3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2011 sampai Agustus 2011 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan 2, Departemen Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Bioteknologi Molekuler, Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium FKH Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Petanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri asam laktat (BAL) SK(15), SK(16) dan SK(19) yang diisolasi dari produk bekasam ikan seluang, media nutrient agar (NA), nutrient broth (NB), de Mann Rogosa sharpe agar (MRSA), de Mann Rogosa sharpe broth (MRSB), Mueller Hinton agar (MHA), bakteri uji seperti Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium, NaOH, (NH 4 ) 2 SO 4, NaH 2 PO 4, NA 2 HPO 4, aquades, alkohol 70%, fenolftalein, spiritus, millipore filter, kertas ph, kapas, alumunium foil, cling wrap, plastik tahan panas, korek api dan label. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, tabung ulir, botol schott, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet pasteur, pipet mikro, ose, sudip, kompor listrik, kertas buram, rak tabung reaksi, timbangan digital, tabung eppendorf, sentrifuse, spektrofotometer, inkubator, ph meter, holder, syringe, vortex, autoclave, shaker water bath, refrigerator dan clean bench. 3.3 Metode Penelitian Metode penelitian yang dilakukan terdiri atas dua tahap, yaitu (1) penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL, yakni SK(15), SK(16) dan SK(19) dan (2) produksi senyawa antibakteri dari isolat BAL terpilih. Tahap pertama bertujuan untuk menyeleksi isolat BAL yang menghasilkan senyawa antibakteri terbaik. Tahapan ini meliputi kultivasi, pemanenan dan uji aktivitas
17 senyawa antibakteri. Tahap kedua bertujuan untuk menentukan waktu optimum produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih. Tahap ini meliputi kultivasi isolat terpilih, pengukuran kadar asam laktat dan uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih. 3.3.1 Kultivasi Tahap awal kultivasi dilakukan dengan mempersiapkan media pertumbuhan untuk bakteri asam laktat (BAL). Refresh isolat BAL atau proses peremajaan biakan dilakukan dengan menggoreskan isolat BAL dari gliserol ke media MRSA miring dan diinkubasi pada keadaan semi anaerob dengan suhu 37 o C selama 48 jam. Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil 1 ose BAL dari MRSA miring kemudian diinokulasikan dalam 10 ml MRSB. Setelah itu diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37 o C selama 18 jam hingga OD 660 inokulum mencapai 0,6-0,8. Sebanyak 10% inokulum diinokulasikan dalam medium produksi (MRSB) dengan volume kerja 90 ml dalam botol schott. Kemudian media MRSB tersebut diinkubasi dengan water bath shaker pada suhu 37 o C selama 24 jam. Pegamatan yang dilakukan adalah pengukuran ph dan OD awal (sebelum inkubasi dengan shaker water bath) dan pengukuran ph dan OD akhir (setelah diinkubasi selama 24 jam). 3.3.2 Pemanenan Setelah kultur diinkubasi selama 24 jam dilakukan tahap pemanenan. Kultur disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4 o C selama 15 menit. Proses sentrifugasi akan menghasilkan pemisahan antara supernatan dan biomassa. Supernatan tersebut kemudian diberi tiga perlakuan, yaitu (1) tanpa dinetralkan, (2) dinetralkan dengan NaOH 1 N dan (3) dinetralkan kemudian diendapkan dengan (NH 4 ) 2 SO 4 sebesar 50%. Tahap purifikasi parsial bakteriosin (presipitasi protein) ini akan menghasilkan ekstrak endapan (Purwanti 2003). Kemudian supernatan dengan perlakuan (1) dan (2) difiltrasi dengan menggunakan milipore filter dengan ukuran pori 0,2 µm sehingga diperoleh supernatan bebas sel. Supernatan pada perlakuan (3) diendapkan selama 24 jam dalam refrigerator. Supernatan tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4 o C selama 30 menit. Kemudian endapan
18 yang diperoleh dilarutkan dengan larutan buffer fosfat 0,1 M dengan ph 7 (Lampiran 1). Penambahan substrat kasar bakteriosin dengan buffer fosfat bertujuan agar mengurangi bahan pengekstrak yang terikat pada molekul protein (Wijaya 2002 diacu dalam Magdalena 2009). 3.3.3 Uji aktivitas senyawa antibakteri Isolat bakteri uji berupa Listeria monocytogenes, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium disegarkan kembali dalam media NA miring selama 18.jam. Kemudian bakteri indikator diinokulasi dalam 10 ml NB dan diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37 o C selama 18 jam. Sebanyak 20 µl bakteri uji dengan OD 0,6-0,8 dipindahkan ke dalam 20 ml media MHA cair dengan suhu media 40 o C. Campuran media MHA cair dan bakteri uji dituangkan ke dalam cawan petri steril. Uji potensi senyawa antibakteri dari bakteri asam laktat dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur agar (agar well diffusion). Media agar yang telah padat dibuat sumur dengan menggunakan pipet Pasteur steril berdiameter 5 mm. Kemudian sebanyak 50 µl supernatan steril dimasukkan ke dalam masing-masing sumur yang telah dibuat, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kemudian dilakukan pengukuran diameter zona bening pada masing-masing bakteri indikator. Zona bening yang dihasilkan di sekeliling sumur menunjukkan adanya daya hambat. Areal penghambatan diukur berdasarkan diameter areal bening yang terbentuk di sekitar sumur (Hilmi dan Yusuf 2000 diacu dalam Nurmalis 2008). Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 2.
