MODUL 7 Uji Potensi Bakteri dan Resistensi terhadap Antibiotik POKOK BAHASAN : 1. Uji Resistensi Bakteri terhadap Antibiotik 2. Uji potensi bakteri sebagai penghasil enzim ekstraseluler (proteolitik, celulase, kitinase) 3. Uji penapisan bakteri probiotik/penghasil antibiotik TUJUAN PRAKTIKUM : Mengetahui tingkat resistensi bakteri terhadap antibiotik Mengetahui potensi bakteri sebagai penghasil enzim ekstraseluler Mengetahui potensi bakteri sebagai penghasil antibiotik/berfungsi probiotik TINJAUAN PUSTAKA : Uji resisten adalah suatu pengujian untuk mengetahui kepekaan bakteri terhadap antibiotik. Telah diketahui bahwa antibiotik merupakan bahan yang cukup representatif untuk membunuh bakteri. Penggunaan antibiotik yang tidak terkendali telah menyebabkan terjadinya efek samping yang sangat mebahayakan yaitu menyebabkan bakter-bakteri tertentu menjadi tahan atau resisten terhadap antibiotik. Antibiotik pada umumya diproduksi dari kapang (yeast), misalnya: Penicillium notatum, Penicillium chisogenum, dan lain sebagainya. Antibiotik yang dihasilkan dari Penicillium sp tersebut dikenal sebagai penisilin. Untuk mengetahui bakteri-bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik, maka dilakukan uji resistensi. Bakteri ditumbuhkan pada medium lempeng agar, kemudian bahan Antibiotik dipaparkan dengan menempatkannya di atas kertas berbentuk cakram (paper disk) dan diletakan di atas lempeng agar tersebut. Media kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Ketahanan bakteri terhadap antibiotik dilihat berdasarkan daerah hambat (zona halau) yang terbentuk di sekeliling paper disk antibiotik tersebut. Adapun interpretasi terhadap daerah hambat (zona halau) tersebut yaitu sebagai berikut: Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 30
1. Daerah hambat dengan diameter lebih dari 30 mm menunjukan bahwa bakteri tersebut Peka terhadap antibiotik; 2. Daerah hambant dengan diameter antara 20 30 mm menunjukan bahwa bakteri tersebut Agak Resisten terhadap antibiotik; 3. Daerah hambat dengan diameter kurang dari 20 mm menunjukan bahwa bakteri tersebut Resisten terhadap antibiotik. Paper Zona Hambatan Biakan Bakteri Uji Cawan Petri Gambar : Pengukuran Zona Hambatan pada Uji Resistensi Bakteri Bakteri mengambil nutrisi yang dibutuhkan dari media tempat hidupnya. Nutrisi yang berupa makromolekul seperti polisakarida, lipid, dan protein, tidak dapat masuk melalui membran sel. Makromolekul ini harus dihidrolisis dulu menggunakan enzim extraselular spesifik menjadi sub unit dasarnya. Molekul kecil ini dapat masuk ke dalam sel dan digunakan dalam proses sintesis dan pembentukan energi. Beberapa enzim yang umum dihasilkan bakeri adalah selulase, kitinase, lipase dan protease. Bakteri probiotik dapat menghasilkan enzim laccase. Uji potensi produksi enzim ektraseluler dapat dilakkan dengan cara menmbuhka bakteri di media spesifik yaitu media universal yang diperkaya dengan senyawa atau zat yang dapat menginduksi produksi enzim. Cara laina dalah dengan membuat media sederhana dengan menggunakan senyawa atau zat penginduksi sebagai sumber utama karbon, sementara komponen N, P, S dan elemen mikro Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 31
dalam bentuk senyawaan kimia. Cara awal menapis bakteri yang berpotensi probiotikr sama dengan uji potensi bakteri dalam menghasilkan antibiotik atau uji resistensi antibiotik. Hidrolisis casein Casein, protein yang mendominasi susu, merupakan makromolekul yang tersusun dari asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida (CO-NH). Sebelum masuk kedalam sel, protein harus dipecah secara bertahap menjadi pepton, polipeptida, dipeptida, dan asam amino. Proses ini disebut peptonisasi atau proteolisis dan proses ini dilakukan oleh enzim extraselular yang biasa disebut protease. Fungsi dari protease adalah untuk memotong ikatan peptide CO-NH dengan memasukkan air ke dalam molekul. Molekul kecil seperti asam amino dapat ditransfer melalui membrane sel menuju kolam intraselular asam amino untuk