3. METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2008 sampai bulan Januari 2009 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratourium Mikrobiologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, dan Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor. 3.2. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan pada persiapan sampel antara lain cool box, pisau, talenan, timbangan digital, dan kertas label. Alat-alat untuk ekstraksi sampel antara lain timbangan digital, gelas ukur, labu erlenmeyer, sudip kaca, kertas label, corong kaca, nilon mess, pipet tetes, kertas saring whatman, aluminium foil, dan kapas steril. Alat-alat untuk evaporasi ekstrak antara lain vacuum rotary evaporator, dan botol steril. Alat-alat untuk uji aktivitas antibakteri antara lain tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, pipet volumetrik, bulp, autoklaf, jarum ose, bunsen, inkubator, vorteks, cawan petri, dan paper disc. Bahan yang digunakan sebagai sampel adalah kerang hijau (Perna viridis). Bahan yang dibutuhkan selama transportasi sampel dari tempat pelelangan ikan hingga laboratorium adalah es curai dan air. Bahan untuk ekstraksi antara lain pelarut teknis (n-heksana, etil asetat dan metanol). Bahan untuk analisis fitokimia antara lain kloroform, metanol, kloroform-amoniak, H 2 SO 4 2M, ragen Degendorf, reagen Mayer, reagen Wagner, NaOH 10%, H 2 SO 4 pekat, etanol, eter, pereaksi Lieberman Buchard, aquades, FeCl 3 1%. Sedangkan bahan untuk uji aktivitas antibakteri adalah kloramfenikol sebagai antibakteri standar, bakteri uji (Escherichia coli dan Staphylococcus aureus), media NB (Nutrient Broth), media Mueller Hinton Agar (MHA), korek api, spiritus, dan alkohol 70%. 3.3. Metode Kerja Penelitian ini terdiri dari dua tahap, tahap satu yaitu analisis proksimat (analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan karbohidrat),
ekstraksi senyawa bioaktif dan uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar kerang hijau, sedangkan tahap dua, yaitu analisis fitokimia. 3.3.1. Penelitian tahap satu 3.3.1.1.Analisis proksimat Analisis proksimat ini dilakukan untuk mengetahui kandungan gizi dari kerang hijau. Pengujian yang dilakukan antara lain adalah analisis kadar air, kadar abu, kadar lemak, kadar protein dan kadar karbohidrat (by difference) a. Analisis kadar air (AOAC 1995) Cawan kosong yang digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit atau sampai diperoleh berat tetap, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel kira-kira sebanyak 5 gram ditimbang dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan dalam oven selama 24 jam pada suhu 105 0 C. Cawan kemudian didinginkan dalam dasikator dan setelah dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: B1- B2 % Kadar air 100% B Keterangan : B = Berat sampel (gram) B1 = Berat (sampel + cawan) sebelum dikeringkan B2 = Berat (sampel + cawan) setelah dikeringkan b. Analisis kadar abu (AOAC 1995) Pengukuran kadar abu ditentukan dengan alat tanur. Cawan porselin dipanaskan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 5 gram sampel dimasukkan dalam cawan porselin lalu dibakar sampai tidak berasap lagi lalu diabukan dalam tanur suhu 600 0 C sampai berwarna putih (semua sampel menjadi abu) dan berat konstan. Hasil pembakaran tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Perhitungan kadar abu adalah sebagai berikut: Berat abu (g) % Kadar abu 100% Berat sampel(g)
c. Analisis kadar protein (AOAC 1995) Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram lalu dimasukkan ke dalam labu kjeldal. Setelah itu ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 dan pelet kjeldal kemudian sampel didihkan dalam ruang asam sampai cairan jernih. Larutan jernih ini lalu dipindahkan ke dalam labu ukur 100 ml. Labu kjeldal dibilas dengan aquades (1-2 ml) kemudian air bilasan dimasukkan ke dalam labu ukur, kemudian diencerkan dengan aquades hingga 100 ml. Sampel yang telah diencerkan dengan aquades dipipet sebanyak 10 ml dan dimasukkan dalam alat destilasi, kemudian ditambahkan sedikit demi sedikit NaOH 40% sebanyak 10 ml. Ujung tabung kondensor alat destilasi harus terendam dalam erlenmeyer yang berisi larutan asam borat (H 3 BO 3 ) 4%. Dilakukan pemanasan alat destilasi hingga larutan asam borat yang semula berwarna merah muda menjadi berwarna kehijau-hijauan. Selang kondensor kemudian dibilas dengan beberapa ml aquades untuk menghindari kemungkinan adanya nitrogen yang menempel pada selang. Setelah itu Erlenmeyer berisi larutan asam borat (H 3 BO 3 ) yang telah menangkap nitrogen dari sampel, dititrasi dengan HCl 0,1 N hingga terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Titrasi juga dilakukan terhadap larutan blanko. (ml sampel - ml HCl blanko) N HCl 14,007 % N 100% Berat sampel % Protein % N 6,25 d. Analisis kadar lemak (AOAC 1995) Metode yang digunakan dalam analisis lemak adalah metode ekstraksi soxhlet. Sampel sebanyak 5 gram dibungkus dengan kertas saring, setelah itu kertas saring yang berisi contoh tersebut dimasukkan dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondensor diletakkan diatasnya dan labu lemak diletakkan dibawahnya. Pelarut hexana dimasukkan ke dalam labu lemak secukupnya. Selanjutnya dilakukan refluks selama minimal 5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke dalam labu lemak berwarna jernih.
