Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri dengan Masalah Homologi Sekuens DNA

Artikel Penelitian Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri dengan Masalah Homologi Sekuens DNA Sunarno, 1 Harly Novriani 2 1 Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes, Jakarta 2 Puslitbang Sumber Daya dan Pelayanan Kesehatan, Badan Litbangkes, Jakarta Abstrak Pendahuluan Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan pemeriksaan polymerase chain reaction (PCR) adalah ketepatan susunan primer PCR yang digunakan. Beberapa software dapat digunakan untuk merancang primer PCR secara cepat sesuai dengan kebutuhan.namun, untuk beberapa kasus seperti adanya masalah homologi sekuens DNA gen target dapat menjadi kendala tersendiri dalam desain primer. Salah satu gen yang memiliki masalah homologi sekuens DNA adalah gen dtxatau tox yang merupakan penanda toksigenisitas bakteri penyebab difteri. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan susunan primer PCR yang tepat dalam identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri dengan PCR konvensional, termasuk membedakan strain non-toxigenic tox gene bearing (NTTB) dari strain toksigenik. Metode Primer PCR didesain secara manual berdasarkan data sekuens DNA gen dtx dan pseudogene bakteri penyebab difteri yang terdaftar di GeneBank atau dipubliksasi dalam jurnalilmiah.sebanyak 26 sekuens gen dtx dan 10 pseudogen di-align menggunakan program BioEdit. Penilaian terhadap daerah yang berpotensi sebagai tempat penempelan primer dilakukan satu per satu. Kandidat primer yang diperoleh diuji dengan program PerlPrimer untuk memprediksi kendala yang akan muncul. Hasil Analisis secara in silicomenunjukkan bahwa ada 3 pasang primer PCR yang dapat digunakan untuk membedakan strain NTTB dari strain toksigenik,begitu juga strain non-toksigenikdari strain toksigenik maupun NTTB. Ketiga pasang primer PCR tersebut diprediksi dapat diaplikasikan dalam sebuah reaksi PCR multipleks. Strain NTTB akan menghasilkan 2 pita penanda, masing-masing 174 bp dan 517 bp atau 539 bp. Strain toksigenik akan menghasilkan 1 pita 174 bp sebagai penanda. Semntara itu, pada strain nontoksigenik tidak tampak adanya pita 174 bp, 517 bp maupun 539 bp. Kesimpulan Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa primer baru untuk PCR konvensional yang berhasil didesain dalam penelitian ini, secara Bioinformatika dapat digunakan untuk identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri, termasuk membedakan strain NTTB dari strain toksigenik. Kata Kunci primer PCR, toksigenisitas, gen tox, difteri Korespondensi Sunarno Email no_nar@yahoo.com 544

Manually PCR Primer Designto Amplify thedtx Gene of the Bacteria Causing Diphtheria with DNA Sequences Homology Problem Sunarno, 1 Harly Novriani 2 1 The Biomedical and Basic Health Tecnology, Health Research and Development Centre, Jakarta 2 Resource Center and Balitbangkes Health Services, Jakarta Abstract Introduction PCR primer sequences determine the successfulness of polymerase chain reaction (PCR). Some software could be used for design of proper PCR primer sequences.nevertheless, the PCR primer design occasionally complicated by the sequences homology problem of target gene. The dtxor tox gene that encoding diphtheria toxin synthesis is an example of thegene with DNA sequences homology problem. This