BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pengolahan Makanan dan Laboratorium Uji Organoleptik Departemen Gizi Masyarakat FEMA IPB, serta Laboratorium Hewan Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan Depkes Bogor. Waktu Uji Organoleptik dilaksanakan pada tgl 1 sampai 4 Januari 2008, sedangkan penelitian utama (in-vivo) dilaksanakan pada tanggal 5 Mei sampai 21 Juni 2008. Bahan dan alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun teh Klon Gambung 7 dan Klon Gambung 9 non oksidasi enzimatis (non oksimatis atau tanpa fermentasi) dan daun murbei varietas Kanva non oksidasi enzimatis (non oksimatis atau tanpa fermentasi) dan Multikaulis oksidasi enzimatis (oksimatis atau fermentasi), bubuk jahe merah, asam jawa, air dan gula pasir. Penelitian utama menggunakan hewan percobaan tikus putih jenis Spraque Dawley (SD), jenis kelamin jantan, usia 1,5 bulan sampai 2 bulan, berat badan berkisar antara 75 gram sampai 105 gram. Bahan makanan yang diberikan kepada tikus adalah makanan standar berdasarkan Pusat Penelitian Pengembangan Gizi dan Makanan Depkes (Lampiran 1). Selain itu digunakan juga bahan untuk analisis ELISA yang menyangkut larutan pereaksi antara lain Coating Buffer, Larutan Stock PBS (Phosphatese Buffer Saline. ph = 7.0), Larutan Blocking, Larutan Pencuci, Larutan Substrat-Pewarna, dan Stoping Solution. Untuk lebih jelasnya prosedur kerja analisis ELISA dapat dilihat pada Lampiran 2. Alat yang digunakan yaitu alat-alat untuk proses pembuatan teh, dan alat-alat untuk uji organoleptik, alat untuk uji ELISA, alat-alat pemeliharaan tikus (seperti kandang, tempat air minum, dan lain-lain), serta alat cekok tikus (dapat dilihat pada Lampiran 3 dan Lampiran 4). Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan percobaan di laboratorium. Penelitian ini merupakan sebagian dari penelitian KKP3T dan Deptan, lanjutan dari Damayanthi dkk. (2007). Pada penelitian Damayanthi dkk. (2007) mendapatkan tiga kombinasi produk teh
34 Camellia-murbei terbaik berdasarkan mutu SNI 01-3845-1995 tentang teh hijau dan teh hitam. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Pada penelitian pendahuluan dipilih dua kombinasi produk teh terbaik yaitu Kanva non oksidasi enzimatis + teh klon Gambung 9 non oksidasi enzimatis dan Multikaulis oksidasi enzimatis + teh klon gambung 7 non oksidasi enzimatis, dilakukan penambahan bubuk jahe merah dan asam jawa, kemudian ditentukan satu produk minuman teh Camellia-murbei terbaik secara organoleptik. Penelitian tahap kedua (utama) yaitu pemberian produk terbaik yang didapat pada penelitian pendahuluan kepada tikus percobaan untuk kemudian dilihat perubahan sekresi imunoglubulin G (IgG) total serum tikus. Pemberian minuman teh terbaik kepada tikus percobaan dilakukan dengan bantuan sonde lambung. Pada tahap kedua ini pemberian minuman teh Camellia-murbei juga dibandingkan dengan kontrol. Langkah-langkah penelitian dapat dilihat pada (Gambar 6). Penelitian Pendahuluan Penelitian Pendahuluan meliputi beberapa tahap, yaitu (1) Pembuatan bubuk jahe merah dan asam jawa; (2) Pembuatan larutan gula; (3) Pembuatan minuman teh Camellia-murbei dengan bubuk jahe merah dan asam jawa dengan mengikuti Ratiningsih (2003); (4) Uji organoleptik formula teh Camellia-murbei yang diperoleh pada tahap 3 dan penentuan teh Camellia-murbei terbaik. 1. Proses Pembuatan Bubuk Jahe dan Asam Jawa Jahe yang dipakai yaitu jenis jahe merah. Pembuatan bubuk jahe dimulai dari pembuatan simplisia jahe, dengan mengikuti prosedur yang dilakukan Balittro yang dimodifikasi. Jahe direndam dalam air semalam untuk mempermudah pelepasan tanah yang menempel. Kemudian dicuci dengan air bersih dan diiris tipis dengan ketebalan 3 mm sampai 4 mm. Irisan kemudian dijemur dengan menggunakan alas dari bambu/tampah bambu, sampai kadar air mencapai 8% sampai 10%, perlu dijaga agar irisan rimpang tidak menumpuk. Penjemuran dilakukan dengan menggunakan sinar matahari selama 3 hari sampai 4 hari dengan menutup irisan rimpang jahe dengan kain hitam agar kadar minyak atsirinya tidak hilang waktu penjemuran.
