METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini telah dilaksanakan selama 5 bulan mulai bulan Juli sarnpai bulan Desember 2007 di Bagian Patologi, Laboratorium Farmasi, Laboratorium Patologi Klinilc, Departemen Kinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedolcteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Pada penelitian ini dipergunakan alat-alat sebagai berikut: erlenmeyer, evaporator, oven, mikroskop, hemositometer (kamar hitung, pipet eritrosit, pipet leulcosit, aspirator), mikrohematokrit kapilaritube, Henzatocrit reader, sentrifuse, Hemometer. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang kunyit, etil asetat, air, etanol 96%, vaselin kuning, crestoseal, larutan pengencer Hayem, larutan pengencer Turk, HCI 0,l N, aquadestilata. Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan adalah 40 ekor mencit jantan berumur 2 bulan yang dibagi menjadi 4 kelo~llpolc dengan setiap kelompoknya 10 ekor mencit. Metode Penelitian Pembuatan Simplisia Pembuatan simplisia dilakukan dengan menjemur kunyit yang sudah diiris-iris di bawah terik matahari dengan ditutup plastik sampai kering. Simplisia tersebut dihaluslcan menjadi seperti serbuk. Pembuatan Ekstrak Icunyit Sebanyalc 1 bagian serbuk kunyit direnda~n (maserasi) dengan 10 bagian etanol 96%, lalu dimasukan ke dala~n bejana tertutup selama 24 jam dengan sesekali diadulc. Maserat dipisahlcail da11 diproses ulang selama 3 kali (triplo)

2 dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Ekstraksi dihentikan jika filtrat berwama jernih. Filtrat yang diperoleh kemudian diuaplcan dengan evaporator pada tekanan rendah dan suhu tidak lebih dari 50 OC sampai beratnya konstan (ekstrak semi padat). Ekstrak semi padat yang dihasilkan kemudian difraksinasi deilgan menggu~lalcan pelarut air dan etil asetat. Hasil fraksinasi kemudian dievaporasi dan dioven dengan temperatur 40 OC selama 24 jam hingga membentuk ekstrak lcental. Penapisan Fitokimia Dilakukan pellapisan fitokimia dari hasil ekstraksi untuk mengetahui kandungan ballan aktif dengan menggunakan metode Harbo~nk (1987) sebagai berikut : Uji Alkaloid Serbuk si~nplisia dibasakan dengan 3 tetes ammonia, kemudian ditambahkan kloroform. Filtrat ditambahkan 10 tetes H2S04 2M. I-Iasil positif apabila ditanlbahlcai~ Meyer menjadi endapan putih dan coklat dengan penambahan pelarut Rx Wagner. Uji Flavonoid Serbuk si~nplisisa dipanaskan dengan calnpuran metan01 dail logan1 Magnesium. Adanya flavonoid akan menyebabkan filtrat berwarna merah setelah penamballan 5 tetes NaOH 10%. Uji Saponin Serbuk simplisia dipanaskan dengan air dalam tabung reaksi. Kemudian dikocolc kuat-kuat kurang lebih 30 detik. Pembentulcal busa 10 menit kemudian menunjukkan bahwa dalam sampel terdapat saponin. Uji Tanin Serbuk siinplisia ditarnbahkan dengan air, kemudian dididilkan. Pada filtrat ditambahkan larutan 5 tetes FeC13 1%. Sehingga terbentuk warna biru tua atau hitam lcehijauan. I-Ial ini menunjuldtan bahwa sampel tersebut positif

3 Uji Kuinon Serbuk simplisia ditambahkan air kemudian dididihkan. Pada filtrat diberi NaOH 15%. Adanya senyawa kuinon ditandai dengan terjadinya warna kuning hingga merah. Uji Fenol Serbuk simplisia ditambahkan lasutan pereaksi FeC13 1% sebanyak 5 tetes. Adanya senyawa fen01 ditandai dengal terbentulmya wama ungu, biru atau hijau. Pembuatan Salep Untuk pembuatan salep, 1 bagian ekstrak dari masing-masing fraksi air dan etil asetat dicampur dengan 4 bagian bahan dasar salep (vaselin). Dihomogenkan di mortar dan lcemudian disimpan dalam pot plastilt yang te~tutup dan tidak berwarna. Perlukaan Pada Mencit Sebelum melakukan perlukaan, rambut di sekitar punggung mencit dicukur dan didiamkan selama dua hasi. Sebelum disayat, kulit mencit diseka dahulu dengan kapas beralkohol 70 %. Mencit diberi anastesi perinhalasi dengan eter, kemudian dilakukan penyayatan pada punggung mencit dengan menlbuat sayatan sepanjang satu centimeter sejajar 0s. Vertebrae menggu~lakan scalpel yang steril. Pengelompokan Perlakuan Kelompolc K+: Kontrol positif, kelompok mencit yang dilulcai dan diberi obat luka komersil Kelompok K-: IControl negatif, kelompok mencit yang dilukai nanlull tidak diberikan pengobatan Perlakuan PE : Kelonlpok mencit yang dilukai dan diberiltan pengobatan dengall sediaa~l salep kunyit dengan pelarut etil asetat Perlakuan PA : Kelompok mencit yang dilukai dan diberikan pengobatan dengall sediaan salep kunyit dengan pelarut air