study targeted to get proper PCR primer for identification of bacterial toxigenicity by conventional PCR, included non-toxigenic tox gene bearing (NTTB) and toxigenic strains differentiation. Methods The PCR primer designed manually based on the sequences data of dtxgene and pseudogene of the bacteria causing diphtheria registered in GeneBank or the other scientific publishing. Twenty six sequences of dtxgene and 10 sequences of pseudogen alignedby BioEdit program. PCR primer candidate tested in silico by PerlPrimer program to predict the primerapplication onthe PCR processing. Result The study showed that 3 pairs of PCR primer could to distinguish NTTB strain from toxigenic strain as well as non-toxsigenic strain distinguish from toxigenicand NTTB strains. The 3 pairs of PCR primer were predicted could beapplied on the conventional multiplex PCR. NTTB strain marked by 2 bands (174 bp and 517 bp or 539 bp), whiletoxigenicstrain marked by 1 band (174 bp). In other hand, non-toxigenicstrain marked by no band on 174 bp, 517 bp, or 539 bp. Conclusions The study was success to design 3 pairs of PCR primer for conventional multiplex PCR application that could be used to identify the toxigenicity (toxigenic, non-toxigenic, and NTTB differentiation) of bacteria causing diphtheria properly. Keywords PCR primer, toxigenicity, tox gene, diphtheria Pendahuluan Sejak dikembangkan oleh Kary Banks Mullis tahun 1985, Polymerase Chain Reactin (PCR) telah menunjukkan peranan yang sangat besar dalam perkembanganilmu pengetahuan, khususnya Biologi Molekular. Saat ini, pemeriksaan PCR menjadi bagian yang tidak terpisahkan dari kegiatan rutin di laboratorium pelayanan maupun penelitian kesehatan. Serangkaian kelebihan yang dimiliki membuatnya menjadi pilihan utama atau alternatif pemeriksaan untuk diagnostik penyakit maupun tujuan lainnya. PCR cenderung banyak dipilih karena relatif lebih mudah dan cepat dengan sensitifitas dan spesifitaspemeriksaan yang sangat tinggi. 1,2 Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan pemeriksaan PCR adalah ketepatan susunan primer PCR yang digunakan karena akan menentukan sensitifitas dan spesifisitas pemeriksaan. Primer PCR atau dikenal sebagai oligomer merupakan sepasang potongan pendek DNA untai tunggal (biasanya 18-30 bp), terdiri dari forward primer (F) dan reverse primer (R)yang digunakan untuk inisiasi terjadinya proses amplifikasi DNA template pada proses PCR. Selain untuk inisiasi, primer PCRjuga digunakan untuk membatasi proses amplifikasi sehingga bisa ditentukan seberapa panjang produk PCR (amplikon) yang dihasilkan. Dengan demikian, setelah dilakukan elektroforesis, hasil amplifikasi dapat dibaca dengan benar. Untuk dapat mencapai tujuan tersebut maka sekuens primer PCR harus spesifik dan terletak pada daerah lestari (tidak ada mutasi) atau conserve sehingga tidak terjadi mismatch dan unmatch. Hibridisasi dan amplifikasi harus terjadi pada semua variasi sekuens DNA gen target dan sebaliknya tidak boleh terjadi hibridisasi dan amplifikasi pada tempat yang tidak diinginkan (bukan gen target). 3,4 Primer PCR dapat didesain menggunakan bantuan program komputer, baik online maupun offline, misalnya Primer BLAST, IDT, PerlPrimer, Primer3 dan lain sebainya. Primer PCR juga bisa didesain secara manual dengan tetap memperhatikan beberapa ketentuan yang berlaku. Penggunaan program komputer dapat mempermudah kita dalam merancang 545

