III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Bahan Penelitian 3.1.1. Bahan Makanan 1. Rumput Lapang Rumput berfungsi sebagai bahan pakan utama bagi domba. Rumput lapang akan diperoleh dari sekitar kandang domba Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Tabel 2. Kandungan Zat Makanan Rumput Lapang Berdasarkan Bahan Kering Komponen Komposisi Bahan kering (%) 21,85 Abu (%) 9,33 Protein (%) 9,10 Serat kasar (%) 28,76 Lemak kasar (%) 4,72 BETN (%) 48,09 TDN (%) 60,63 Energi (Kkl/kg) 2994 Sumber: Laboratorium Nutrisi Ternak Ruminansia dan Kimia Makanan Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran (2016). 2. Kulit Pisang Ambon Pisang Ambon yang digunakan berjenis pisang Ambon kuning. Kulit pisang yang digunakan berasal dari pisang Ambon yang masih mentah. Kulit pisang Ambon diperoleh dari pasar tradisional yang ada di sekitar Bandung dan Jatinangor (pasar Caringin, Gede Bage, dan Tanjungsari). Analisis zat makanan kulit pisang Ambon dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel 3. Kandungan Zat Makanan Kulit Pisang Ambon Mentah Berdasarkan Bahan Kering Komponen Komposisi Bahan kering (%) 39,70 Abu (%) 11,20 Protein kasar (%) 7,82 Serat kasar (%) 20,40 Lemak kasar (%) 1,87 BETN (%) 58,70 TDN (%) 56,70 Tanin* (%) 5,32 Sumber: Laboratorium Nutrisi Ternak Ruminansia dan Kimia Makanan Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran (2016). *Laboratorium Riset dan Pengujian Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran (2016). 22 3. Konsentrat Konsentrat berfungsi sebagai bahan pakan tambahan bagi domba selain rumput lapang. Konsentrat yang digunakan berasal dari konsentrat komersial KPBS Pangalengan. Tabel 4. Kandungan zat makanan konsentrat Komponen Komposisi Bahan kering (%) 92,68 Abu (%) 14,21 Protein (%) 13,76 Serat kasar (%) 18,76 Lemak kasar (%) 9,37 BETN (%) 43,90 TDN (%) 65,22 Energi (Kkl/kg) 3499 Sumber: Laboratorium Nutrisi Ternak Ruminansia dan Kimia Makanan Ternak Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran (2016).
23 3.1.2. Cairan Rumen Cairan rumen berfungsi sebagai sumber mikroba rumen yang berperan dalam proses fermentasi secara in vitro. Cairan rumen yang digunakan berasal dari domba lokal dari tempat pemotongan milik Bapak Bandi di daerah Caringin, Jatinangor. 3.1.3. Larutan Saliva Buatan Larutan saliva buatan digunakan sebagai suatu medium buffer yang menyerupai kondisi rumen yang sesungguhnya, yaitu 39-40 C, ph 6,5-6,8. Pembuatan saliva buatan ini mengacu kepada metode McDougall (1948) yang dikutip Tilley dan Terry (1963). Prosedur pembuatan larutan saliva buatan tercantum pada Lampiran 1. 3.1.4. Zat Kimia 1. Larutan NaCl fisiologis berfungsi sebagai larutan pengencer dalam penghitungan bakteri dan protozoa. 2. HgCl 2 berfungsi untuk mematikan mikroba rumen pada saat dilakukan penyaringan. 3. Aquadest berfungsi untuk membersihkan alat, bahan campuran untuk larutan pengencer. 4. Alkohol berfungsi untuk sterilisasi alat. 3.1.5. Gas Karbondioksida (CO 2 ) Gas Karbondioksida berfungsi dalam percobaan in vitro untuk membuat isi tabung dalam suasana anaerob.
