BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Universitas Katolik Widya Mandira Kupang, pada bulan November 2017. Buah pinang diambil dari Kabupaten Nagekeo. B. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : a. Lesung : Untuk menghaluskan buah pinang yang sudah kering b. Pisau : Untuk mengupas kulit buah pinang dan mengiris daging buah pinang c. Labu Erlenmeyer : Untuk menampung hasil saringan maserasi dan tempat menyimpan media d. Tabung reaksi : Sebagai wadah saat pengenceran e. Gelas kimia : Sebagai tempat maserasi serbuk buah pinang f. Vortex : Untuk mengaduk/mencampurkan larutan dalam tabung reaksi sampai betul-betul homogeny g. Autoclave : Untuk mensterilisasi media h. Jangka sorong (mm) : Untuk mengukur zona bening yang terbentuk pada kertas cakram. i. Hot plate : Untuk memanaskan media j. Bunsen : Untuk memanaskan/mensterilkan jarum ose 20
agar tetap steril saat inokulasi k. Gunting : Untuk memotong kertas saring l. Rotary evaporator : Untuk menguapkan etanol agar didapatkan zat aktif murni buah pinang m. Neraca analitik : Untuk menimbang serbuk buah pinang n. Micro pipet : Untuk memindahkan biakan E.coli saat pengenceran dan mengambil biakan E.coli saat inokulasi o. Cawan petri : Sebagai wadah untuk pembiakan bakteri yang akan diteliti zona hambatnya p. Inkubator : Untuk menginkubasi tabung reaksi saat peremajaan bakteri dan menginkubasi cawan petri saat uji antibakteri q. Jarum ose : Untuk mengambil biakan E.coli dengan cara menggoreskannya saat peremajaan. r. Kamera digital : Untuk memotret hasil penelitian berupa zona hambat yang terbentuk ada cawan petri dan berbagai perlakuan yang dilakukan saat penelitian 21
2. Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah : a. Buah Pinang (Areca catechu L.) b. Biakan bakteri Escherichia coli c. Aquades steril d. Media Nutrien Agar (NA) e. Alkohol 95% f. Kapas g. Kertas cakram 10 mm h. Tissue i. Kertas putih j. Es batu k. Kertas saring l. Kertas label m. Aluminium foil C. Populasi dan Sampel Penelitian Populasi Sampel : Ekstrak Buah Pinang ( Areca catechu L.) : Konsentrasi ekstrak buah pinang ( Areca catechu L.) yang akan dipakai dalam.penelitian yakni 25%, 50%, 75% dan 100% D. Variabel Penelitian Variabel bebas Variabel terikat E. Rancangan Penelitian : : Pemberian konsentrasi ekstrak buah pinang ( Areca catechu L.) 25%, 50%, 75%, 100% Pertumbuhan bakteri Escherichia coli Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL); menggunakan desain Posttest Only Control Group Design, dengan 4 perlakuan dan 1 kontrol. Dimana konsentrasi P1=25%, P2=50%, P3=75%, P4=100%, yang akan diulang sebanyak 3 kali ulangan, serta aquades sebagai kontrol negatif 22
P1 2 O 1 P1 P1 2 O 1 P1 3 O 1 P2 1 O 2 P2 P2 2 O 2 P2 3 O 2 P3 1 O 3 RAL P3 P3 2 O 3 P3 3 O 3 P4 1 O 4 P4 P4 2 O 4 P4 3 O 4 K 1 O K K K 2 O K K 3 O K Bagan 3.1 Bagan desain penelitian Keterangan : RAL : Rancangan acak lengkap P1-P4 : Perlakuan dengan ekstrak buah pinang O1-O5 : Observasi atau pengamatan buah pinang Tabel 3.1 Rancangan Acak Lengkap P1 2 P3 1 P2 3 P4 1 P2 3 P4 3 P2 3 P4 2 P3 2 P4 1 P3 1 P4 2 23