primer secara cepat sesuai dengan kebutuhan, misalnya GC Clamp, Tm, panjang primer, panjang produk dan lain sebagainya. Akan tetapi, untuk beberapa kasus seperti pada gen dengan karakteristik khusus, misalnya homologi sekuens DNA yang sangat tinggi antar atau interspesies dan variasisekuens yang sangat tinggi intraspesies (target)menjadi hambatan tersendiri. Dalam hal ini, desain primer PCR secara manual bisa menjadi pilihan, kendatipada umumnya tetap membutuhkan bantuan program komputer untuk analisis lebih lanjut. 5,6,7,8 Salah satu gen yang memiliki karakteristik khusus adalah gen tox/dtx, penyandi sintesis toksin difteri padabakteri penyebab difteri (potentially toxigenic Corynebacteria), meliputi C.diphtheriae, C.ulcerans dan C.pseudotuberculosis.Gen dtx dikatakan spesial karena memiliki sekuens DNA yang sangat bervariasidiantara ketiganya, meskipun sama-sama mengkode sintesis toksin difteridan dapat menimbulkan gejala penyakit yang serupa. 9,10 Selain itu, gen dtx memiliki kemiripan sekuens DNA dengan pseudogene (gen dtxpada strain non-toxigenic tox gene bearing atau NTTB) yang terbukti tidak mampu mengkode sintesis toksin difteri, sebagaimana dikemukakan oleh Hall, et.al dan Zakikhany, et al. 11,12 Dalam hal ini, PCR untuk pemeriksaan difteri biasanya tetap akan mendeteksi pseudogene tersebut sebagai gen dtx sehingga akan ada perbedaan hasil antara pemeriksaan PCR yang berbasis genotip dan metode konvensional yang berbasis fenotip. 13 Penelitian ini bertujuan untukmendapatkan susunan primer PCR yang tepat dalam pemeriksaan toksigenisitas bakteri penyebab difteri dengan PCR konvensional. Primer PCR tersebut diharapkan dapat digunakan untuk membedakan gen dtxatau tox dari pseudogene strain NTTB.Hal ini perlu dilakukan untuk meminimalisasi perbedaan hasil PCR dengan metode konvensional sebagai gold standard. Metode Penelitian Ada 3 pasang primer PCR (3 forward dan 2 reverse)yang didesain pada penelitian ini untuk identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri secara detil. Sepasang primer digunakan untuk deteksi gen dtx atau tox (baik true maupun pseudogene )seperti halnya primer PCR yang sudah digunakan selama ini. 13-17 Dua pasang primer yang lain digunakan untuk membedakan gen dtx dari pseudogene. Primer PCR didesain secara manual berdasarkan data sekuens DNA gen dtxdan pseudogene C.diphtheriae, C.ulcerans, dan C.pseudotuberculosis yang terdaftar di GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) dan beberapa literatur lainnya. 11,12 Seluruh data yang dibutuhkan diunduh melalui jaringan internet. Alignment sekueans DNA dilakukan menggunakan program BioEdit. 18 Daerah spesifik untuk pseudogene (beda dengan gen dtx) diamati satu per satu agar dapat mendesain primer spesifik yang membedakannya dari gen dtx. Setelah ditemukan lokasi yang dapat digunakan untuk tempat penempelan primer, dilakukan desain kandidat primer PCR dengan menentukan panjang sekuens primer, panjang amplikon dan mengubah salah satu primer dengan sekuens reverse transcript. Kandidat pasangan primer yang diperoleh diuji dengan program perlprimer untuk menghitung besarnya ikatan primer dimer, adanya run, Tm primer dan lain sebagainya. 