BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental laboratoris in-vitro dengan rancangan penelitian post test control group only design. 4.2 Sampel Penelitian dan Besar Sampel 4.2.1 Sampel Penelitian Sampel dari penelitian ini yaitu biofilm spesies tunggal dipersiapkan dari stok bakteri E. faecalis yang dikultur pada media trypticase soy broth (TSB). 4.2.2 Besar Sampel Besar sampel minimum yang memenuhi syarat untuk dianalisa ditentukan dengan rumus Federer (Loekito, 1998), sebagai berikut : (p-1)(n-1) 15 (4-1)(n-1 ) 15 3n 3 15 3n 18 n 6 Keterangan : n = Pengulangan berdasarkan rumus banyaknya pengulangan yang dilakukan minimal 6 kali
p = Jumlah perlakuan adalah 4 yaitu dengan NaOCl 5,25%, EDTA 17%, kombinasi EDTA 17 % dan NaOCl 2,5% dan kontrol positif 4.3 Variabel Penelitian 4.3.1 Variabel bebas Larutan irigasi NaOCL 5,25%, EDTA 17% dan kombinasi larutan irigasi EDTA 17 % dan NaOCl 2,5%. 4.3.2 Variabel kendali Media pembiakan bakteri, suhu dalam inkubator, waktu inkubasi, metode pengukuran dan cara kerja. 4.3.3 Variabel tergantung Optical Density (OD) biofilm spesies tunggal bakteri E. faecalis yang dapat dihitung dengan spektrofotometer / ELISA reader. 4.4 Definisi Operasional Variabel a. Kombinasi larutan irigasi EDTA 17 % dan NaOCl 2,5% adalah kombinasi yang dilakukan dengan aplikasi EDTA 17% terlebih dahulu, kemudian selanjutnya diaplikasikan NaOCl 2,5% pada tiap kolom mikrotiter. b. Biofilm bakteri E. faecalis adalah hasil pembiakan bakteri E. faecalis pada microtitter plate yang dapat dianalisa secara kuantitatif dengan mengukur Optical Density (OD) menggunakan spektrofotometer. c. Optical Density (OD) adalah satuan yang digunakan untuk menghitung biofilm pada mikrotiter.
4.5 Tempat Penelitian Timur. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang, Jawa 4.6 Waktu Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Juli - Desember 2012. 4.7 Alat dan Bahan 4.7.1 Alat a. Oese b. Brander spiritus c. Inkubator d. Anaerobik Jar e. Tabung reaksi f. Rak tabung reaksi g. Petri dish h. Plate steril i. Glass coverslip 22 mm j. Microtitter plate / 96-well flat-bottomed plastic tissue culture plate k. Spektofotometer / ELISA reader 4.7.2 Bahan a. Trypticase Soy Broth (TSB) dengan 1% glukosa (TSBglu) dan tanpa glukosa b. Biakan bakteri E. faecalis pembentuk biofilm yang didapatkan dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya c. Phosphate-buffered saline (ph 7,3)
d. Kristal violet 0,2 ml 2% e. HCl Isopropanol 200μl f. Aquadest g. Larutan irigasi NaOCl 5,25% h. Larutan irigasi EDTA 17 % 4.10 Prosedur Penelitian a. Bakteri E. faecalis dikultur pada media trypticase soy broth (TSB) selama 1 x 24 jam kemudian didilusi sampai 1:100 pada TSBglu. b. Kemudian 0,1 ml bakteri E. faecalis yang telah dikultur pada media TSB dengan konsentrasi 10 6 bakteri/ml diisikan ke dalam 96-well flat bottomed plastic tissue culture plate / microtiter plate. c. Mikrotiter diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37 o C. d. Larutan irigasi NaOCL 5,25%, larutan irigasi NaOCl 2,5%, EDTA 17% dan kombinasi larutan irigasi EDTA 17 % dan NaOCl 2,5% ditambahkan masing-masing 1ml pada setiap kolom. e. Mikrotiter diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37 o C. f. Isi dari tiap mikrotiter diaspirasi dan dicuci 3 kali dengan 0,2 ml Phosphate-buffered saline (ph 7,3) dengan menggunakan pipet. g. Mikroorganisma biofilm yang menempel pada well diberi pewarnaan dengan crystal violet 0,2 ml 2%. h. Dilakukan pembilasan dengan menggunakan aquadest dan dikeringkan. i. Untuk menganalisis secara kuantitatif pembentukan biofilm, ditambahkan 0,2 ml dari HCl isopropanol pada setiap well.
j. Kemudian dilakukan pengukuran Optical Density (OD) pada 570 nm menggunakan spektrofotometer / ELISA reader, prosedur ini diulang sebanyak 8 kali. 4.11 Analisis Data Data yang diperoleh adalah data kuantitatif dari pembacaan spektrofotometer dengan satuan Optical Density setiap mikrotiter yang diberi perlakuan berbeda, yaitu pemberian larutan irigasi NaOCL 5,25%, EDTA 17% dan kombinasi larutan irigasi EDTA 17 % dan NaOCl 2,5%. Data dari setiap penelitian ini dikumpulkan dan distribusi data diperiksa dengan menggunakan uji Kolmogorov Smirnov Test untuk melihat apakah distribusi data yang didapat normal. Analisis homogenitas yang digunakan adalah uji one-way ANOVA. Semua perangkat analisis menggunakan program SPSS 19.0 dari Windows
4.12 Alur Penelitian Stok bakteri E. faecalis Dikultur dalam media TSB selama 24 jam, kemudian didilusi sampai 1:100 pada TSBglu 0,1 ml biakan bakteri tersebut dimasukkan ke dalam 96-well flat bottomed plastic tissue culture plate steril dan 0,2 ml bakteri murni sebagai kontrol positif Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C Menambahkan larutan NaOCl 5,25 % pada kolom. Menambahkan kombinasi larutan EDTA 17% dan NaOCl 2,5% pada kolom. Menambahkan larutan EDTA 17 pada kolom. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C Microtiter diaspirasi dan dicuci 3 kali dengan 0,2 ml Phosphate-buffered saline (ph 7,3) Proses pewarnaan dengan menggunakan crystal violet 0,2 ml 2% Pembilasan dengan menggunakan aquadest kemudian dikeringkan Ditambahkan 0,2 ml dari HCl isopropanol pada setiap well Diukur dengan spektrofotometer / ELISA reader dan dilihat Optical Density nya Analisa Statistik