IV. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 4.1 Waktu dan Tempat Percobaan Penelitian dilakukan pada bulan Oktober-November 2018, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Teknologi Pengolahan Pangan, Laboratorium Kimia Pangan, dan Laboratorium Uji Jurusan Teknologi Industri Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran. 4.2 Bahan dan Alat Percobaan 4.2.1 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam pembuatan minuman sinbiotik ini adalah tepung sorgum kultivar lokal Bandung, kultur murni B. bifidum, akuades, gula pasir, dan susu skim bubuk. Media yang digunakan adalah deman Ragosa Sharpe Agar (MRSA). Bahan kimia yang digunakan adalah alkohol 70%, asam asetat glasial 98%, larutan buffer ph 7 dan 4, dan NaCl fisiologis 0,85%. 4.2.2 Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, inkubator, lemari pendingin, oven, spektrofotometer, viscometer, kompor, colony counter, vortex, ayakan 100 mesh, baskom, batang pengaduk, beaker glass, botol scotch, bunsen, cawan petri, corong, erlenmeyer, gelas ukur, kemasan plastik, mikro pipet, ph meter, pipet tetes, rak tabung, spatula, tabung reaksi, termometer, timbangan analitik, botol plastik PET 100mL, dan fintip. 27
28 4.3 Metode Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental dengan analisis deskriptif. Selanjutnya dilakukan analisis regresi dan korelasi untuk pendugaan umur simpan minuman sinbiotik menggunakan metode ASLT model Arrhenius dengan tiga suhu penyimpanan yaitu 15 o C±5 o C, 25 o C±5 o C, dan 35 o C±5 o C. Analisis regresi dan korelasi dilakukan dengan memplotkan parameter mutu berupa sumbu y dan waktu berupa sumbu x sehingga diperoleh persamaan sebagai berikut: y= ax + b dimana: y = Parameter mutu (C) a = Konstanta laju reaksi (k) x = Waktu (hari) b = Hasil awal (C 0 ) Berdasarkan persamaan tersebut diperoleh nilai slope yang merupakan konstanta laju reaksi (k). Nilai tersebut dapat digunakan untuk menentukan pengaruh perubahan suhu terhadap konstanta laju reaksi dengan persamaan: ln k = ln k 0 -( ) ( ) dimana: ln k = konstanta perubahan parameter mutu ln k 0 = konstanta (tidak tergantung pada suhu) Ea = energi aktivasi T = suhu (K)
29 R = tetapan gas konstan 1,9872x10-3 kkal/mol.k Sehingga diperoleh nilai energi aktivasi (Ea) dari persamaan regresi yang dihasilkan. Nilai Ea berfungsi untuk menentukan parameter kritis. 4.4 Pelaksanaan Percobaan Tahapan yang dilakukan pada percobaan meliputi: 4.4.1 Tahap Pembuatan Tepung Sorgum 1. Mengayak tepung sorgum menggunakan ayakan 100 mesh. 2. Menyimpan tepung sorgum menggunakan plastik zip lock. Diagram alir prosesnya ditunjukkan pada Gambar 4. Tepung sorgum kasar Pengayakan dengan ayakan 100 mesh Tepung Sorgum 100 mesh Gambar 1. Pembuatan Tepung Sorgum (Sumber: Mardawati et al., 2010) 4.4.2 Tahap Pembuatan Suspensi B. bifidum 1. Pembuatan Kultur Cair B. bifidum Media yang digunakan untuk pertumbuhan yakni MRS agar miring dan inkubasi dengan suhu 37 o C selama 48 jam. Kultur diluruhkan dengan pengencer akuades steril. Kekeruhan suspensi bakteri dicek sesuai
30 McFarland 3 dengan panjang gelombang 600 nm dan absorbansi ± 0,616 setara dengan jumlah koloni 3x10 8 CFU/ml menggunakan spektrofotometer. Diagram alir pembuatan kultur cair dintunjukkan oleh Gambar 5. Bifidobacterium bifidum Penumbuhan dalam agar miring Inkubasi T=37 C, t=48 jam Kultur B. bifidum Peluruhan dengan akuades steril Pengukuran kekeruhan Perhitungan TPC Gambar 2. Diagram Alir Pembuatan Kultur B. bifidum (Sumber: Daffana, 2017) 2. Inokulasi Kultur Cair B. bifidum Suspensi berguna untuk memperbanyak jumlah koloni bakteri. Media untuk membuat suspensi berupa susu skim bubuk 10% yang dilarutkan dalam akuades. Susu skim yang telah larut, dipasteurisasi pada suhu 62,8 o C selama 15 menit menggunakan waterbath. Inokulasi dengan
31 penambahan 10% kultur cair B. bifidum setelah suhu menjadi ±37 C sehingga diperoleh suspensi. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam untuk perhitungan jumlah bakterinya. Diagram pembuatan suspensi dapat dilihat pada Gambar 6. Susu skim bubuk 10% (b/v) Akuades steril Pencampuran Pasteurisasi T=62,8 C, t=15 menit dengan waterbath Susu skim cair 10% (v/v) Kultur cair B. bifidum 10% (v/v) Inokulasi Suspensi B. bifidum Perhitungan TPC Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Suspensi B. bifidum (Sumber: Daffana, 2017) 4.4.3 Tahap Pembuatan Minuman Sinbiotik 1. Pencampuran tepung sorgum dan akuades steril dengan perbandingan 1:10 dan ditambahkan gula pasir 10%.