19 Hal yang sama dilakukan dalam desain primer untuk deteksi gen dtx secara umum. Pada akhirnya didapatkan 3 pasang primer PCR (3 forward dan 2 reverse) untuk menentukan apakah bakteri yang diperiksa bersifat nontoksigenik (tidak memiliki gen dtxdan tidak menghasilkan toksin), toksigenik (memiliki gen dtx dan menghasilkan toksin), atau NTTB (memiliki gen dtx tapi tidak menghasilkan toksin). Hasil Penelitian Sebanyak 26 sekuens gen dtx dan 10 sekuens pseudogene bakteri penyebab difteri yang terdaftar di GenBank maupun terpublikasi dalam jurnal berhasil dikumpulkan. Berdasarkan analisis sekuens DNA gen dtx dan pseudogene (data tidak ditampilkan), ada beberapa mutasi (substitusi dan delesi) basa nukleotida pada pseudogene. Mutasi-mutasi tersebut dapat dimanfaatkan sebagai referensi untuk mendesain primer PCR yang dapat membedakan gen dtx dari pseudogene dengan cara deteksi gen dtx tanpa pseudogene atau sebaliknya. Ada2 delesi yang ditemukan pada pseudogene, masing-masing basa ke-25 dan ke-55. Delesi basa ke-25 terlihat pada 4 dari 10 sekuens pseudogene,sementara delesi basa ke-55terlihat pada 6yang lain dari 10 sekuens pseudogene yang dianalisis. Mutasi berupa substitusi terlihat pada basa ke-60 (2 sekuens), ke-432 (1 sekuens), ke-651 (4 sekuens), ke-937 (4 sekuens), dan basa ke-1206 (4 sekuens). Diantara tempat yang sudah didapatkan tersebut, hanya delesi basa ke-25 dan ke-55 yang paling memungkinkan untuk membedakan seluruh pseudogene dari gen dtx. Berdasarkan kenyataan ini, basa ke-25 dan ke-55 dipilih untuk dijadikan target penempelan ujung 3 primer PCR. Permasalahan selanjutnya muncul karena jarak keduanya sangat dekat sehingga sulit untuk mendapatkan sepasang primer (forward dan reverse) dari kedua daerah tersebut. Selain itu, di sekitar lokasi basa tersebut tidak didapatkan daerah yang 100% lestari (conserve). Upaya yang paling memungkinkan untuk mendapatkan pasangan primer PCR adalah menggunakan skema 2 forward primer dan 1 reverse primer dengan panjang amplikon sedikit berbeda. Perbedaan panjang amplikon sekitar 30 bp dari 2 forward yang berbeda tersebut disamarkan dengan mendesain reverse primer yang terletak cukup jauh sehingga menghasilkan amplikon >500 bp. Perbedaan panjang amplikon 30 bp akan samar pada visualisasi hasil PCR di gel agarose.dalam hal ini, kelestarian sekuens tidak dijadikan prioritas pertama, dengan catatan masih bisa ditoleransi. 546

Kandidat pasang primer PCR yang diperoleh adalah sebagai berikut F1pseudo 5 -GCAGAAA(A G)CTGTTTGCGTCAT-3 F2pseudo 5 - GCGCTACTG(G T)GGATAGGGC-3 Rpseudo 5 -CTTAACGCTTTCGCCTGTTCC-3 Pada sekuens gen dtx, ketiga primer tersebut barada pada posisi basa ke-5 sampai dengan basa ke-25 untuk F1pseudo, basa ke-37 sampai dengan basa ke-55 untuk F2pseudo serta basa ke-554 sampai dengan basa ke-534 untuk Rpseudo. Panjang amplikon yang terbentuk adalah 517 bp dan 539 bp. Dua pasang kandidat primer yang terdiri dari 3 buah tersebut diuji menggunakan software PerlPrimeruntuk memprediksi masalah yang akan timbul jika diaplikasikan pada pemeriksaan. Ringkasan hasil analisis primer pseudogene dapat dilihat pada Tabel 1yang menunjukkan bahwa 2 pasangan primer pseudogene cukup baik sebagai kandidat primer PCR, meskipun salah satu GC content primer 63%(sebaiknya 40 % - 60 %). GC clampterdapatpada 5 basa ujung 3, panjang primer antara 18-30 bp, Tm antara 55 oc 65 oc, panjang produk PCR 517 bp dan 539 bp yang akan samar bila diseparasi dengan gel elektroforesis. Selain