35 Simplisia jahe merah yang sudah kering digiling, sesuai dengan ukuran kehalusan yang dibutuhkan yaitu 30 mesh sampai 60 mesh. Bubuk jahe yang dipakai dalam penelitian ini ádalah 40 mesh. Banyaknya bubuk jahe merah yang dipakai berdasarkan prosedur yang dipakai oleh Ratiningsih 2003 yaitu sebanyak 10% dari jumlah total teh seduh dan teh celup. Adapun prosedur pembuatan bubuk jahe mengikuti prosedur dari Balittro (Gambar 7). Teh Terbaik I (Kanva Non Oksimatis + Gambung 9 Non Oksimatis) Teh terbaik II (Multikaulis Oksimatis + Gambung 7 non oksimatis ) Bubuk Jahe merah + Asam jawa ( 10% + 6 % ) Bubuk Jahe merah + Asam jawa ( 10% + 6%) Curah Celup Curah Celup Seduh dengan air panas suhu 80 sampai 90 0 C selama 3 sampai 5 menit lalu di saring Larutan Gula pasir 64%(b/v) sebanyak 20% (v/v) Minuman Teh Camellia-murbei + Jahe Asam Uji organoleptik (30 orang panelis ) Minuman( teh Camellia-murbei + jahe asam) terbaik Control Air Putih Biasa Teh Hitam 3 gr/250 ml air Teh Hitam 6 gr/250 ml air Teh Hitam 9 gr/250ml air Teh Hitam 12 gr/250 ml air Uji respon imun tikus
36 Gambar 6 Langkah-langkah penelitian Asam Jawa yang digunakan adalah daging buah asam yang berwarna kuning kecoklatan. Daging buah yang telah dipisahkan dari bijinya, dikeringkan dengan cara dijemur panas matahari selama ± 6 jam. Jumlah asam jawa yang dipakai dalam penelitian ini adalah 6% dari total teh seduh dan celup berdasarkan Ratiningsih (2003). 2. Pembuatan larutan gula Pembuatan larutan gula dengan cara memanaskan air sampai suhu 70 o C sampai 80 o C, selanjutnya ditambahkan gula pasir dengan konsentrasi 64% (b/v) dilarutkan sambil diaduk hingga semua gula larut. Kemudian dilakukan penyaringan dengan kain saring, dan ditempatkan dalam wadah tertutup dan siap untuk proses selanjutnya. Rimpang jahe segar Disortir/ambil yang utuh Rendam air dingin dan cuci bersih Iris Tipis 3 sampai 4 mm Jemur dalam oven + sinar Matahari 3 sampai 4 hr (kadar air 8 sampai 10%) Giling Halus (30 sampai 60 mesh) Bubuk Jahe Gambar 7 Skema pembuatan bubuk jahe (Balittro 2007). 3. Pembuatan minuman teh Camellia-murbei dengan penambahan bubuk jahe dan asam jawa Setelah semua bahan baku disiapkan dan tersedia, selanjutnya dilakukan pembuatan minuman teh dengan mengikuti hasil terbaik dari Ratiningsih (2003),
