 1 40.0000000 40.0000000 15.24 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0885 K4A VS K4B 0.0038 K5A VS K5B 0.0005

3 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: MMP9 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1594.700000 227.814286 84.38 <.0001 Error 32 86.400000 2.700000 Corrected Total 39 1681.100000 R-Square Coeff Var Root MSE MMP9 Mean 0.948605 16.68191 1.643168 9.850000 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1594.700000 227.814286 84.38 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1594.700000 227.814286 84.38 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 388.9285714 388.9285714 144.05 K2 VS K3 1 120.0000000 120.0000000 44.44 K2 VS K4 1 374.5333333 374.5333333 138.72 K2 VS K5 1 662.7000000 662.7000000 245.44 K3A VS K3B 1 250.0000000 250.0000000 92.59 K4A VS K4B 1 40.0000000 40.0000000 14.81 K5A VS K5B 1 136.9000000 136.9000000 50.70 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.0005 K5A VS K5B <.0001

4 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: TLR2 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 820.7750000 117.2535714 34.74 <.0001 Error 32 108.0000000 3.3750000 Corrected Total 39 928.7750000 R-Square Coeff Var Root MSE TLR2 Mean 0.883718 20.24372 1.837117 9.075000 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 820.7750000 117.2535714 34.74 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 820.7750000 117.2535714 34.74 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 225.0035714 225.0035714 66.67 K2 VS K3 1 2.7000000 2.7000000 0.80 K2 VS K4 1 168.0333333 168.0333333 49.79 K2 VS K5 1 154.1333333 154.1333333 45.67 K3A VS K3B 1 22.5000000 22.5000000 6.67 K4A VS K4B 1 108.9000000 108.9000000 32.27 K5A VS K5B 1 115.6000000 115.6000000 34.25 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 0.3778 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0146 K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

5 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: TLR4 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 2028.175000 289.739286 130.22 <.0001 Error 32 71.200000 2.225000 Corrected Total 39 2099.375000 R-Square Coeff Var Root MSE TLR4 Mean 0.966085 15.49759 1.491643 9.625000 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2028.175000 289.739286 130.22 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2028.175000 289.739286 130.22 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 298.289286 298.289286 134.06 K2 VS K3 1 100.833333 100.833333 45.32 K2 VS K4 1 1068.033333 1068.033333 480.01 K2 VS K5 1 546.133333 546.133333 245.45 K3A VS K3B 1 168.100000 168.100000 75.55 K4A VS K4B 1 0.900000 0.900000 0.40 K5A VS K5B 1 160.000000 160.000000 71.91 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.5293 K5A VS K5B <.0001

6 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: NFkBp65 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1717.975000 245.425000 48.96 <.0001 Error 32 160.400000 5.012500 Corrected Total 39 1878.375000 R-Square Coeff Var Root MSE NFkBp65 Mean 0.914607 20.12460 2.238861 11.12500 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1717.975000 245.425000 48.96 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1717.975000 245.425000 48.96 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 415.2892857 415.2892857 82.85 K2 VS K3 1 67.5000000 67.5000000 13.47 K2 VS K4 1 472.0333333 472.0333333 94.17 K2 VS K5 1 464.1333333 464.1333333 92.60 K3A VS K3B 1 62.5000000 62.5000000 12.47 K4A VS K4B 1 324.9000000 324.9000000 64.82 K5A VS K5B 1 176.4000000 176.4000000 35.19 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 0.0009 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0013 K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

7 Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 The GLM Procedure Dependent Variable: Kolagen4 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 2545.575000 363.653571 99.97 <.0001 Error 32 116.400000 3.637500 Corrected Total 39 2661.975000 R-Square Coeff Var Root MSE Kolagen4 Mean 0.956273 10.91401 1.907223 17.47500 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2545.575000 363.653571 99.97 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2545.575000 363.653571 99.97 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 104.432143 104.432143 28.71 K2 VS K3 1 512.533333 512.533333 140.90 K2 VS K4 1 1020.833333 1020.833333 280.64 K2 VS K5 1 1080.000000 1080.000000 296.91 K3A VS K3B 1 160.000000 160.000000 43.99 K4A VS K4B 1 36.100000 36.100000 9.92 K5A VS K5B 1 960.400000 960.400000 264.03 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.0035 K5A VS K5B <.0001