itu, ikatan primer-dimer tertinggi adalah 5,27 kcal/mol. Ikatan tersebut tidak termasuk jenis 3 extensible sehingga diharapkan tidak mempengaruhi proses amplifikasi. Selain itu,beberapa literatur juga menyebutkan bahwa ikatan atau delta G sampai -7 kcal/mol, bahkan sampai -9 kcal/mol masih bisa dipakai untuk menjalankan sebuah reaksi PCR.20,21 Tabel 1. Ringkasan Hasil Analisis Primer pseudogene dengan Pearl Primer Forward 1 Forward 2 Reverse Panjang Produk Ikatan Primer dimer Run> 4 Repeats> 3 21 basa GC 47 % Tm 62,83 oc 19 basa GC 63 % Tm 62,99 oc 21 basa GC 52% Tm 62,61 oc 539 bp dan 517 bp Extensible primer-dimers tertinggi -4.30 kcal/mol Non-extensible primer-dimers tertinggi - 5.27 kcal/mol Tidak ditemukan Tidak ditemukan Setelah primer untuk membedakan gen tox dan pseudogene diperoleh, desain primer PCR dilanjutkan untuk deteksi gen dtx secara keseluruhan. Dalam hal ini termasuk pseudogene yang akan dideteksi karena titik perbedaan kedua gen telah digunakan pada desain primer sebelumnya. Desain primer yang kedua ini bertujuan untuk membedakan antara strain non-toksigenik dengan strain toksigenik maupun NTTB. Alignment sekuens DNA gen dtx dan pseudogene sebagaimana terlihat pada Gambar 1 menunjukkan bahwa sangat sulit mendapatkan daerah yang 100% lestari diantara 3 spesies bakteri penyebab difteri. Gambar 1. Analisis Pasang Primer dtx dengan PerlPrimer Beberapa daerah lestari yang cukup panjang untuk tempat penempelan primer, seperti basa ke-757 sampai dengan ke784 dan basa ke-1141 sampai ke-1169 tidak memenuhi syarat sebagai tempat penempelan kandidat primer PCR yang baik. Hal ini dikarenakan pada daerah tersebut terdapat run dan GC content sangat rendah. Dua daerah yang pada akhirnya dipilih sebagai tempat penempelan kandidat primer adalah basa ke-1263 sampai dengan ke-1287 untuk forward primer dan basa ke-1436 sampai dengan basa ke-1410 untuk reverse primerdengan panjang amplikon 174 bp. Pada daerah tersebut terdapat mutasi (substitusi) basa, namun masih dapat ditoleransi. 547

Sekuens kandidat primer untuk deteksi gen dtx dan pseudogene secara keseluruhan adalah sebagai berikut Fdtx 5 -CAGTTGGAACACTGTTGAAGATTCG-3 Rdtx 5 -CCATTTACGGAAATATGAGTCTTGGAC-3 Gambaran analisis pasang primer dtx dengan software PerlPrimer dapat dilihat pada Gambar 1. Pada gambar 1 menunjukkan bahwa kedua primer tersebut cukup baik untuk diaplikasikan dalam pemeriksaan. Hal ini terlihat dari Tm primer yang berdekatan, panjang primer 18-30 basa, dan GC content 40-60 %. Risiko ikatan primer-dimer juga tidak ada yang lebih dari negatif dari -7 kcal/mol dan tidak ditemukan adanya run serta repeats. Tiga pasang (5 buah) primer PCR yang berhasil didesain dapat diuji coba dalam aplikasi PCR konvensional untuk identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri dengan teknik PCR multipleks.gambaran interpretasi hasil pemeriksaan PCR multipleks dapat dilihat pada Gambar 2. 