24 3.2. Peralatan Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peralatan sebelum inkubasi, peralatan selama inkubasi dan peralatan penghitungan mikroorganisme cairan ruman. 3.2.1. Peralatan Sebelum Inkubasi 1. Timbangan digital untuk menimbang sampel pakan. 2. Wadah digunakan untuk menyimpan bahan penyusun ransum. 3. Golok untuk mencacah rumput. 4. Hammer mill untuk memperkecil ukuran partikel bahan pakan. 5. Termos berisi air hangat dengan kisaran suhu 39 0-40 0 C, untuk membawa cairan rumen pada kondisi suhu yang sesuai dengan kondisi suhu yang sebenarnya. 6. Kain saring muslin untuk menyaring cairan rumen. 7. Gelas Beaker untuk menampung saliva buatan 8. ph meter untuk mengukur ph saliva buatan. 9. Stirer, untuk mengocok larutan McDougall agar menjadi homogen. 3.2.2. Peralatan Selama Inkubasi 1. Tabung fermentor sebagai media in vitro. 2. Penutup karet berventilasi untuk menutup tabung fermentor. 3. Waterbath, untuk media merendam tabung in vitro dengan suhu 39 0-40 0 C. 3.2.3. Peralatan Penghitungan Bakteri dan Protozoa Cairan Rumen 1. Tabung reaksi untuk pengenceran. 2. Mikroskop untuk mengamati mikroorganisme.
25 3. Pipet untuk mengambil sespensi mikroorganisme yang akan dihitung. 4. Object glass untuk menempatkan hasil pengenceran. 5. Cover glass untuk menutup permukaan object glass. 3.3. Metode penelitian 3.3.1. Pengukuran Kandungan Nurien dan Tanin Kulit Pisang 1. Pengukuran kandungan Nutrien Pengukuran menggunakan prosedur analisis proksimat yang mengacu pada AOAC (2005). Analisis yang dilakukan meliputi kadar air, abu, protein kasar, lemak kasar, serat kasar, bahan ekstrak tanpa nitrogen dan energi bruto. 2. Pengukuran Kandungan Tanin Pengukuran total tanin didasarkan pada Metode Folin-Ciocalteu yang dijelaskan oleh Makkar (2003). 3.3.2. Prosedur Pembuatan Tepung Kulit Pisang Ambon 1. Mengumpulkan pisang Ambon dari berbagai pasar di sekitar Jatinangor dan Bandung. 2. Mengupas pisang Ambon dan memisahkan bagian kulitnya. 3. Menampung kulit pisang Ambon dalam wadah atau baki. 4. Menjemur kulit pisang Ambon dibawah sinar matahari sampai kering. 5. Menggiling kulit pisang Ambon dengan menggunakan hammer mill. 6. Mencampurkan tepung kulit pisang Ambon dari berbagai pasar tradisional dengan perbandingan 1:1 7. Menyimpan tepung kulit pisang Ambon di dalam toples. 8. Melakukan analisis proksimat kulit pisang Ambon di laboratorium.
26 3.3.3. Prosedur Pembuatan Ransum 1. Menyiapkan bahan-bahan penyusun ransum yang terdiri atas rumput lapang, konsentrat dan tepung kulit pisang Ambon. 2. Menimbang masing-masing bahan penyusun ransum yang telah digiling sesuai dengan presentase masing-masing perlakuan (Tabel 2). 3. Memasukan dan mencampur bahan-bahan penyusun ransum ke dalam tabung fermentor sampai homogen. Tabel 5. Susunan ransum penelitian Perlakuan No Bahan Pakan R1 R2 R3 R4 % 1 Rumput Lapang 50 40 30 20 2 Konsentrat 40 40 40 40 3 Kulit Pisang Ambon 10 20 30 40 No Tabel 6. Kandungan Nutrien Ransum Penelitian Kandungan Nutrien Bahan Pakan Perlakuan R1 R2 R3 R4 % 1 Protein Kasar 10,832 10,704 10,576 10,448 2 Serat Kasar 23,924 23,088 22,252 21,416 3 Lemak Kasar 6,127 6,010 5,450 5,440 4 BETN 47,475 48,475 49,597 50,658 5. Abu 11,469 11,656 11,843 12,030 6. TDN 62,037 61,680 61,287 60,894 7. Tanin 0,532 1,064 1,596 2,128 Sumber : Berdasarkan hasil perhitungan dari tabel 1, 2 dan 3 3.3.4. Prosedur Percobaan In Vitro Pada tahap ini dilakukan percobaan In Vitro untuk mencari dosis level pemberian terbaik dari kulit pisang Ambon mentah. Level yang digunakan adalah 10,20,30 dan 40% kulit pisang yang digunakan untuk menggantikan rumput lapang sebagai sumber serat dalam ransum yang terdiri atas 60% hijauan dan 40% konsentrat masing masing mengandung protein ± 10% dan TDN ±60-62%.