37 yaitu menggunakan bubuk jahe sebanyak 0,3 gram (10%), sedangkan asam jawa sebanyak 0.18 gram (6%), bubuk teh sebanyak 2,52 gram (84%) dari jumlah total kemasan 3 gram (100%). Formula minuman ini diseduh dengan air panas 80 o C sampai 90 o C mencapai volume 200 ml, kemudian ditutup dan dibiarkan selama 3 menit. Kemudian ditambahkan larutan gula sebanyak 20% (v/v), diaduk dan disaring. Minuman teh yang dibuat disajikan pada Tabel 8. Setelah itu dilakukan uji organoleptik untuk melihat tingkat kesukaan panelis terhadap minuman teh, sehingga didapatkan satu formula minuman teh Camellia-murbei terbaik. Penilaian dilakukan terhadap tiga parameter yaitu warna, rasa dan aroma. Lembar penilaian organoleptik dapat dilihat pada Lampiran 5, sedangkan respon penilain panelis terhadap warna, rasa dan aroma minuman teh dapat dilihat pada Lampiran 6. Tabel 8 Minuman teh Camellia-murbei dengan bubuk jahe dan asam jawa. Kode Air Total sampel (200 ml) Larutan Bubuk Teh 84%(b/v) Bubuk jahe 10%(b/v) Asam jawa 6%(b/v) Total (gr) 100% Larutan Gula (20% v/v) A 2,52 0,3 0,18 3 200 50 ml 250 ml B 2,52 0,3 0,18 3 200 50 ml 250 ml C 2,52 0,3 0,18 3 200 50 ml 250 ml D 2,52 0,3 0,18 3 200 50 ml 250 ml Keterangan : A = Multikaulis oksidasi enzimatis + Gambung 7 non oksidasi enzimatis (Curah) B = Multikaulis oksidasi enzimatis + Gambung 7 non oksidasi enzimatis (Celup) C = Kanva non oksidasi enzimatis + Gambung 9 non oksidasi enzimatis (Curah) D = Kanva non oksidasi enzimatis + Gambung 9 non oksidasi enzimatis (Celup) 4. Uji Organoleptik Uji organoleptik terhadap minuman teh Camellia-murbei yang dilakukan adalah uji kesukaan (hedonik) yang meliputi penilaian terhadap warna, aroma dan rasa seduhan teh. Panelis yang digunakan ádalah panelis semi terlatih sebanyak 30 orang yang terdiri dari mahasiswa S1 dan S2 GMK. Pengujian dilakukan dengan dua kali ulangan yang dilakukan pada pagi (jam 10.00) dan sore (jam 16.00). Uji kesukaan menggunakan skoring 1 sampai 5, dimana 1 = sangat tidak suka; 2 = tidak suka; 3 = biasa; 4 = suka; 5 = sangat suka. Selanjutnya minuman teh terbaik diberikan kepada tikus pada penelitian utama.