1 kbp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp Gambar 2. M 1 2 3 4 539 bp 517 bp Interpretasi Hasil Pemeriksaan PCR Multipleks Marker 100 bp (M), Strain NTTB (1), Strain NTTB (2), Strain Toksigenik (3), dan Strain Non-toksigenik (4). Gambar 2 menunjukkan adanya 4 interpretasi hasil dari aplikasi 3 pasang kandidat primer yang berhasil didesain. Pada strain NTTB akan terdeteksi 2 target primer PCR (pseudogene) di lokasi yang berbeda. Pada strain toksigenik akan terdeteksi 1 target primer PCR (gen dtx). Pada strain non-toksigenik tidak terdeteksi gen target. Dengan demikian dapat dibedakan ketiga jenis toksigenisitas bakteri tersebut dengan pemeriksaan PCR. Pembahasan Gen dtx merupakan penyandi produksi toksin difteri pada 3 spesies bakteri penyebab difteri yang dikenal dengan potentially toxigenic Corynebacteria. Gen ini dibawa oleh Corynephage yang masuk (terinsersi) ke dalam materi genetik bakteri. Pada Corynephage, tempat khusus untuk bergabungnya meteri genetik ini disebut dengan attp site, sedangkan pada bakteri disebut attb site. Dalam 1 strain bakteri dapat diinsersi oleh lebih dari 1 faga dan tidak semua faga tersebut membawa gen tox. Faga yang membawa gen tox disebut phage tox + dan yang tidak membawa gen tox disebut phage tox -. 22,23 Dalam menjalankan perannya, gen dtx diregulasi oleh gen lain dalam kromosom bakteri yang dikenal dengan gen dtxr dengan Fe sebagai ko-faktor.fe akan berikatan dengan protein dtxr yang akan menghambat sintesis toksin pada proses transkripsi. Meskipun demikian, kadar Fe bukanlah satu-satunya faktor yang mempengaruhi produksi toksin difteri.faktor lain, diantaranya kultur berulang di laboratorium, mutasi gen dan beberapa hal yang belum jelas mekanismenya terbukti dapat mempengaruhi produksi toksin difteri. 24-26 Penemuan pseudogene pada 4 isolat C.diphtheriae di Jepang oleh Hall, et.al. menjadi menarik. Hal ini karena keempatnya memiliki sekuens DNA yang sangat mirip dengan gen dtx, namunbersifat nontoksigenik. 11 Sebaliknya, meskipun beberapa sekuens gen dtx C.diphtheriae, C.ulcerans dan C.pseudotuberculosis bervariasi, sebagaimana terlihat pada Gambar 1, ketiganya mampu memproduksi toksin difteri (toksigenik). 27-29 Oleh karena itu, desain primer PCR untuk amplifikasi seluruh variasi gen dtx dari ke-3 spesies potentially toxigenic Corynebacteriatersebut tanpa amplifikasi pseudogene cukup rumit. Selain variasi antar ke-3 spesies yang cukup tinggi, variasi antar strain dalam masing-masing spesies juga harus diperhatikan. Beberapa persyaratan yang perlu diperhatikan dalam desain primer PCR antara lain GC content 40 %-60%, Tm 55-65 o C, GC Clamp pada 5 basa ujung 3, panjang primer 18 30 bp, tidak ada hairpindan pengulangan (run dan repeat) lebih dari 4 basa. 3,4 Khusus untuk PCR multipleks, panjang masingmasing produk PCR harus dibuat sedemikian rupa sehingga bisa dibedakan satu sama lain. Ada beberapa masalah yang harus diperhatikan dengan kandidat primer pseudogene yang diperoleh bila menggunakan sekuens asli yang sama dengan sekuens pseudogene. Pada primer F1pseudo terdapat daerah palindromik yang berrisiko membentuk hairpin dan dapat mengganggu proses hibridisasi. Selain itu pada primer tersebut terdapat run (AAAA) yang sebaiknya dihindari pada desain primer PCR. Kedua masalah tersebut dapat diatasi dengan melakukan modifikasi sekuens dengan mengganti basa A menjadi basa G seperti terlihat dalam kurung. Pada primer F2pseudo juga terdapat run (GGGG) dan GC content sangat tinggi. Hal ini dapat menyebabkan terjadinya penempelan primer tidak pada 548