F. Prosedur Penelitian Penelitian ini akan dilaksanakan dengan tahapan sebagai berikut : 1. Tahap persiapan a. Sterilisasi alat 1. Alat-alat yang akan disterilkan, dibungkus dengan kertas, lalu dimasukkan dalam autoclave dan disterilkan pada suhu 121 selama 15 menit. 2. Setelah sterilisasi, dikeluarkan dari autoclave, dan dikeringkan di oven b. Pembuatan media Nutrien Agar (NA) 1. Ditimbang 40 g bubuk Nutrien Agar (NA) menggunakan neraca analitik 2. Dilarutkan dalam 1000 ml aquades steril 3. Dipanaskan larutan pada hot plate sambil diaduk-aduk sampai mendidih dan disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 o C selama 15 menit. 2. Menyiapkan bahan uji a. Persiapan sampel Buah pinang (Areca catechu L.) diambil yang sudah tua, lalu dikupas dengan menggunakan pisau bersih, kemudian diiris tipis-tipis, dan dikering anginkan. Irisan buah pinang yang sudah kering dihaluskan (ditumbuk mengunakan lesung) untuk mendapatkan serbuk (simplisia). Hasil yang diperoleh digunakan sebagai sampel penelitian. b. Ekstraksi buah pinang dengan Metode Maserasi 1. Ditimbang serbuk atau bubuk buah pinang sebanyak 500 g dimasukkan ke dalam Labu Erlenmeyer, ditambahkan alkohol 95% sebanyak 500 ml dan diaduk. dimaserasi selama dua (2) hari. 24
2. Kemudian disaring menggunakan corong Buchner. 3. Larutan hasil penyaringan diendapkan dan dipisahkan antara meseret dari endapan dengan hati-hati. 4. Hasil maserasi diuapkan dalam cawan porselen di atas pemanas air atau penguap putar (ratavapor) pada suhu 45-50 o C dengan tekan rendah (±mmhg) hingga diperoleh ekstrak kental, (Ningsi, et al. 2009 dalam Lalong, P. 2015) c. Pembuatan konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75%, dan 100% Pembuatan konsentrasi ekstrak mengadopsi dari (Zaenab et al, 2004 dalam Sine 2012) Pembuatan konsentrasi dengan rumus: % Konsentrasi = m V 100% Keterangan: % konsentrasi = Proporsi konsentrasi ekstrak yang terdapat di dalam pelarut. M V = Berat/ massa dari ekstrak (gram) = Jumlah total antara ekstrak dan pelarut setelah ditambahkan pelarut (ml). 1. Konsentrasi 0% hanya menggunakan aquades sebanyak 10 ml tanpa ekstrak (kontrol negatif). 2. % = m v 100% 25% = m 10 ml 100% 25% = 100% m 10 ml 25
100% m = 25% 10 ml 100 m = 250 m = 250 100 = 2,5 gram Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 25% adalah 2,5 gram. 3. % = m v 100% 50% = m 10 ml 100% 50% = 100% m 10 ml 100% m = 50% 10 ml 100 m = 500 m = 500 100 = 5 gram Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 50% adalah 5 gram. 4. % = m v 100% 75% = m 10 ml 100% 75% = 100% m 10 ml 100% m = 75% 10 ml 100 m = 750 m = 750 100 = 7,5 gram Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 75% adalah 7,5 gram. 26
5. % = m v 100% 100% = m 10 ml 100% 100% = 100% m 10 ml 100% m = 100% 10 ml 100 m = 1000 m = 1000 100 = 10 gram Jadi ekstrak yang dibutuhkan dalam konsentrasi 100% adalah 10gram. 3. Tahap persiapan bakteri uji Escherichia coli a. Peremajaan biakan murni Peremajaan biakan murni bertujuan mendapatkan suatu biakan murni tanpa kontaminasi dari jenis bakteri lain dan diperoleh biakan bakteri yang baru dan segar. Biakan murni bakteri diremajakan pada media Nutrien Agar (NA) miring dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri Escherichia coli secara aseptis yaitu dengan mendekatkan mulut tabung pada nyala api saat menggoreskan jarum ose. Kemudian tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 dalam inkubator. b. Membuat seri pengenceran Tujuan Membuat seri pengenceran adalah bertujuan agar populasi mikroba yang tumbuh pada media tidak terlalu padat sehingga akan lebih mudah dalam mengidentifikasinya mikroba. Tahapan-tahapan membuat seri pengenceran adalah sebagai berikut: 27