38 Penelitian Utama Pada penelitian utama dilakukan pemberian minuman teh Camellia-murbei terpilih kepada tikus dengan bantuan sonde lambung selama 4 minggu. Kemudian dilihat sekresi imunoglubulin G (IgG) serum total, dengan membandingkan antara pemberian teh dan kontol (air putih). Pada hari kedelapan semua tikus diberi suntikan Tetanus Toksoid (TT) sebanyak 0,1 ml, yang berguna untuk membangkitkan respon imun pada tikus. Menurut Depkes (2000), imunisasi bertujuan untuk meningkatkan kekebalan tubuh, imunisasi TT sudah dinyatakan aman untuk Indonesia (Depkes 2000). Pemberian teh sebelum dilakukan penyuntikan TT bertujuan agar tikus dibiasakan minum teh, hal yang sama juga dilakukan oleh peneliti sebelumnya Susilaningsih (2002). Pengambilan darah tikus dilakukan dua kali yaitu sebelum dan sesudah pemberian teh. Pengambilan darah sebelum pemberian teh dilakukan pada 5 ekor tikus yang diambil secara acak pada semua tikus. Pengambilan darah sesudah pemberian teh dilakukan dengan mengambil 2 ekor tikus secara acak pada setiap kelompok. Pengambilan darah sebanyak 5 ml dilakukan pada jantung tikus, dengan menggunakan jarum steril dengan sekali pakai oleh petugas laboratorium. Selanjutnya darah dimasukkan kedalam tabung sentrifuse untuk memisahkan serum dengan plasma, alat yang digunakan untuk memisahkan darah adalah refrigerated sentrifuge pada suhu - 4 0 C. Kemudian serum disimpan pada suhu -70 0 C sebelum dilakukan uji ELISA. Persiapan dan Perlakuan Hewan Percobaan mengikuti Sobariah (2007). Hewan percobaan menggunakan tikus putih Spraque Dawley (SD), dengan persyaratan: tikus harus sehat, usia lebih kurang 6 minggu sampai 8 minggu (1,5 sampai 2 bulan) dengan berat badan berkisar antara 75 gram sampai 105 gram sebanyak 30 ekor. Hewan percobaan ini diperoleh dari Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan Depkes Bogor. Setelah siap sejumlah tikus dengan kriteria yang diinginkan kemudian ditempatkan pada kandang per individu, diadaptasi selama 7 hari dan diberikan ransum standar berdasarkan Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan Depkes Bogor. Pemberian ransum selama adaptasi (7 hari) diberikan secara ad libitum (sekitar 10% dari rerata berat tikus), untuk mendapatkan jumlah
39 porsi yang dapat dihabiskan oleh tikus sebagai acuan untuk pemberian pakan pada masa pemberian teh, penggantian ransum dilakukan setiap hari. Setelah adaptasi selama 7 hari hewan coba diambil 5 ekor secara acak, dan diambil darahnya dan dianalisa IgGnya sebagai data IgG awal, kemudian sisa hewan sebanyak 25 ekor dibagi menjadi 5 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Sebelum tikus percobaan dikelompokkan, terlebih dahulu dilakukan seleksi berdasarkan berat badan, sehingga rata-rata variasi berat badan didapat antar kelompok lebih kurang 5 gram dan variasi berat badan dalam satu kelompok lebih kurang 10 gram. Pada hari kedelapan semua tikus disuntik dengan Tetenus Toksoid (TT), disamping diberikan ransum standar, juga diberikan minuman teh Camelliamurbei sebanyak 1 ml/100 gr bb tikus/kali pemberian. Teh Camellia-murbei yang diberikan dengan kekentalan yang berbeda yaitu 3 gram teh/250 ml air, 6 gram teh/250 ml air, 9 gram teh/250 ml air dan 12 gram teh/250 ml air (Susilaningsih 2002). Pemberian minuman dilakukan dengan cara dicekokkan menggunakan sonde lambung agar dapat dipastikan minuman habis. Pemberian teh dilakukan dua kali sehari yaitu pagi dan sore hari dengan pertimbangan jumlah volume minuman maksimun yang dapat diterima tikus dalam satu kali minum yaitu 2,5 ml. Berat tikus ditimbang setiap 2 hari sekali untuk memantau pertambahan berat badan tikus. Pemberian teh dilaksanakan selama 4 minggu. Kandang tikus dibersihkan setiap hari dengan tujuan untuk menjaga kebersihan dan kesehatan tikus. Pengujian kadar immunoglubulin G (IgG) dilakukan setelah hari ke-14 (minggu ke 2) dan setelah hari ke-28 (minggu ke 4). Tikus diambil secara acak dalam setiap kelompok sebanyak dua ekor per kelompok, kemudian tikus diambil darahnya (dari jantung) dengan membius dan membedah tikus. Kemudian kumpulan sampel darah dimasukkan kedalam tabung sentrifuse dan langsung di bawa ke laboratorium untuk dilakukan pemisahan serum dan plasma. Selanjutnya serum disimpan dalam suhu -70 0 C sebelum dilakukan uji ELISA. Rancangan Penelitian Pengolahan dan Analisis Data