tempatnya (mismatch). Oleh karena itu salah satu basa G dimodifikasi menjadi basa T seperti terlihat dalam kurung. Pada sekuens DNA yang menjadi tempat penempelan ketiga pasang primer didapatkan beberapa mutasi basa, dengan kata lain bahwa daerah tersebut kurang conserve. Namun demikian, mutasi tersebut masih bisa ditoleransi karena umumnya hanya 1 basa dan tidak terletak pada ujung 3 primer. Mutasi pada ujung 3 primer akan menyebabkan kegagalan amplifikasi sekuens karena tidak terjadi elongasi atau pemanjangan. 30 Kesimpulan dan Saran Penelitian ini berhasil mendesain primer baru untuk PCR konvensional yang secara Bioinformatika dapat digunakan untuk identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri, termasuk membedakan strain NTTB dari strain toksigenik.uji yang dilakukan baru sebatas perhitungan dengan software Bioinformatika (in silico)sehingga masih membutuhkan uji lebih lanjut untuk aplikasi langsung di mesin PCR. Aplikasi PCR dengan primer baru membutuhkan optimasi prosedur yang disesuaikan dengan reagen maupun mesin yang digunakan. Ucapan Terima Kasih Ungkapan terima kasih kami sampaikan kepada seluruh pihak yang telah berperan dalam penelitian dan publikasi ini. Daftar Pustaka 1. Budiarto BR. Polymerase Chain Reaction (PCR) Perkembangan dan perannya dalam diagnostik kesehatan. BioTrends. 2015; 6(2)29-38. 2. Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U. Rapid detection and molecular differentiation of toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Strains by LightCycler PCR. J Clin Microbiol. 2011;49(7)2485-2489. 3. Yuryev A. Editor. Methods in Molecular Biology PCR Primer Design. 2007; New Jersey Hummana Press. 4. Garibyan L & Avashia N. Research techniques made simple Polymerase Chain Reaction (PCR). J Invest Dermatol. 2013;133(3) e6.doi10.1038/jid.2013.1 5. Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S and Madden TL. Primer-BLAST A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics 2012, 13134 6. Patel NK & Prakash N. Principle and tools for primer design. Atmiya Spandan. 2013;1(1)79-95 7. Nakamura S, Masuda T, Mochizuki A, Konishi K, Tokumaru S, Ueno K and Yamaguchi T. Primer Design for Identifying economically Important Liriomyza Spesies (Deptera Agromyzidae) by Multiplex PCR. Mol. Eco. Resources. 2013;1396-102. 8. Srivastava GP, Hanumappa M, Kushwaha G, Nguyen HT and Dong X. Homolog-specific PCR Primer Design for Profiling Splice variants. Nucleic Acid Research. 2011;1-11. 9. Sekizuka T, Yamamoto A, Komiya T, Kenri T, Takeuchi F, Shibayama K, Takahashi M, Kuroda M, and Iwaki M.Corynebacterium ulcerans 0102 carries the gene encoding diphtheria toxin on a prophage different from the C. diphtheriae NCTC 13129 prophage. BMC Microbiology. 2012;1272 10. Komiya T, Seto Y, De Zoysa A, Iwaki M, Hatanaka A, Tsunoda A, Arakawa Y, Kozaki S, and Takahashi M. Two Japanese Corynebacterium ulcerans isolatesfrom the same hospital ribotype, toxigenicity and serum antitoxin totre. JMM. 2010;591497-1504. 11. Hall AJ, Cassiday PK, Bernard KA, Bolt F, Steigerwalt AG, Bixler D, Pawloski LC, et.al. Novel Corynebacterium diphtheriae in Domestic Cats. Emerg Infect Dis. 2010; 16(4)688-691. 12. Zakikhany K, Neal S, and Efstratiou. Emergence and molecular characterization of non-toxigenic tox gene-bearing Corynebacterium diphtheriae biovar mitis in the United Kingdom, 2003-2012. Euro Surveill. 2014;19(22)1-8. 13. Efstratiou A, Engler KH, Dawes CS, and Sesardic D. Comparison of Phenotypic and Genotypic Methods for Detection of Diphtheria Toxin among Isolates of Pathogenic Corynebacteria. J.Clin. Microbiol.1998;36(11)3173-3177. 