BAB III METODOLOGI PENELITIAN III.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini, dilaksanakan pada bulan Mei 2017 - Desember 2017. Pengujian skrining fitokimia, kromatografi lapis tipis kromatografi kolom,serta pengujian antibakteri dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Universitas Katolik Widya Mandira Kupang dan identifikasi Infrared dilakukan di laboratorium Material Maju Universitas Negeri Malang. III.2 Bahan dan Alat III.2.1 Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah: daun miana asal desa Kesetnana Kabupaten TTS, etanol 70%, metanol, etanol p.a, aquades, N-heksana, etil asetat, benzena, kloroform, pereaksi Liberman Bauchard (asam asetat anhidrida: asam sulfat pekat), pereaksi Mayer (HgCl 2, KI, aquades), pereaksi Dragendorff (aquades, iodin dan kalium iodida), pereaksi Wagner (BiNO 3, HCl pekat, KI, aquades), HCl, magnesium, H 2 SO 4, eter, FeCl 3 1%,silica G 60, dan nutrien agar. III.2.2 Alat Alat-alat yang digunakan adalah: erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, gelas kimia, oven, autoklaf, cawan petri, jarum ose, pipet tetes, mikropipet, hot plate, pinset, kapas steril, lemari pendingin, inkubator, jangka sorong, neraca analitik, spatula, almunium foil, kertas label, tisu, mistar, evaporator, plat kromatografi lapis tipis, kolom kromatografi, lampu UV, spektrofotometer UV- Vis dan spektrofotometer Infrared. III.2.3 Bakteri Uji Bakteri yang digunakan dalam pengujian adalah bakteri Salmonella typhimurium. 28
III.3 Prosedur Kerja III.3.1 Penyiapan Sampel Sampel daun miana yang segar dikumpulkan, dibersihkan dengan air dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara terbuka tanpa sinar matahari secara langsung. Sampel daun miana yang telah kering, dihaluskan dengan blender. III.3.2 Ektraksi Sampel Sebanyak 200 gram daun miana yang telah halus, direndam dalam 500 ml etanol 70% selama 24 jam sambil diaduk. Ekstrak dipisahkan, dan ke dalam residu dimasukan lagi 500 ml etanol 70% yang baru dan didiamkan selama 24 jam sambil diaduk. Ekstrak hasil perendaman tahap kedua ini dipisahkan dan digabungkan dengan ekstrak tahap pertama. Perlakuan ini diulang hingga ekstrak tidak menunjukan adanya perubahan warna (ekstrak tetap bening seperti etanol yang ditambahkan terakhir). Ekstrak yang diperoleh kemudian dikeringanginkan pada suhu ruangan untuk menghilangkan pelarut. III.3.3 Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Daun Miana Terhadap Bakteri Salmonella typhimurium 1. Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak daun mianayang telah bebas etanol dilarutkan dalam aquades, kemudian diencerkan menghasilkan seri-seri sehingga tersedia larutan uji dengan konsentrasi sebagai berikut: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%. Larutan stok diencerkan menggunakan aquades. 2. Pembuatan media tumbuh bakteri Ditimbang 5 gram NA, dipanaskan dan aduk dengan magnet stirer hingga homogen, kemudian disterilisasi dalam autoklaf 121 o C selama 15 menit. Kemudian media disterilisasi dengan cara bagian mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan dengan almunium foil yang diikat dengan karet gelang, kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 o C. Tuang media steril ke dalam cawan petri steril. 3. Inokulasi Bakteri (Peremajaan) Isolat bakteri salmonella typhimurium dari biakan murninya diambil 1 ose
kemudian ditumbuhkan dalam media cair dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. 4. Pembuatan suspensi bakteri Membuat larutan suspensi bakteri Salmonella typhimurium diambil 1 ose bakteri, dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan NaCl fisiologi 0,9%, dengan biakan murni Salmonella typhimurium didalam tabung reaksi dikocok sampai homogen. 5. Pengujian Ekstrak Daun Miana Terhadap Bakteri Salmonella typhimurium Penentuan aktifitas antibakteri Salmonella typhimurium dilakukan dengan menggunakan metode sumur difusi. Prosedurnya yaitu: a. Sebanyak 5 µl bakteri hasil biakan dimasukan ke dalam cawan petri b. Dituangkan media padat ke dalam cawan petri yang berisi bakteri dan dihomogenkan c. Setelah memadat, dibuat sumur pada media dengan menggunakan pipet tetes d. Diberi label pada masing-masing konsentrasi serta kontrol negatif dan positif yang telah dibuat sumur e. Setelah diberi label dimasukkan l a r u t a n ekstrak ke dalam masingmasing sumur dari konsentrasi terendah, yaitu: 1,56%, 3,13%, 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, 100% serta kontrol negatif dan kontrol positif. perlakuan ini diulang sebanyak 2 kali. f. Cawan ditutup rapat dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C g. Setelah diinkubasi, zona bening yang terbentuk di sekitar sumur difusi diukur dengan jangka sorong. III.3.4 Analisis Komponen Aktif 1. Uji fitokimia Uji fitokimia dilakukan secara kualitatif, untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa aktif yang terdapat dalam sampel daun miana. Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji, alkaloid, flavonoid saponin, steroid, terpenoid, dan
tannin. Uji fitokimia dengan menggunakan metode harbone, 1987. a. Identifikasi flavonoid Ditimbang 0,5 gram sampel, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan metanol p.a, dipanaskan dalam penangas selama 10 menit. Ditambahkan dengan H 2 SO 4. Flavonoid positif jika terjadi perubahan warna menjadi hijau kehitaman. b. Identifikasi alkaloid Ditimbang 0,5 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1,5 ml kloroform dan 3 tetes amoniak, dikocok, disaring dan diasamkan dengan 5 tetes H 2 SO 4 kemudian dikocok sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan asam (tidak berwarna) dipipet ke dalam tabung reaksi lain, kemudian larutan dibagi tiga. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut : 1) Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning 2) Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Wagner, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam 3) Sebanyak 3 tetes filtrat ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah jingga c. Identifikasi steroid, terpenoid Ditimbang 0,5 gram daun ditambahkan 2 ml etanol lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan dengan dietil-eter. Lapisan dietil-eter ditambahkan dengan pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asetat anhidrat dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat). Warna merah atau ungu yang terbentuk menunjukkan adanya terpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. d. Identifikasi saponin Ditimbang 0,5 gram sampel daun miana dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 4 ml aquades dan dipanaskan, disaring dan filtrate dikocok Jika terbentuk busa setinggi 1 sampai 10cm yang stabil selama 10 menit menunjukkan adanya saponin.