Pelarut yang ada dalam labu lemak didestilasi, dan pelarut ditampung kembali. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 0 C hingga mencapai berat tetap dan setelah itu didinginkan dalam desikator. Selanjutnya labu beserta lemak didalamnya ditimbang dan berat lemak dapat diketahui. Berat lemak (g) % Kadar lemak 100% Berat sampel (g) e. Analisis kadar karbohidrat (AOAC 1995) Analisis kadar karbohidrat dilakukan secara by different, yaitu dengan menggunakan rumus: Kadar karbohidra t 100% - K.lemak - K.protein - K.air - K.abu 3.3.1.2. Ekstraksi senyawa bioaktif (modifikasi Quinn 1988 dalam Jamaluddin 2005) Tahapan proses ekstraksi kerang hijau meliputi penghancuran sampel, maserasi, penyaringan dan evaporasi. Metode yang digunakan dalam pembuatan ekstrak senyawa bioaktif dari kerang hijau (Perna viridis) adalah metode ekstraksi bertingkat yang telah dimodifikasi. Sebelumnya kerang dipisahkan dari cangkangnya, dicuci dan dicacah. Sampel yang telah dihancurkan kemudian ditimbang sebanyak 200 gram dan dimasukkan dalam erlenmeyer kemudian dimaserasi dengan pelarut sebanyak 400 ml (perbandingan 1:2 (w/v)). Pelarut yang digunakan secara berturut-turut yaitu n-hexana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Pertama, sampel dimaserasi dengan n-hexana selama 24 jam pada suhu ruang. Hasil maserasi disaring menggunakan nilon mess sebagai saringan kasar, selanjutnya penyaringan dengan corong kaca dan kertas saring whatman untuk memisahkan filtrat dengan residu I. Residu I kemudian dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama 24 jam, disaring sehingga diperoleh filtrat etil asetat dan residu II. Residu II selanjutnya dimaserasi dengan pelarut metanol selama 24 jam, disaring sehingga diperoleh filtrat metanol dan residu III. Filtrat n-hexana, etil asetat dan metanol yang diperoleh disimpan dalam refrigerator selanjutnya dievaporasi dengan menggunakan vacuum rotary
evaporator pada suhu 30 0 C, sehingga diperoleh ekstrak kasar n-hexana, etil asetat dan metanol. Ekstrak yang diperoleh dimasukkan dalam botol steril untuk mencegah kontaminasi kemudian disimpan dalam freezer. Tahapan proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 8. Kerang hijau Pemisahan dari cangkang Pencucian Pencacahan Penimbangan maserasi dengan heksana (24 jam) Penyaringan Filtrat heksana Residu I Evaporasi maserasi dengan etil asetat (24 jam) Crude extract heksana Penyaringan Filtrat heksana Residu I Evaporasi maserasi dengan metanol (24 jam) Crude extract etil asetat Penyaringan Filtrat heksana Residu III Evaporasi Crude extract Metanol Gambar 8. Tahapan proses ekstraksi (modifikasi Quinn 1988 diacu dalam Jamaluddin 2005)
3.3.1.3.Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar kerang hijau (Perna viridis) (modifikasi Noer & Nurhayati 2006) Uji aktivitas antibakteri dilakukan terhadap ekstrak kerang hijau (Perna viridis). Uji ini meliputi persiapan media cair, persiapan media padat dan prosedur uji aktivitas antibakteri. Bakteri uji yang digunakan adalah Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan kertas cakram (paper disc). a) Persiapan media cair Penyegaran bakteri uji, yaitu E. coli dan S. aureus dilakukan pada media nutrient broth. Media nutrient broth dibuat dari 2,6 gram media NB bubuk yang dilarutkan dalam aquades hingga volume 200 ml, selanjutnya dipanaskan hingga mendidih. NB dipipet sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Setelah itu media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang. b) Persiapan suspensi bakteri Sebanyak 1 ose bakteri uji dimasukkan ke dalam media cair yang telah dingin secara aseptik. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 18 jam. c) Persiapan media padat Media padat yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah media Mueller Hinton Agar (MHA). MHA dibuat dari 12,16 gram media MHA bubuk yang dilarutkan dengan aquades hingga volume 320 ml, selanjutnya dipanaskan hingga mendidih. Larutan dipipet 20 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil steril. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Media didiamkan pada suhu ruang sampai agar membeku. Setelah membeku, media disimpan dalam refrigerator. d) Uji pendahuluan aktivitas antibakteri (modifikasi Noer & Nurhayati 2006) Sebanyak 20 ml media MHA dalam keadaan cair, ditambah dengan 20 µl bakteri uji yang telah diukur Optical Density (OD) pada λ= 600 nm.