32 2. Pemanasan pada suhu 60 o C selama 30 menit menggunakan waterbath dan penurunan suhu menjadi ±37 o C. 3. Penambahan bakteri probiotik B. bifidum sebanyak 12% (v/v). 4. Pengemasan dilakukan menggunakan botol PET 100 ml. Botol PET tersebut telah disterilisasi menggunakan uap panas dan sinar UV. Diagram alir pembuatan minuman sinbiotik terdapat pada Gambar 8. Larutan tepung sorgum Gula pasir 10% (b/v) Pencampuran Pemanasan T=60 C, t=30 menit dengan waterbath Suspensi B. bifidum 12% (v/v) Penurunan suhu hingga T=±37 C Pencampuran Pengemasan dalam botol PET 100 ml Minuman sinbiotik Gambar 4. Diagram Alir Pembuatan Minuman Sinbiotik (Sumber: Daffana, 2017) 4.4.4 Tahap Perhitungan Umur Simpan Perhitungan umur simpan dapat dilakukan setelah mengumpulkan data penyimpanan produk minuman sinbiotik pada masing-masing suhu penyimpanan.
33 Produk yang disimpan pada suhu 15 o C±5 o C diamati selama satu minggu dengan pengambilan data sehari sekali. Produk yang disimpan pada suhu 25 o C±5 o C dan 35 o C±5 o C diamati selama satu hari dengan pengambilan data setiap 2 jam sekali sampai 10 jam pertama, selanjutnya pengambilan data dilakukan pada jam ke 24. Perhitungan umur simpan dilakukan dengan metode ASLT model Arrhenius. Hariyadi (2014), perhitungan umur simpan model Arrhenius adalah sebagai berikut: 1. Pengumpulan data berdasarkan kriteria pengamatan C (hasil) = variabel terikat t (waktu) = variabel bebas Pengumpulan data mutu awal minuman berupa total bakteri asam laktat, total bakteri probiotik, nilai ph, dan viskositas minuman sinbiotik dilakukan sejak jam ke-0. 2. Perubahan mutu selama penyimpanan ditunjukan oleh persamaan berikut: n Dimana: C = nilai parameter mutu t = waktu k = konstanta laju reaksi n = ordo reaksi 3. Modifikasi persamaan menjadi Persamaan ordo nol, n=0
34 C = C 0 - kt Persamaan ordol satu, n=1 ln C= ln C 0 - kt 4. Penentuan ordo reaksi Ordo reaksi dapat ditentukan dengan memplotkan data pada masingmasing grafik sehingga diperoleh nilai koefisien determinasi (R 2 ). Grafik reaksi ordo nol berisikan sumbu y (parameter mutu) terhadap sumbu x (waktu). Grafik reaksi ordo satu diperoleh dengan memplotkan sumbu y (ln parameter mutu) terhadap sumbu x (waktu). Grafik ordo reaksi dapat dilihat pada Gambar 8. Nilai R 2 pada setiap ordo reaksi dibandingkan dan dipilih yang dominan mendekati nilai 1. Mutu Ln Parameter Mutu Ordo nol Ordo satu Waktu Waktu Gambar 5. Grafik Ordo Reaksi (Sumber: Phimolsiripol dan Suppakul, 2016) 5. Penentuan konstanta laju reaksi Masing-masing suhu penyimpanan memiliki nilai k yang dperoleh dari nilai slope.
35 6. Hubungan nilai k dengan suhu penyimpanan diperoleh dari persamaan: k = k 0.e -(Ea/RT) 7. Penurunan persamaan menjadi ln k = ln k 0 -( ) ( ) Dimana: ln k = konstanta perubahan parameter mutu ln k 0 = konstanta (tidak tergantung pada suhu) Ea = energi aktivasi T = suhu (K) R = tetapan gas konstan 1,9872x10-3 kkal/mol.k 8. Berdasarkan persamaan 7 diperoleh nilai Ea. Nilai Ea sama dengan nilai slope dikalikan dengan nilai tetapan gas konstan Ea/R = slope Ea= Energi aktivasi R= Tetapan gas konstan 1,9872x10-3 kkal/mol.k 9. Titik kritis produk diketahui dari nilai energi aktivasi (Ea) terendah. 10. Penentuan umur simpan Ordo reaksi dan nilai Ea yang telah diketahui dapat menentukan nilai k diluar suhu pengamatan. Umur simpan produk dapat diketahui dengan persamaan a. Ordo nol:
36 Ordo satu menggunakan persamaan sebagai berikut: b. Ordo satu: t=umur simpan produk (jam) C 0 =nilai parameter mutu awal (jam ke-0) C t =nilai parameter mutu akhir (jam ke-t) k =konstanta penurunan mutu 4.5 Kriteria Pengamatan Produk yang disimpan pada suhu 15 o C±5 o C diamati selama satu minggu dengan pengambilan data sehari sekali. Produk yang disimpan pada suhu 25 o C±5 o C dan 35 o C±5 o C diamati selama satu hari dengan pengambilan data setiap 2 jam sekali sampai 10 jam pertama, selanjutnya pengambilan data dilakukan pada jam ke 24. Pengamatan yang dilakukan adalah sebagai berikut: 1. Total bakteri asam laktat pada kultur cair, suspensi bakteri B. bifidum, dan minuman sinbiotik dengan metode Total Plate Count (TPC) sesuai SNI 01-2897:2008 (BSN, 2008). 2. Total bakteri probiotik pada kultur cair, suspensi bakteri B. bifidum, dan minuman sinbiotik dengan metode Total Plate Count (TPC) sesuai SNI 01-2897:2008 (BSN, 2008). 3. Pengukuran ph menggunakan ph meter pada minuman sinbiotik (AOAC, 1984).
37 4. Pengukuran viskositas menggunakan viscometer pada minuman sinbiotik (AOAC, 1995). 5. Perhitungan umur simpan minuman sinbiotik menggunakan model Arrhenius berdasarkan data yang diperoleh (Hariyadi, 2014).