BAB III. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian- Peternakan Universitas Muhammadiyah Malang. Penelitian ini dilaksanakan selama 5 bulan yang berlangsung dari bulan Januari 2019 sampai bulan Mei 2019. 3.2 Alat Dan Bahan 3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari alat pertanian, cawan petri, erlenmeyer, jarum ose (steril), scalpel, blade, korek api, pinset, masker, lampu bunsen, plastik wrap, alumunium foil, LAF, autoclave, gelas ukur, pipet tetes, panci, penggaris, timbangan analitik, alat pengaduk (spatula), kompor gas, sarung tangan, pisau, label, alat tulis, dan kamera. 3.2.2 Bahan Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman jarak pagar pada bagian akar, batang, dan daun, media PDA, media WA, aquades, NaOcl 1%, alkohol 70%, dan spritus. 3.3 Metode Penelitian eksploratif. Metode penelitian yang digunakan yaitu dengan menggunakan metode 14
Ulangan 15 Tabel 1. Denah tanaman Jarak Pagar di lahan Kedung Pasuruan Jawa Timur. Varietas 6 5 7 IP3A 18 IP3P Nomor Tanaman 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 7 6 IP3P 18 5 IP3A 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 IP3P IP3A 5 7 6 18 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 IP3A IP3P 18 6 7 5 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 20 11 10 1 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 19 12 9 2 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 18 13 8 3 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 17 14 7 4 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 16 15 6 5 IV III II I Keterangan: Sampel 1: 5.1.8 Sampel 2: IP3A.1.16 Sampel 3: 7.2.13 Sampel 4: 18.3.9 Sampel 5: IP3P.4.13 Sampel 6: 6.4.13
16 Teknik pengambilan sampel menggunakan sistematik sampling, yaitu pengambilan secara sistematis dari setiap varietas diambil 1 tanaman dan setiap tanaman diambil 6 organ tanaman yang berbeda-beda. 3.4 Pelaksanaan Penelitian 3.4.1 Pengambilan sampel di lapang Tanaman yang digunakan adalah tanaman jarak pagar dengan mengambil sampel bagian tanaman yang berupa 1 akar tunggang bagian cabang dengan kedalaman 10 cm, 2 batang yakni, batang yang tua (keras dan berkayu) dan batang muda (lunak), 3 daun yakni daun tua (bagian bawah ), daun setengah tua (bagian atas) dan daun muda (bagian pucuk) dalam satu tanaman. Bagian tanaman yang diambil untuk proses eksplorasi berada dalam kondisi sehat, serta tidak menunjukkan adanya gejala infeksi dari penyakit (Selim et al., 2012). Satu akar tanaman yang mengalami layu fusarium sebagai patogen. 3.4.2 sterilisasi alat dan bahan Peralatan dicuci bersih terlebih dahulu dengan menggunakan sabun, kemudian direndam dengan clorox dan air selama 24 jam, setelah itu dikering anginkan lalu dibungkus menggunakan kertas dan disterilisasikan dengan autoklaf. Autoklaf dengan tekanan 1 atm dan suhu 121 0 C (Dewi dkk, 2014). 3.4.3 Pembuatan Media 1. Pembuatan media PDA (Potato Dextrosa Agar).
17 Kentang sebanyak 200 gram dipotong kotak dadu 1x1 cm kemudian direbus dalam 1000 ml akuades, kemudian disaring sehingga didapatkan ekstrak kentang. Ekstrak kentang ditambah aquades sampai volumenya 1000 ml, selanjutnya di panaskan lagi di atas kompor dengan ditambahkan 20 gram dextrosa, 20 gram agar, dan 1 kapsul cloropenikol. Setelah mendidih diangkat dan dimasukkan ke dalam botol media steril. Setelah itu media PDA disterilkan menggunakan autoklaf dengan tekanan 1 atm, dengan suhu 121 o C selama 15 menit (Sarsito et al., 2008). 2. Pembuatan Media Water Agar (WA) Menimbang agar sebanyak 10 gram dan memasukkan agar ke dalam panci yang berisi aquades 500 ml dan dipanaskan diatas kompor sambil diaduk hingga menjadi homogen. Selanjutnya, media di masukkan pada erlenmeyer dan ditutup dengan alumunium foil dan plastik. Menstrerilkan media dengan menggunakan autoklaf bertekanan 1 atm, dengan suhu 121 o C selama 15 menit. 3.4.4 Isolasi Jamur Endofit dan Jamur Patogen Layu Fusarium Jamur endofit diperoleh dengan mengisolasi akar, batang dan daun tanaman jarak pagar sehat dan satu akar berpenyakit layu fusarium. Sterilisasi bagian tanaman dilakukan secara bertahap dengan merendam NaOCl 1% selama 1 menit dan diulang sebanyak dua kali. Merendam dengan alkohol 70% dan diulang dua kali, kemudian dibilas sebanyak dua kali dengan aquades steril dan dikeringkan pada tisu steril. Bagian tanaman dibelah menggunakan pinset untuk ditumbuhkan dalam media PDA. (Kurnia, dkk 2014)