4 Pemberian Obat Lulia Komersil dan Salep Kunyit Obat luka komersil (ekstrak placenta 0,5 %, neomycin sulfate 10 % dan jelly base) dan sediaan salep kunyit dioleskau pada luka dengan menggunakan cotton buds. Aplikasi obat dilakukan setiap hari sebanyak dua kali sehari selama 21 hari pasca perlukaan. Pengambilan darah Pengambilan sampel darah dilakukan pada hari ke-2, 4, 7, 14, dan 21 pasca perlukaan. Sebelum penganlbilan darah terlebih dahulu dilakukan pe~nbiusa~l dengan eter. Darah diambil sebanyak i 2 ml dengan spoit langsung dari jantung dau ditampung dengan venoject yang diisi antikoagulan. Antilcoagulan yang digunakan adalah Ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA). Analisa darah Perhituugan jumlah eritrosit Salnpel darah dihisap menggunakan pipet eritrosit hingga tanda tera 0.5 dengall aspirator. Ujung pipet dibersilkan dengan menggunakan tissue, lalu pengencer hayem dihisap hingga tanda 101. Pipet digerakan memutar dengan membentuk angka 8 selama 3 menit. Setelah homogen, cairan yang tidak terkocok pada ujung pipet dihilangkan dengan mene~npelkan ujung pipet ke kertas tissu. Setelah itu teteskan satu tetes ke dalam hemositometer, usahakan jangan sampai ada udara yang masuk. Setelah itu dibiarkan selama beberapa saat sehingga cairan mengeudap, lalu penghitungan dapat dimulai. Agar tidak terjadi penghitungan dobel maka sebailurya ~nenggunakan hand counter. di bawah mikroskop dengan pembesaran 45x10. Jumlah leukosit yang didapat dari hasil perhitungan dilcaliltan dellgall lo4 untulc mengetahui jumlah eritrosit dalam 1 mm3 darah. JumIah Total Eritrosit = a x 10~1mm~ Keterangan : a adalah jumlah eritrosit hasil penghitungan dalam hen~ositon~eter

5 Perhitungan jumlah leukosit Sampel darah dihisap menggunakan pipet leukosit hingga tanda tera 0.5 dengan aspirator. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tissue, lalu larutan pengencer Turk yang memiliki kandungan berupa asam asetat glasial dan pewarna Gentian Violet dihisap hingga tanda 11. Kemudian pipet digerakkan nmemutar dengan nmembentuk angka 8 selama 3 menit. Setelah homogen, cairan yang tidak terkocok pada ujung pipet dihilangkan dengan menempelkan ujung pipet ke kertas tissu. Setelah itu teteskan satu tetes ke dalam hemositometer, usahakan jangan sampai ada udara yang masuk. setelah itu dibiarkan selama beberapa saat sehingga cairan mengendap, lalu penghitungan dapat dimulai. Agar tidak terjadi penghitungan dobel ~naka sebaiknya menggunakan hand counler. di bawah lnikroskop dengan pembesaran 45x10. Jumlah leukosit yang didapat dari hasil perhitungan dikalikan 50 untuk mengetalmui jumlah leukosit setiap 1 mm3 daral~. Jumlah Total Leukosit = c x 50/mm3 Keterangan: c adalah julnlah leukosit hasil penghitungan dalam hemositometer Penentuau kadar hemoglobin Penentuan kadar hemoglobin dilakukan dengan menggunakan metode Sahli. Prinsip nletode ini adalah mengukur konsentrasi henlatin yang dibeutulc ole11 daralm dengan HC1. Prosedur metode ini yaitu darah dipipet dengan pipet Sahli sebamyak 0.02 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung Sahli yang berisi HC1 0,l N sampai batas terbawah, kemudian didiamkan kurang lebih 3 menit satnpai terbentuk asam hematin yang berwarna coklat tua. Warna tersebut kemudian disamakan dengan warna standar sahli dengan ditambahkannya aquadestilata sedikit demi sedikit ke dalam tabung sampel. Setelah warnanya sama, nminiskus akhir dibaca pada skala yang menunjukkan kadar hemoglobin. Perhitungan uilai hematokrit Penghitungan nilai hematolwit atau Paclced Cell Volunfe (PCV) dilalcukan dengan menggnnakan metode mikrolmematolcrit. Prinsip lcerjanya adalah

6 memisahkan sel-sel darah dari plasma yang terdiri dari butir-butir darah merah diultur dan dinyatakan sebagai persen volume dari lteseluruhan darah. Prosedur untuk metode ini adalah darah diarnbil dengan mikrohematokrit kapilaritub hingga 314 dari tabung tersebut dan ditutup dengan crestoseal. Kemudian disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan rpm. Selanjutnya diukur persen volume sel darah merah dengan mikrohematolcrit reader. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisa menggunakan Analisis Sidik Raganl (ANOVA) dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dan dilanjutkan deugan Uji Jarak Berganda Duncan (Duncan's Multiple Range Test) untuk mengetahui perbedaan perlakuan yang ada. Nilai probabilitas (P < 0,05) diterima sebagai hasil yang berbeda nyata (Mattjik dan Sumertajaya 1999).