27 Percobaan in vitro ini berpedoman kepada metode Tilley dan Terry (1963). Prosedurnya yaitu tabung fermentor sebagai media in vitro disiapkan, kemudan sampel ditimbang sebanyak 0,5 gram lalu dimasukkan ke dalam tabung fermentor. Larutan saliva buatan dimasukkan sebanyak 40 ml disertai cairan rumen sebanyak 10 ml ke dalam tabung fermentor tersebut. Gas CO 2 dialirkan ke dalam tabung kemudian ditutup dengan karet. Tabung fermentor kemudian dimasukkan ke dalam waterbath dengan suhu 39 0-40 0 C selama 24 jam dan dikocok setiap 3 jam sekali. Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 3 tetes HgCl 2 0,1 persen ke dalam tabung untuk membunuh mikroorganisme rumen. Sampel dari tiap tabung diambil kemudian disaring untuk dilakukan pengukuran jumlah bakteri dan protozoa. 3.3.5. Peubah yang Diamati Peubah yang diamati adalah populasi bakteri dan protozoa pada cairan rumen domba lokal. Pengukuran populasi bakteri dan protozoa dihitung menggunakan metode Breed yang sudah dimodifikasi oleh Ruyitno (1988), dimana metode Breed seharusnya dilakukan dengan melakukan pewarnaan terhadap sampel menggunakan larutan Formal Salin untuk populasi bakteri dan larutan MFS (Methylgreen Formaldehyde Saline) untuk populasi protozoa. Namun dapat dilakukan pula menggunakan mikroskop fluoresens yang tersambung ke perangkat komputer, dimana mikroskop dapat melakukan pewarnaan secara otomatis serta dapat menghitung luas daerah yang ditandai dengan pelingkaran secara otomatis menggunakan software Axio Vision, maka pewarnaan dan penggunaan haemocytometer tidak perlu dilakukan.
28 1. Pengukuran Populasi Bakteri Pengukuran populasi bakteri prosedurnya sebagai berikut: a. Supernatan yang terdapat dalam tabung plastik diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet kemudian dimasukan ke dalam tabung reaksi. b. Setelah itu dilakukan dengan pengenceran sampai 10-1 dengan menggunakan 9 ml NaCl fisiologis. c. Lalu preparat untuk perhitungan bakteri dibuat dengan meneteskan satu tetes sampel hasil pengenceran dengan menggunakan mikro pipet di atas object glass kemudian ditutup dengan cover glass. d. Setelah itu dilakukan pengamatan bakteri dengan menggunakan mikroskop fluoresens dengan pembesaran 1000 kali, lalu dilakukan penandaan dengan melingkari daerah yang terdapat bakteri. Setelah dilakukan penandaan, software otomatis akan menghitung luas daerah lingkaran tersebut. e. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah bakteri dalam luas daerah lingkaran secara manual. f. Setelah jumlah bakteri dihitung, kemudian dilakukan perhitungan populasi bakteri (sel/ml cairan rumen) menggunakan rumus sebagai berikut: e ( ) d ( ) e Te e Keterangan: Luas cover glass = 20 mm x 20 mm = 400 mm 2 = 400 x 10 6 2 Volume tetes = 0,01 ml FP = Faktor pengencer e