14. Torres LdeF. Ribeiro D, Hirata Jr R, Pacheco LG, Souza MC, dos Santos LS, dos Santos LS, Salah M, Costa MM, Ribeiro MG, Selim SA, Azevedo VA, Mattos-Guaraldi AL. Multiplex polymerase chain reaction to identify and determine the toxygenicity of Corynebacterium spp with zoonotic potenticl and an overview of human and animal infections. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2013;108(3)272-279. 15. Sunarno, Sariadji K, Wibowo HA. Potensi Gen dtx dan dtxr Sebagai Marker untuk Deteksi dan Pemeriksaan Toksigenisitas Corynebacterium diphtheriae. Bul.Penelit. Kesehat. 2013;41(1)1-10. 16. Pimenta FP, Hirata R, Rosa ACP, Milagres LG and Mattos-Guaraldi AL. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Corynebacterium diphtheriae and differentiation between non-toxigenic and toxigenic isolates. JMM.20081438-1439. 17. Schuhegger R, Lindermayer M, and Kugler R. Detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans strains by a Novel Real-Time PCR.J Clin Microbiol. 2008;46(8)2822-2823. 18. Hall T. BioEdit An important software for molecular biology. GERF Bulletin of Biosciences. 2011;2(1)60-61. 19. Marshall OJ. PerlPrimer cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphate and real-time PCR. Bioinformatics Appl Note. 2004;20(15)2471-1472. 20. Abu-Almaali HM, Alkhatabi HA, Nasr-Allah HA, and Al-Khafaji ZM. Duplex PCR primer for detection of Helicobacter pylori DNA directly from gastric biopsy samples. Kerbala J Phar Sci 2012;3201-211. 21. Dwivedi B, Schmieder R, Goldsmith DB, Edwars RA, and Breitbart M. PhiSiGns an online tool to identify signature genes in phages and design PCR primers for examining phage diversity. BMC Bioinformatic. 2012;1337. 22. Sangal V & Hoskisson PA. Corynephages Infections of the Infector. In Burkovski A, Editor. Corynebacterium diphtheriae and Related Toxigenic Species. 2014. Springer. http//libgen.org/ (Accessed 27 February 2015). 23. Seto Y, Komiya T, Iwaki M, Kohda T, Mukamoto M, Takahashi M and Kozaki S. Properties of Corynephage Attachment site and molecular epidemiology of Corynebacterium ulcerans isolated from humans and animals in Japan. Jpn. J. Infect. Dis. 2008;61116-122. 24. Mercant AT & Spatafora GA. A role for the DtxR family of metalloregulators in gram-positive pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 2014;291-10. 25. Tao D Aquino JA, Tetenbaum-Novatt J, White A, Berkovitch, and Ringe D. Mechanism of metal ion activation of the diphtheria toxin repressor dtxr. PNAS. 2005;102(51)18408-18413. 26. Holmes RK. Biology and Molecular Epidemiology of Diphtheria Toxin and the tox Gene. JID. 2000;181(Suppl 1)1S156 S167. 27. Wagner KS, White JM, Lucenko I, Mercer D, Crowcroft NS, Neal S, and Efstratiou A. Diphtheria in the Postepidemic Period, Europe, 2000-2009. EID. 2012;18(2)217-225. 28. Dias AASO, Santos LS, Sabbadini PS, Santos CS, Silva FCJr, 549

Napoleao F, Nagao PE, Villas-Boas MHS, Hirata RJr, Guaraldi ALM. Corynebacterium ulcerans diphtheria an emerging zoonosis in Brazil andworldwide. Rev Saude Publica. 2011;45(6)1-16. 29. Selim SA, Mohamed FH, Hessain AM, and Moussa IM. Immunological characterization of diphtheria toxin recovered from Corynebacterium pseudotuberculosis. Saudi J Biol Sci. 2016;23(2)282-287. 30. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. 2012;e3998,doi10.3791/3998. 550