18 3.4.5 Purifikasi Jamur Hifa jamur yang telah tumbuh dari hasil penanaman sampel jaringan pada medium PDA, diambil dengan menggunakan jarum ose yang telah disterilkan. Setelah itu, hifa diletakkan pada medium PDA steril dalam cawan petri lain lalu ditutup dan diinkubasi pada suhu kamar selama 7 hari (Faidah, dkk 2017). 3.4.6 Identifikasi jamur Jamur yang telah dimurnikan kemudian dilakukan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis yang selanjutnya diidentifikasi berdasarkan panduan buku identifikasi oleh Barnett and Barley (1999). Pengamatan makroskopis meliputi warna koloni, bentuk koloni, tekstur koloni dan pertumbuhan koloni. Sedangkan pengamatan secara mikroskopis antara lain, hifa bersekat atau tidak bersekat, pertumbuhan hifa (beranting atau tidak beranting), warna hifa (gelap atau hialin transparan), warna konidia (gelap atau hialin transparan), ada tidaknya konidia dan warna bentuk konidia (bulat, lonjong, berantai atau tidak beraturan) (Faidah, dkk 2017). 3.4.7 Uji antagonis jamur endofit terhadap patogen Uji antagonis dilakukan dengan pengujian dual culture pada cawan petri yang berisi media PDA, dengan meletakkan patogen dan jamur endofit dalam satu cawan petri. Satu koloni jamur endofit diletakkan 3 cm dari tepi cawan petri, dan koloni patogen diletakkan 3 cm dari tepi cawan petri. Pengamatan uji antagonis dengan cara mengukur jari-jari koloni pada petridish dengan rumus sebagai berikut:
19 I = r1 r2 r1 x 100 % Keterangan : I = Persentase zona penghambat pertumbuhan (%) r1 r2 = Jari-jari patogen yang menjauhi antagonis (cm) = Jari-jari patogen yang mendekati antagonis (cm) Pengamatan selanjutnya yaitu bentuk interaksi yang dilakukan setelah terjadi pertemuan kedua ujung jamur dengan cara mikroskopis, sampel ditaruh pada preparat yang ditetesi dengan methyl blue dan diamati di bawah mikroskop bentuk interaksi antara patogen dan jamur endofit. (Kurnia, dkk 2014) 3.4.8 Uji Postulat Koch Menggunakan Metode Uji Hipovirulesi Uji Hipovirulensi dilakukan dengan menggunakan benih mentimun sebagai tanaman indikator, dikarenakan tanaman mentimun memiliki pertumbuhan kecambah yang cepat dan dapat memberikan respon yang cepat terhadap serangan patogen. Permukaan benih mentimun disterilkan dengan alkohol 70% selama 1 menit, dilanjutkan dengan Clorox 1% selama 30 detik, lalu dibilas aquades sebanyak dua kali, setelah itu dikering anginkan. Media yang digunakan adalah media PDA untuk uji hipovirulensi cendawan, isolat murni ditanam pada media PDA dalam botol kultur dan inkubasi selama 3 hari kemudian tiga benih mentimun ditanam pada tiap-tiap biakan cendawan dan diinkubasi lagi selama 14 hari. Kontrol dibuat dengan menaman kecambah pada media tanpa penambahan cendawan. Perkecambahan benih mentimun diamati setiap hari. Indeks keparahan penyakit pada hasil perkecambahan mentimun
20 dideterminasikan dengan skor individual hasil modifikasi Worosuryani et al. (2006) sebagai berikut: DSI = εn Z Keterangan: DSI = Disease Severity Index (Indeks Keparahan Penyakit) N = Nilai tingkat keparahan penyakit masing-masing individu Z = Jumlah individu yang digunakan Nilai Tingkat keparahan penyakit: 0 = Sehat dan tidak ada infeksi pada hipokotil, 1 = Satu atau dua bercak coklat muda <0.25 cm, 2 = Bercak coklat muda <0.5 cm dan area kebasahan <10% pada hipokotil, 3 = Bercak coklat muda sampai tua >1.0 cm dan kemudian bergabung dengan bercak lainnya dan daerah kebasahan 10%<x<100% pada hipokotil (daun belum layu dan hipokotil masih tegar dan putih) 4 = Hipokotil bercak hitam, daun layu, dan bibit mati. Klasifikasi isolat virulen terdiri atas lima kategori berdasarkan nilai DSI dan gejalanya. Isolat dengan nilai DSI 0-0.3 dikategorikan sebagai isolat tidak virulen atau bersifat hipovirulen. Nilai DSI 0.4-0.9 dengan kategori virulensi rendah, 1-1.9 dengan kategori moderat, 2-2.9 dengan kategori virulen, dan 3-4 dengan kategori sangat virulen (Sneh et al., 2004). Worosuryani et al. (2006) menambahkan isolat yang tidak menyebabkan gejala penyakit atau menunjukkan sedikit gejala (DSI<2.0) pada perkecambahan mentimun dikategorikan sebagai isolat hipovirulen.
21 3.5 Variabel Pengamatan 1. Jenis-jenis jamur Mengetahui jenis-jenis jamur endofit indigenous yang terdapat pada tanaman jarak pagar. 2. Bentuk jamur Mengetahui bentuk-bentuk jamur endofit indigenous yang terdapat pada tanaman jarak pagar. 3. Tekstur jamur Mengetahui bentuk-bentuk jamur endofit indigenous yang terdapat pada tanaman jarak pagar. 4. Warna jamur Mengetahui warna-warna jamur endofit indigenous yang terdapat pada tanaman jarak pagar. 5. Pola sebaran jamur Mengetahui pola sebaran yang dibagi menjadi 2 yaitu radial dan konsentris pada jamur endofit indigenous yang terdapat pada tanaman jarak pagar.