29 2. Pengukuran Populasi Protozoa Pengukuran populasi protozoa prosedurnya sebagai berikut: a. Supernatan yang terdapat dalam tabung plastik diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. b. Setelah itu dilakukan dengan pengenceran sampai 10-1 dengan menggunakan 9 ml NaCl fisiologis. c. Lalu preparat untuk perhitungan protozoa dibuat dengan meneteskan satu tetes sampel hasil pengenceran dengan menggunakan mikro pipet di atas object glass kemudian ditutup dengan cover glass. d. Setelah itu dilakukan pengamatan protozoa dengan menggunakan mikroskop fluoresens dengan pembesaran 1000 kali, lalu dilakukan penandaan dengan melingkari daerah yang terdapat protozoa. Setelah dilakukan penandaan, software otomatis akan menghitung luas daerah lingkaran tersebut. e. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah protozoa dalam luas daerah lingkaran secara manual. f. Setelah jumlah protozoa dihitung, kemudian dilakukan perhitungan populasi protozoa (sel/ml cairan rumen) menggunakan rumus sebagai berikut: e ( ) d e Te e Keterangan: Luas cover glass = 20 mm x 20 mm = 400 mm 2 = 400 x 10 6 2 Volume tetes = 0,01 ml FP = Faktor pengencer
30 3.3.6. Analisis Statistik Penelitian ini dilakukan secara eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan dan 5 ulangan. Ransum perlakuan terdiri atas : T 1 = 10% kulit pisang Ambon mentah + 50% rumput lapang + 40% konsentrat T 2 = 20% kulit pisang Ambon mentah + 40% rumput lapang + 40% konsentrat T 3 = 30% kulit pisang Ambon mentah + 30% rumput lapang + 40% konsentrat T 4 = 40% kulit pisang Ambon mentah + 20% rumput lapang + 40% konsentrat Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis statistik model matematika Gazperz (1991) sebagai berikut: Keterangan: Y ij = µ + α i + ɛ ij Y ij = Respon hasil pengamatan karena perlakuan uji ke-i dan ulangan ke-j µ = Nilai tengah populasi (Rataan umum) α i = Pengaruh perlakuan (waktu) ke-i Ɛ ij = Galat percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Hipotesis yang akan diuji adalah : H0 : Penggunaan kulit pisang sebanyak 40% menghasilkan populasi bakteri dan protozoa tertinggi dibandingkan dengan penggunaan kulit pisang 10, 0, d 30 %. T4 T ; T4 T ; T4 T3. H1 : Pengaruh perlakuan T4 > T1 ; T4 > T2 ; T4 > T3 atau paling sedikit ada satu perlakuan yang berbeda.