(OD masing-masing bakteri uji antara lain 0,788 untuk bakteri E.coli dan 0,723 untuk bakteri S. Aureus). Agar yang telah ditambah dengan bakteri uji dihomogenkan dengan vorteks, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar bakteri lebih menyebar secara merata. Media agar tersebut didiamkan pada suhu ruang selama 15 menit atau sampai agar membeku. Ekstrak kerang hijau yang digunakan adalah ekstrak n-hexana, etil asetat, dan metanol. Dalam penentuan aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi, setiap paper disc diberi ekstrak sebanyak 20 µl dengan konsentrasi 5 % (5 mg ekstrak yang dilarutkan dalam 1 ml metanol). Setelah seluruh pelarut ekstrak pada paper disc menguap, masing-masing paper disc diletakkan dalam cawan petri yang telah berisi agar dan bakteri, kemudian cawan petri disimpan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 37 0 C selama 18-20 jam. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan mengamati zona hambatan yang terbentuk disekeliling paper disc. Antibakteri dikatakan positif apabila terbentuk zona hambatan berupa zona bening disekeliling paper disc dan antibakteri negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening. Metode uji penapisan awal senyawa antibakteri dapat dilihat pada Gambar 9. e) Prosedur pengujian aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak (modifikasi Darusman et al. 1994) Media MHA sebanyak 20 ml dalam keadaan cair ditambahkan dengan 20 µl bakteri uji yang telah diukur Optical Density (OD)nya pada λ= 600 nm, (OD masing-masing bakteri uji antara lain 0,797 untuk bakteri E. coli dan 0,748 untuk bakteri S. Aureus) kemudian divorteks sebentar agar homogen dan segera dituangkan ke dalam cawan petri steril lalu digoyangkan membentuk angka 8 agar bakteri menyebar secara merata. Media tersebut didiamkan pada suhu ruang selama beberapa saar agar membeku. Ekstrak kerang hijau yang digunakan merupakan ekstrak yang memiliki aktivitas paling baik pada pengujian awal. Dalam penetuan aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak, setiap paper disc diberi ekstrak dengan konsentrasi 3,5 mg/ml, 5 mg/ml, 6,5 mg/ml, dan 8 mg/ml (modifikasi Darusman et al. 1994) sebanyak 20 µl. Paper disc dibiarkan sampai
mengering atau pelarutnya menguap, kemudian masing-masing paper disc diletakkan dalam cawan petri berisi agar dan bakteri yang telah membeku, kemudian disimpan kedalam inkubator dalam keadaan terbalik selama 18-20 jam pada suhu 37 0 C. Metode uji aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak dapat dilihat pada Gambar 10. Kemudian dilakukan pengamatan dan pengukuran zona bening yang terbentuk. Bakteri uji Penginokulasian bakteri 20 µl dalam 20 ml media MHA Penghomogenan dengan vorteks Penuangan agar ke dalam cawan petri steril Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku Pemberian 20 µl ekstrak pada paper disc dengan konsentrasi 5 mg/ml Peletakkan paper disc ke dalam cawan yang telah berisi bakteri uji Inkubasi pada suhu 37 0 C selama 18-20 jam dalam posisi terbalik Zona bening Pengamatan dan pengukuran zona bening Gambar 9. Tahapan uji penapisan awal antibakteri (modifikasi Noer & Nurhayati 2006 )
Bakteri uji Penginokulasian bakteri (20 µl) dalam 20 ml media agar Penghomogenan dengan vorteks Penuangan agar ke dalam cawan petri steril Pendinginan selama 15 menit atau sampai agar membeku Pemberian paper disc ekstrak 20 µl dengan konsentrasi, 3,5 mg/ml, 5 mg/ml, 6,5 mg/ml, 8 mg/ml Peletakkan paper disc kedalam cawan yang telah berisi bakteri uji Inkubasi pada suhu 37 0 C selama 18-20 jam dalam posisi terbalik Zona bening Pengamatan dan pengukuran zona bening Gambar 10. Tahapan uji aktivitas antibakteri pada berbagai konsentrasi ekstrak (modifikasi Darusman et al 1994) f) Pengukuran zona hambat Aktivitas antibakteri dinyatakan positif apabila terbentuk zona hambat berupa zona bening disekeliling paper disc dan aktivitas antibakteri dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan : Zona hambat A - B A = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm) B = Diameter kertas cakram (mm) 3.3.1. Penelitian tahap dua 3.3.2.1. Analisis fitokimia Identifikasi senyawa kimia yang berperan sebagai antibakteri dalam kerang hijau (Perna viridis) dilakukan terhadap senyawa-senyawa sebagai berikut (Harborne 1987): a) Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah sampai jingga dengan pereaksi Dragendorff. b) Steroid/Triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Ke dalamnya ditambahkan 10 tetes anhidrida asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif. c) Fenol/Flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37 % dan etanol 95 % dengan volume sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.