digunakan dalam mensintesis struktur dan fungsi sel protein. Dalam praktikum kali ini, skim milk agar digunakan untuk mendemonstrasikan aktivitas hidrolisis exoenzim. Medium terdiri dari nutrient agar yang ditambahkan susu yang mengandung substrat casein protein. Mirip dengan protein lain, susu protein merupakan suspense koloid yang memberikan warna dan buram pada medium karena susu protein dapat membelokkan cahaya daripada meneruskannya. Setelah inokulasi dan inkubasi kultur, organisme yang menghasilkan protease akan memperlihatkan zona proteolisis, yang ditunjukkan dengan adanya zona bening mengelilingi bakteri. Ini merupakan hasil dari reaksi hidrolisis yang menghasilkan larutan, nonkoloid asam amino, dan ini menunjukkan hasil yang positif. Dalam pencarian aktifitas protease, daerah disekitar pertumbuhan bakteri yang tetap berwarna buram, menunjukkan reaksi negatif. Hidrolisis CMC (Carboxymetyl Cellulose) CMC merupakan senyawa selulosa yang digunakan untuk menapis bakteri yang mampu menghasilkan enzim selulolitik. Penapisan dilakukan dengan menambahkan pewarna red congo untuk mendeteksi adanya aktivitas selulolitik, yang ditandai dengan adanya zona bening disekeliling koloni setelah media padat diwarnai. PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM : Alat : Tabung Reaksi Jarum Ose Cawan Petri L-Glass Beaker Glass Bahan : Biakan (Agar Culture) NaCl Fisiologis Antibiotik Aquades Steril Paper disk Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 32
Pinset Steril Bunsen Jangka Sorong Spiritus CMC Skim milk Kitin Bakteri Staphylococcus aureus&vibrio sp. Prosedur Uji Resistensi Antibiobiotik: 1. Persiapkan biakan bakteri yang sudah ditanam dalam medium Agar Miring; 2. Secara aseptis, ambil 1 (satu) Ose biakan dari medium Agar Miring, masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml NaCl Fisiologis; 3. Suspensikan biakan dengan Vortex; 4. Ukur Densitas/Kekeruhan suspensi dengan membandingkannya dengan Reagent Mc Farlan s; 5. Ambil 100 µl suspensi dengan menggunakan Micropipet, tebarkan di atas medium Agar Plate yang sudah padat, ratakan dengan L-Glass; 6. Dengan menggunakan Pinset Steril, celupkan Paper Disk ke dalam larutan antibiotik, kemudian tempatkan di atas Lempeng Agar; 7. Inkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam; 8. Amati dan Ukur Zona Hambat yang terbentuk. Prosedur Uji Enzim Ekstraseluler 1. Bakteri yang sudah ditanam dalam agar miring digores zigzag pada media padat spesifik sesuai dengan jenis enzim yang akan diuji (media skim milk, kitin, CMC). 2. Bakteri diinkubasi pada suhu 30 0 C sehari semalam kemudian diamati pembentukan zona beningnya untuk penghasil protease dan kitinase. 3. Uji selulolitik dilakukan dengan menuangkan red congo 0,1% sebanyak 5 ml ke bakteri uji diinkubasi 15 menit pada suhu ruang kemudian red congo yang tidak terserap dibuang 4. NaCl 5M sebanyak 5 ml dituangkan ke bakteri uji untuk membilas red congo kemudian diamati pembentukan zona beningnya. Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 33
5. Zona bening yang dihasilkan diukur diameternya kemudian dihitung nilai index hidrolitik dengan membagi diameter zona bening/diameter bakteri. Prosedur Penghasil Antibiotik dan Potensi Probiotik 1. Bakteri dari agar miring digores zigzag pada media padat pada zona 1. 2. Bakteri uji/antagonis digores tegak lurus dengan bakteri isolat pada zona 2. 3. Media yang telah digores kemudian diinkubasi pada suhu 30 0 C sehari semalam kemudian diamati pertumbuhan bakteri antagonis. 4. Bakteri yang berpotensi menghasilkan antibiotik atau bersifat probiotik dapat menghambat pertumbuhan bakteri antagonis. Gambar : Ilustrasi Prosedur Uji Resistensi Bakteri Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 34
a b Gambar bentuk goresan untuk uji hidrolitik (a) dan uji produksi antibiotik (b) PARAMATER YANG DIAMATI : No Sumber Isolat Diameter Zona bening (mm) Index hidrolitik Antibiotik A (..) Antibiotik B (..) Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2012 Page 35