Bab III Rancangan Penelitian Pada bagian ini dijelaskan tentang penelitian yang dilaksanakan meliputi metodologi penelitian, bahan dan alat yang digunakan, alur penelitian dan analisis yang dilakukan. III.1 Metodologi Pada penelitian ini dilakukan empat tahapan yaitu : 1. Pemilihan spesies jamur yang akan digunakan dalam produksi lakase, 2. Pemilihan bahan imobilisasi untuk kultur jamur terpilih, 3. Produksi lakase dalam bioreaktor, 4. Penggunaan enzim kasar pada perlakuan awal pemutihan pulp kimia. III.2 Bahan dan alat III.2.1 Bahan a. Mikroorganisme Mikroorganisme yang digunakan adalah jamur pelapuk putih yaitu Marasmius sp. dan Trametes hirsuta yang merupakan koleksi Pusat Ilmu Hayati ITB yang dipelihara dalam medium agar miring (PDA) seperti yang terlihat pada gambar IV.3. Jamur Marasmius sp. dan Trametes hirsuta yang akan digunakan pada penelitian ini diperbanyak pada cawan petri menggunakan Potato Dextrose Agar sebagai media. Komposisinya disajikan pada tabel III.1. Gambar III.1. Jamur pelapuk putih dalam media agar miring 23
Tabel III.1. Komposisi medium Potato Dextrose Agar Bahan Komposisi, g/l Kentang 200 Agar-agar 18 Glukosa 20 Kalsium karbonat 0,2 Magnesium sulfat 0,2 Kentang yang telah dikupas dan diiris tipis, kemudian direbus sampai lunak. Air rebusan kentang disaring dan dijadikan 1000 ml dengan penambahan akuades. Ke dalam air saringan kentang ditambahkan kalsium karbonat (CaCO 3 ), magnesium sulfat (MgSO 4 7H 2 O) dan agar-agar. Larutan diaduk hingga merata menggunakan magnetic stirrer dan juga pemanasan, dan glukosa ditambahkan terakhir. Medium ini kemudian diletakkan dalam beberapa labu erlenmeyer 500 ml yang bagian atasnya ditutup menggunakan kapas. Kapas ini berfungsi untuk mengalirkan udara panas dari dalam labu sehingga tidak terjadi tekanan yang terlalu tinggi dalam labu tersebut pada saat sterilisasi. Medium agar dan beberapa cawan petri kosong kemudian disterilisasi dalam autoclave. Autoclave melakukan sterilisasi dengan menggunakan panas lembab. Keuntungan penggunaan panas lembab dalam proses sterilisasi dalah kelembaban mempermudah proses denaturasi protein sel kontaminan. Autoclave dioperasikan pada tekanan 15 psia dan temperatur 121 C selama 15 menit. Setelah selesai sterilisasi, medium didinginkan dan dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptis dengan menggunakan api dari pembakar bunsen di sekelilingnya dalam laminar air flow cabinet. Bila medium agar telah padat maka perlu dipanaskan agar mencair. Sediaan jamur dalam media agar miring diinokulasikan dalam cawan petri secara aseptis pula. Hal ini dilakukan untuk memperbanyak sediaan jamur. b. Media imobilisasi Media imobilisasi merupakan media untuk menumbuhkan jamur. Media yang digunakan terdiri dari media sintetis dan media alami. Media sintetis yang 24
digunakan dalam percobaan ini adalah media plastik (bioball) dan sabut penggosok komersial berbahan dasar nilon. Sedangkan media alami yang digunakan adalah bulustru (luffa sponges). Bulustru merupakan serat buah oyong yang telah dikeringkan. Ketiga bahan tersebut dapat dilihat pada gambar III.2. bioball sabut penggosok Bulustru (luffa sponges) Gambar III.2. Media imobilisasi jamur Bioball dengan ukuran diameter 3,5 cm dan tinggi 3 cm dapat langsung digunakan sebagai media imobilisasi, sedangkan sabut penggosok yang mulanya berbentuk lembaran dipotong-potong seperti dadu dengan ukuran 1 cm x 1 cm x 1 cm sebelum digunakan sebagai media imobilisasi demikian pula dengan bulustru yang dipotong dengan ukuran sekitar 5 cm x 5 cm. 25
c. Medium Kirk Medium pertumbuhan yang digunakan sebagai nutrisi jamur Marasmius sp. adalah medium Kirk (Nüske dkk., 2001) dengan komposisi yang disajikan pada tabel III.2. Medium ini digunakan untuk merendam media imobilisasi dan digunakan sebagai medium untuk produksi lakase. Medium Kirk merupakan campuran dari medium utama dan trace element yang disajikan pada tabel III.3 dan III.4. Pembuatan medium Kirk dilakukan dengan mencampurkan medium utama dangan trace element dengan perbandingan 6 : 1 (v/v). Tabel III.2. Komposisi medium Kirk Bahan Komposisi, g/l Glukosa 4.286 KH 2 PO 4 1.714 MgSO 4.7H 2 O 0.429 CaCl 2 0.086 Natrium asetat 2.314 Diammonium tartrat 0.429 MnCl 2 0.021 Ekstrak ragi 0.257 CuSO 4. 7H 2 O 0.011 H 2 MoO 4 0.007 MnSO 4. 4H 2 O 0.010 ZnSO 4. 7H 2 O 0.006 Fe 2 (SO4) 3 0.007 Tabel III.3. Komposisi medium utama Bahan Komposisi, g/l Glukosa 5,0 KH 2 PO 4 2,0 MgSO 4.7H 2 O 0,5 CaCl 2 0,1 Natrium Asetat 2,7 Diammonium tartrat 0,5 MnCl 2 0,025 Ekstrak ragi 0,3 26