e. Identifikasi tanin Ditimbang 0,5 gram sampel yang telah dihaluskan, dimasukan ke dalam tabung reaksi ditambahkan dengan aquades, larutan disaring, ditambahkan 3 tetes FeCl 3 1% dan hasilnya diamati. Apabila hasilnya berwarna hijau atau biru, maka positif mengandung tanin. 2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak yang telah di uji fitokimia selanjutnya dilakukan fraksinasi dengan cara kromatografi. Tahap pertama kromatografi, yaitu dengan kromatografi lapis tipis. Tujuan kegiatan pada tahap pertama ini, adalah untuk mencari jenis pelarut terbaik sebagai fase gerak pada tahap fraksinasi menggunakan kromatografi kolom. Cara kerja: a. Disiapkan beberapa jenis pelarut organik, baik yang bersifat polar maupun nonpolar. b. Plat KLT sebelum digunakan, diaktifkan dengan cara dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 o C selama 15 menit. c. Plat didinginkan di udara terbuka selama 30 menit. d. Dibuat batas atas dan batas bawah plat. e. Sebanyak 2 ml dari tiap jenis pelarut dimasukan ke dalam masing-masing gelas kimia 10 ml, dan ditutup rapat. f. Larutan ekstrak di totolkan pada plat lapis tipis dengan jarak 1 cm dari tepi bawah, kemudian dimasukan ke dalam gelas kimia yang telah berisi pelarut uji dalam posisi tegak agar totolan sampel tidak terendam dalam pelarut, ditutup rapat. g. Plat KLT dikeluarkan dari dalam gelas jika pelarut terserap mencapai batas tepi atas dan dibiarkan mengering. h. Plat KLT yang telah kering diamati pada cahaya UV. i. Pelarut yang menunjukan pemisahan terbaik (teramati pada KLT), selanjutnya digunakan sebagai fase gerak pada tahapan kromatografi kolom.
3. Fraksinasi melalui Kromatografi Kolom Prosedur: a. Disiapkan kolom kromatografi dengan tinggi 38 cm dan berdiameter 2,5 cm yang ditegakan pada statip. b. Disiapkan pelarut dari hasil identifikasi kromatografi lapis tipis sebanyak 140 ml. c. Sebanyak 2,5 gram ekstrak kasar sampel dilarutkan dengan pelarut yang diperoleh dari KLT. d. Dimasukan gelas wol. e. Dimasukan 20 gram silica gel 60 ke dalam kolom. f. Dimasukan fase gerak (pelarut) ke dalam kolom. g. Larutan ekstrak kasar sampel tanaman miana dimasukan ke dalam kolom. h. Diatur laju alir, larutan ekstrak yang bermigrasi pada kolom dan mencapai ujung bawah kolom, ditampung pada tabung reaksi sehingga mencapai volume 3 ml. i. Langkah nomor 6 diulang hingga diperoleh larutan fraksi sebanyak 40 tabung reaksi. j. Tiap larutan fraksi dari langkah nomor 7 dilakukan identifkasi dan pengelompokan melalui cara KLT. Pengamatan terhadap hasil uji ini, dilakukan menggunakan lampu UV. Fraksi-fraksi yang memperlihatkan penampakan noda yang sama, dikelompokan menjadi satu kelompok. Fraksifraksi yang telah dikelompokan, disatukan dalam satu wadah dan diuapkan pelarutnya kemudian diperoleh ekstrak yang bebas pelarut (ekstrak kering). k. Dilakukan identifikasi kandungan senyawa aktif di dalam fraksi dengan spektrofotometer UV-Vis dan Spektrofotometer Infrared.