19 Isolat BAL Refresh isolat BAL dalam MRSA, inkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam Inokulasi dalam 10 ml MRSB, shaker pada suhu 37 o C selama 18 jam Kultivasi dalam 90 ml MRSB, shaker pada suhu 37 o C selama 24 jam; ukur OD dan ph (awal dan akhir kultivasi) Kultur disentifugasi 10.000 rpm pada suhu 4 o C selama 15 menit Biomassa Supernatan Tidak dinetralkan Dinetralkan dengan NaOH Dinetralkan dengan NaOH dan diendapkan dengan (NH 4 ) 2 SO 4 50% Filtrasi dengan millipore filter Supernatan aktif asam (A) Filtrasi dengan millipore filter Supernatan aktif setelah dinetralkan (N) Uji aktivitas senyawa antibakteri Sentifugasi 10.000 rpm suhu 4 o C; 30 menit Endapan ditambahkan larutan buffer fosfat Supernatan aktif hasil pengendapan (E) Gambar 2 Diagram alir penapisan senyawa antibakteri dari tiga isolat BAL yang berbeda.
20 3.3.4 Kultivasi isolat terpilih Tahap awal produksi senyawa antibakteri dari isolat BAL terpilih dilakukan dengan melakukan refresh isolat BAL terpilih atau proses peremajaan biakan. Proses ini dilakukan dengan menggoreskan isolat BAL dari gliserol ke media MRSA miring dan diinkubasi pada keadaan semi anaerob dengan suhu 37 o C selama 48 jam. Kemudian dilakukan pembuatan inokulum dengan mengambil 1 ose BAL dari MRSA miring dan diinokulasikan dalam 30 ml MRSB. Setelah itu diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37 o C selama 18 jam hingga OD 660 inokulum mencapai 0,6-0,8. Sebanyak 10% inokulum diinokulasikan dalam 22 buah tabung ulir berisi medium produksi (MRSB) dengan volume kerja 12 ml. Kemudian media MRSB tersebut diinkubasi dengan shaker water bath pada suhu 37 o C. Pegamatan yang dilakukan adalah pengukuran ph dan OD per 4 jam selama 48 jam. Kultur yang telah diamati tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4 o C selama 15 menit. Proses sentrifugasi akan menghasilkan supernatan. Supernatan tersebut kemudian difiltrasi dengan menggunakan millipore filter berukuran pori 0,2 µm. 3.3.5 Pengukuran kadar asam laktat Kadar asam laktat pada supernatan BAL diuji dengan metode analisis total asam tertitrasi. Dalam penentuan kadar asam laktat digunakan larutan baku standar NaOH 0,1091 N dari indikator fenolftalein. Masing-masing supernatan dilarutkan dengan pewarna fenolftalein, kemudian dititrasi dengan menggunakan NaOH hingga warna larutan supernatan berubah menjadi kemerahan. Adanya aktivitas bakteri asam laktat selama proses produksi memungkinkan kandungan asam laktatnya meningkat. Adapun pengukuran kadar asam laktat dapat dihitung dengan menggunakan rumus: % Asam laktat = V NaOH x N NaOH x 90 x FP x 100% Keterangan: Bobot Sampel V NaOH : Volume NaOH yang terpakai (ml) N NaOH : Normalitas NaOH yang terukur (0,1091 N) FP : Faktor Pengencer (1) Bobot sampel : Bobot sampel yang terukur (1000 mg)
21 3.3.6 Uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih Uji aktivitas senyawa antibakteri dari isolat terpilih dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur agar (agar well diffusion), sama halnya dengan pengujian pada tahap penapisan senyawa antibakteri. Namun, terdapat empat bakteri yang diujikan, yaitu Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhimurium. Pengukuran diameter zona bening dilakukan per waktu produksi pada masing-masing bakteri uji. Diagram alir produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih dapat dilihat pada Gambar 3. Isolat BAL Refresh isolat BAL dalam MRSA, inkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam Inokulasi dalam 30 ml MRSB, shaker pada suhu 37 o C selama 18 jam Kultivasi dalam MRSB, shaker pada suhu 37 o C selama 24 jam; ukur OD dan ph per 4 jam selama 48 jam Kultur disentifugasi 10.000 rpm pada suhu 4 o C selama 15 menit Biomassa Supernatan Pengukuran kadar asam laktat Uji aktivitas senyawa antibakteri Gambar 3 Diagram alir produksi senyawa antibakteri dari isolat terpilih.