1. Mengencerkan biakan Escherichia coli sebanyak 4 kali. Pengenceran 10-1 dapat dilakukan dengan cara diambil Escherichia coli dalam media Nutrien Agar (NA) sebanyak 1 ose, kemudian dimasukkan kedalam aquades 9 ml kemudian divortex sampai homogen. 2. Pengenceran 10-2, diambil 1 ml larutan pengenceran 10-1 lalu masukkan ke dalam aquades 9 ml kemudian kocok sampai homogen. Pengenceran 10-3 sampai 10-4 akan dilakukan seperti 10-1 dan 10-2 dan yang akan diambil adalah serial pengenceran keempat. c. Tahap Uji Antibakteri 1. Kertas cakram steril direndam dalam ekstrak buah pinang untuk konsentrasi 0%, 25%, 50%, 75% dan 100% selama 30 menit 2. Bakteri Escherichia coli diinkubasikan pada media Nutrien Agar (NA) dengan cara ambil 0,1 ml biakan bakteri Escherichia coli yang telah diencerkan dan dimasukkan ke dalam petridish dengan teknik pour plate lalu tuangkan Nutrien Agar (NA) dan biarkan sampai membeku setelah itu kertas cakram yang telah direndam dalam ekstrak ditempelkan pada media Nutrien Agar (NA) yang sudah diinokulasi bakteri Escherichia coli, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37. 3. Zona bening yang terbentuk di sekitar kertas cakram, diukur diameternya. 4. Teknik pengambilan data Teknik pengambilan data dengan mengukur besarnya zona bening ekstrak buah pinang dalam menghambat bakteri Escherichia coli adalah dengan cara mengukur zona bening (zona dimana terjadinya penghambatan pertumbuhan 28
bakteri) yang terbentuk oleh kertas cakram pada media yang telah diinkubasi selama 24 jam dengan menggunakan jangka sorong. G. Analisis Data Teknik analisa data yang digunakan adalah analisis varians (ANAVA) satu arah untuk mengetahui ada tidaknya kemampuan antibakteri ekstrak buah pinang (Areca catechu L.) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan apabila terdapat perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan tingkat signifikan 1% (0,01). Dibawah ini adalah tahapan-tahapan teknik analisis varians (ANAVA) 1. Tahapan-tahapan Anava a. Menentukan Derajat Bebas Perlakuan (DB) 1. DB Total = (t. r) -1 2. DB Perlakuan = t 1 3. DB Galat = DBT DBP b. Menentukan Faktor Koreksi (FK) FK = T ij 2 r. t c. Menentukan Jumlah Kuadrat (JK) 1. Jumlah Kuadrat Total (JKT) JKT = ( P 1 ) 2 + ( P n ) 2 FK 2. Jumlah Kuadrat Perlakuan (JKP) JKP = ( TA)2 + ( TB) 2 + ( TC) 2 + + ( TV) 2 r FK 29
3. Kuadrat Galat (JKG) JKG = JKT JKP d. Menghitung Kuadrat Tengah (KT) 1. Kuadrat Tengah Perlakuan (KTP) KTP = JKP DBP 2. Kuadrat Tengah Galat (KTG) e. Menentukan F hitung KTG = JKG DBG F hitung = KTP KTG f. F tabel (0.05) dan (0.01) Nilai Ftabel (0.05) = (0.05.dbP,dbG) Nilai Ftabel (0.01) = (0.01.dbP,dbG) Tabel 3.2 Format Hasil Analisis varians (ANAVA) Uji Kemampuan Antibakteri Ekstrak Buah Buah Pinang ( Areca catehu L.) Terhadap Pertumbuah Bakteri Escherichia coli Sumber Variasi DB JK KT F hitung F tabel 00.01 00.01 Perlakuan Galat Total F hitung > F Tabel, menyatakan adanya pengaruh nyata pada setiap konsentrasi ekstrak Buah Pinang, maka dilanjutkan uji BNT 30
2. Tahapan-tahapan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) taraf Sig. 1 % BNT α = t. α 2KTG r Tabel 3.3 Format Hasil uji lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT) pengaruh ekstrak buah pinang ( Areca catechu L.) terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli pada taraf signifikan 0,01 Konsentrasi Ekstrak (perlakuan) 0% 25% 50% 75% 100% Rerata 0 1 2 3 4 BNT 1% Keterangan : * : Berbeda nyata, tn : Tidak berbeda nyata, (c=c) : Tidak ada perbedaan antara kedua perlakuan (50% dan 75%) tersebut 31