Tabel III.4. Komposisi trace element Bahan Komposisi, g/l CuSO 4. 7H 2 O 0.08 H 2 MoO 4 0.05 MnSO 4. 4H 2 O 0.07 ZnSO 4. 7H 2 O 0.043 Fe 2 (SO4) 3 0.05 d. Pulp Pulp yang akan diputihkan adalah pulp dari kayu Acacia mangium hasil pemasakan proses kraft yang memiliki bilangan kappa 20. Sediaan pulp ini diperoleh dari Laboratorium Pemasakan Balai Besar Pulp dan Kertas, Departemen Perindustrian, Bandung. III.2.2 Alat Alat utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah bioreaktor imersi berkala termodifikasi. Satu set bioreaktor terdiri atas dua kompartemen yang terbuat dari kaca dan terhubung dengan selang silikon. Ukuran bioreaktor adalah tinggi 15 cm, panjang 10 cm dan lebar 10 cm. Tiap bioreaktor diisi Marasmius sp. yang terimobilisasi sedemikian rupa sehingga ketinggian kultur dalam bioreaktor adalah 8 cm. Salah satu kompartemen dapat digerakkan naik dan turun dengan menggunakan mesin penggerak yang diatur waktunya sesuai variasi waktu imersi yang digunakan. Variasi waktu imersi yang digunakan pada penelitian ini adalah 15 menit, 12 jam dan 24 jam. Tiap variasi waktu imersi dilakukan untuk dua siklus kultivasi dengan tiap siklus kultivasi berjalan selama tiga hari. Satu siklus berarti kultur jamur dalam bioreaktor menggunakan medium Kirk yang sama selama tiga hari sedangkan pada siklus berikutnya medium Kirk seluruhnya diganti dengan medium Kirk yang baru. Skema bioreaktor disajikan dalam gambar III.3. 27
2 3 A 1 4 5 6 7 8 Keterangan : A, B : kompartemen 1. Selang silikon 2. Tempat penggantian medium 3. Saringan udara 4. Saluran pengeluaran udara 5. Saluran pemasukan udara 6. Medium Kirk 7. Kaca bioreaktor 8. Kultur jamur 9. Tempat pemanenan enzim kasar : aliran udara : aliran medium I : pengosongan kompartemen A, perendaman kompartemen B II : pengosongan kompartemen B, perendaman kompartemen A I 9 B B A II Gambar III.3. Skema bioreaktor imersi berkala termodifikasi 28
Udara disuplai menggunakan aerator dan medium yang digunakan untuk produksi lakase adalah sama dengan medium untuk merendam bulustru yaitu medium Kirk (dengan kandungan lindi hitam 0,4%) sebanyak 700 ml tiap satu set bioreaktor. Pengambilan conto dilakukan setiap 24 jam. III.3 Alur penelitian Alur penelitian dapat dilihat pada gambar III.4. Marasmius sp Trametes hirsuta a. laju pertumbuhan b. degradasi lignin c. sintesis enzim Jamur terpilih imobilisasi bioball Sabut penggosok bulustru pertumbuhan Produksi enzim Media terpilih Perlakuan awalpemutihan pulp menggunakan enzim kasar Pemutihan lanjutan dengan menggunakan bahan kimia Gambar III.4. Alur penelitian 29
III.4 Analisis Parameter Penelitian Analisis yang dilakukan pada penelitian ini adalah : 1. Pemilihan spesies jamur yang digunakan dalam produksi lakase Spesies jamur yang digunakan pada pemilihan ini adalah Trametes hirsuta dan Marasmius sp. Pemilihan dilakukan berdasarkan : a. uji laju pertumbuhan b. uji degradasi lignin c. uji kualitatif sintesis enzim analisis ketiga uji tersebut selengkapnya terdapat pada subbab IV.2.2, IV.2.3 dan IV.2.4. 2. Pemilihan bahan imobilisasi untuk kultur jamur terpilih Bahan yang dipilih pada penelitian ini terdiri atas bahan sintetis yaitu bioball dan sabut penggosok dan media alami yaitu bulustru (luffa sponges). Pemilihan media imobilisasi berdasarkan pengamatan secara visual pertumbuhan jamur terpilih pada media imobilisasi. 3. Produksi lakase dalam bioreaktor Kultur Marasmius sp. yang terimobilisasi pada bulustru digunakan untuk memproduksi lakase menggunakan bioreaktor imersi berkala termodifikasi. Analisis yang dilakukan pada produksi lakase adalah : a. analisis aktivitas lakase b. analisis protein. Kedua analisis tersebut selengkapnya terdapat pada subbab VI.2.5 dan VI.2.6. 4. Penggunaan enzim kasar lakase untuk perlakuan awal (pretreatment) pemutihan pulp kimia. Analisis yang dilakukan pada penelitian ini adalah : a. aktivitas lakase b. derajat putih lembaran pulp c. distribusi panjang serat Analisis aktivitas lakase selengkapnya terdapat pada subbab VI.2.5, analisis derajat putih lembaran pulp dan distribusi panjang serat selengkapnya terdapat pada lampiran C dan D. 30