40 Rancangan penelitian yang digunakan pada penentuan minuman teh terbaik yang akan diberikan kepada tikus adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial. Pada penelitian ini terdapat dua jenis formula minuman teh Camelliamurbei, dengan dua perlakuan yaitu teh kering curah dan celup. Masing-masing teh dengan oksidasi enzimatis dan non oksidasi enzimatis. Perlakuan yang diberikan adalah : A. Bentuk teh kering, terdiri dari : A1 = teh curah kering, A2 = teh celup B. Reaksi oksidasi enzimatis, terdiri dari : B1 = non reaksi oksidasi enzimatis, dan B2 = reaksi oksidasi enzimatis penuh. Desain rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial, sehingga jumlah sampel adalah = 2 bentuk teh kering x 2 reaksi oksidasi enzimatik = 4 satuan percobaan. Model linier yang digunakan adalah Yij = µ + αi + βj + (αβij) + εij Keterangan : Yij = nilai pengamatan pada bentuk teh kering ke-i, reaksi oksidasi enzimatis ke-j. µ = nilai rata-rata αi = pengaruh bentuk teh kering ke-i βj = pengaruh reaksi oksidasi enzimatis ke-j (αβij) = pengaruh interaksi dari bentuk teh kering ke-i dan reaksi oksidasi enzimatis ke-j εij = galat error dari bentuk teh ke-i dan reaksi oksidasi enzimatis ke-j. Pengamatan/uji yang dilakukan adalah : uji organoleptik terhadap warna,rasa, dan aroma. Analisis data dilakukan dengan uji Kruskal Wallis Rancangan percobaan untuk penelitian utama adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial yang dilakukan terhadap lima kelompok tikus, dimana
41 setiap kelompok tikus terdiri dari 5 ekor tikus, dengan dua variabel yaitu minuman teh Camellia-murbei yang terbaik yaitu Multikaulis oksidasi enzimatis + Camellia Sinensis Klon Gambung 7 non oksidasi enzimatis curah (Teh A) dan lama pemberian teh yaitu 0, 2, dan 4 minggu. Dosis yang diberikan adalah 1 ml/100 gram bb tikus/kali pemberian, dengan kepekatan teh Camellia-murbei yang berbeda yaitu 3 gram teh/250 ml air, 6 gram teh/250 ml air, 9 gram teh/250 ml air, dan 12 gram teh/250 ml air. Jumlah sampel = 4 jenis kepekatan teh x 3 taraf waktu = 12 satuan percobaan. Model linier yang digunakan adalah : Yij = µ + αi + βj + εij µ = nilai rata-rata αi = pengaruh konsentrasi teh ke-i βj = Pengaruh waktu perlakuan ke -j εij = galat error dari konsentrasi teh ke-i dan waktu perlakuan ke-j. Pengamatan dan Analisis Data Data dari hasil uji organoleptik dianalisis secara deskripif dengan menggunakan nilai modus dan persentase panelis yang dapat menerima produk. Skor penilaian yang diberikan pada uji hedonik adalah 1 = sangat tidak suka, 2 = tidak suka, 3 = biasa, 4 = suka dan 5 = sangat suka. Persentase penerimaan panelis dihitung dengan cara menghitung persentase panelis yang dapat menerima produk (panelis yang memilih skor 3, 4, dan 5). Untuk mengetahui pengaruh kepekatan teh terhadap tingkat kesukaan panelis terhadap warna, rasa dan aroma minuman teh Camellia-murbei dilakukan analisis statistik menggunakan Kruskal Wallis. Data pada penelitian utama dianalisis dengan Analysis Of Variance (ANOVA) untuk mengetahui pengaruh pemberian teh yang digunakan terhadap variabel yang diamati. Adapun variabel dependen adalah IgG dan variabel independen adalah kepekatan teh. Jika terdapat perbedaan yang bermakna, akan
42 dilanjutkan dengan uji lanjut BNT. Data diolah menggunakan Microsoft Excell 2003, dan SPSS 13.0 for Windows.