31 Sumber Keragaman Tabel 7. Daftar Sidik Ragam DB JK KT Fhit Ftabel Perlakuan (t-1) = 3 JKP KTP KTP/KTG Galat t(r-1) = 16 JKG KTG Total tr-1 = 19 JKT Keterangan : db = Derajat bebas JK = Jumlah kuadrat KT = Kuadrat tengah Kaidah keputusan:. be d be bed y non significant) atau terima H0.. be be bed y significant) atau tolak H0 dan diterima H1. Selanjutnya bila terdapat perbedaan pengaruh perlakuan yang nyata terhadap hasil pengamatan yang dilakukan maka perlu dilakukan uji lanjutan dengan menggunakan uji Jarak Berganda Duncan untuk menguji antar perbedaan perlakuan digunakan: Sx = LSR α SSRα.S Keterangan : Sx : Standard error KTG : Kuadrat Tengah Galat SSR : Studentized Significant Range LSR : Least Significant Range r : Ulangan
32 Selisih antar perlakuan (d) kemudian dibandingkan dengan perlakuan, dengan kaidah keputusan : A b d SR, d be bed y e H0. A b d SR, be bed y a atau sangat nyata (tolak H0). Selanjutnya dilakukan uji Polinomial Ortogonal. Gomez dan Gomez (1995) menjelaskan suatu derajat polinomial ke-n digunakan untuk mengetahui hubungan antara peubah respon Y dan peubah prediktor X disajikan sebagai berikut: Y α + β 1 X + β 2 X 2 +... + βn X n Keterangan : Y α X β 1, β 2,... : respon t : intersepsi atau nilai sebenarnya dari peubah yang diamati : perlakuan : koefisien regresi parsial yang berasosiasi dengan derajat polonomial ke-1 hingga ke-n Gomez dan Gomez (1995) telah menguraikan perhitungan untuk mendapatkan koefisien ortogonal polinomial untuk derajat polinomial pertama (linier), derajat polinomial kedua (kuadratik), derajat polinomial ketiga (kubik), dan derajat polinomial keempat (kuartik), sebagai berikut : L i = a + X i Q i = b + c X i + X i 2 C i = d + ex i + f X i 2 + X i 3 Q u = k +lx + mx 2 + nx 3 + X 4 Keterangan : L i : Derajat polinomial pertama (linier) Q i : Derajat polinomial kedua (kuadratik) C i : Derajat polinomial ketiga (kubik) : Derajat polinomial keempat (kuartik Q u
Data penelitian kemudian akan dilakukan perhitungan analisis varian polinomial orthogonal yang tertera pada Tabel 8, yaitu: Tabel 8. Analisis Varian Polinomial Orthogonal Sumber Keragaman db JK KT Statistik Uji F e - K KT e K KT K d K KT K b K 3 KT 3 3 K K 4 KT 4 4 S K KT e c b T - KT Keterangan: db : Derajat bebas JK : Jumlah kuadrat JKp 1 : Jumlah kuadrat perlakuan linier JKp 2 : Jumlah kuadrat perlakuan kuadratik JKp 3 : Jumlah kuadrat perlakuan kubik JKp 4 : Jumlah kuadrat perlakuan kuartik JKg : Jumlah kuadrat galat JKT : Jumlah kuadrat total KT : Kuadrat tengah KTp 1 : Kuadrat tengah perlakuan linier KTp 2 : Kuadrat tengah perlakuan kuadratik KTp 3 : Kuadrat tengah perlakuan kubik KTp 4 : Kuadrat tengah perlakuan kuartik KTg : Kuadrat tengah galat 33 Kaidah keputusan : 1. Bila F hitung < F tabel 0,05, nilai rata-rata antar perlakuan tidak berbeda nyata (non significant), maka terima H 0. 2. Bila F hitung > F tabel 0,05, nilai rata-rata antar perlakuan berbeda nyata (significant) atau paling sedikit ada satu perbedaan pada setiap perlakuan, maka tolak H 0.
34 Hasil analisis varian tersebut akan dilihat signifikan antar sumber keragaman. Sumber keragaman yang memiliki signifikan tertinggi yang akan dicari bentuk persamaan dan bentuk kurva yang akan membantu dalam membahas hasil penelitian. Untuk pengambilan keputusan dapat dilihat dari hasil pembandingan nilai statistik uji F yang telah dihitung dengan nilai kritis. Menurut Widiharih (2001), penentuan derajat polinomial didasarkan pada kontras-kontras ortogonal yang nyata, sehingga akan didapatkan hubungan fungsi respon antar perlakuan sesuai dengan derajat polinomial yang signifikan. Tabel 9. Tata Letak Percobaan 1 2 3 4 5 P3 P1 P3 P1 P1 6 7 8 9 10 P2 P1 P2 P3 P2 11 12 13 14 15 P4 P2 P4 P3 P1 16 17 18 19 20 P3 P2 P4 P4 P4 Keterangan : P1 : Perlakuan 1 P2 : Perlakuan 2 P3 : Perlakuan 3 P4 : Perlakuan 4