BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Alat dan Bahan Alat Bahan Hewan Percobaan

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmasi dan Bagian Patologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan. Laboratorium Kimia Fisik, Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Pada bulan Mei 2009 sampai dengan bulan Juni Alat dan Bahan Alat Kotak plastik (beralaskan sekam) dan kawat untuk kandang mencit, anaerobik jar untuk anastesi, peralatan bedah (gunting anatomis untuk bedah, scalpel), plastik, timbangan, kaca arloji, sendok kecil, kertas perkamen, cawan porselin dan penangas air, mikrotom, gelas objek dan gelas penutup, mikroskop. Bahan Sediaan gel rimpang kunyit (fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat), sediaan gel komersial, sediaan gel plasebo, eter untuk euthanasia, larutan neutral buffer formalin 10% untuk fiksasi, kapas dan bahan-bahan untuk sediaan histopatologi yaitu larutan Mayer s Hematoxylin, larutan Eosin, Xylol, alkohol dengan konsentrasi yang bertingkat (70%, 80%, 90%, 95%, 100%), larutan Lithium Carbonat, akuades, asam asetat 1%, Schiff Reagent, air sulfit, larutan Mordant, larutan Carrazi s Hematoxylin, larutan Orange G 0,75%, larutan Ponceau Xylidine Fuchsin, larutan Phosphotungstic Acid 2,5%, Anilin Blue dan parafin. Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus albinus) strain DDY umur 4-6 minggu. Mencit dipelihara di dalam kandang individual dari kotak plastik yang pada bagian atasnya diberi kawat kasa sebagai penutup sekaligus tempat pemberian pakan dan minum. Alas digunakan alas sekam yang berfungsi untuk menjaga suhu dan menyerap urin. Pakan yang

2 23 diberikan yaitu pakan komersial berbentuk pelet dan minum secara ad libitum. Sekam pada kandang mencit diganti 3 hari sekali. Metode Penelitian Pengumpulan Bahan dan Determinasi Tanaman. Pada penelitian ini digunakan rimpang kunyit yang didapatkan dari Balitro Bogor. Determinasi rimpang kunyit dilakukan di Herbarium Bogoriensis untuk mengetahui spesies dari tanaman kunyit yang digunakan. Ekstraksi dan Fraksinasi Rimpang Kunyit Ekstraksi simplisia rimpang kunyit dilakukan dengan metode maserasi selama 3X24 jam dengan pelarut etanol 96%. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 C dan 50 rpm sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak etanol dipartisi dengan n-heksan, lapisan n-heksan dipekatkan. Lapisan air kemudian dipartisi dengan etil asetat. Lapisan etil asetat dan lapisan air yang diperoleh dipekatkan, sehingga diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat. Penapisan Fitokimia Ekstrak dan Fraksi Rimpang Kunyit Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui adanya senyawa yang termasuk dalam metabolit sekunder antara lain: alkaloid, flavonoid, tanin, steroid, kuinon, dan saponin. Prosedur penapisan fitokimia yang digunakan adalah metode Fransworth (1966) yang dimodifikasi dijelaskan sebagai berikut: Senyawa Alkaloid Serbuk simplisia dibasakan dengan amonia, kemudian ditambahkan kloroform, digerus kuat-kuat. Lapisan kloroform dipipet sambil disaring, kemudian kedalamnya ditambahkan asam klorida 2N. Campuran dikocok kuatkuat hingga terdapat dua lapisan. Lapisan asam dipipet, kemudian dibagi menjadi 3 bagian: Kepada bagian 1 ditambahkan pereaksi Mayer, terjadinya endapan atau kekeruhan diamati. Bila terjadi kekeruhan atau endapan berwarna putih berarti dalam simplisia kemungkinan terkandung alkaloid. Bagian 2 ditambahkan

3 24 pereaksi Dragendorff, terjadinya endapan atau kekeruhan diamati. Bila terjadi kekeruhan atau endapan berwarna jingga kuning berarti dalam simplisia kemungkinan terkandung alkaloid. Bagian 3 digunakan sebagai blangko. Senyawa Tanin tangas air, kemudian disaring. Kepada filtrat ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida sehingga terjadi warna hijau-biru hitam hingga hitam, kemudian ditambahkan larutan gelatin 1%. Adanya senyawa tanin ditandai dengan terjadinya endapan berwarna putih. Senyawa Flavonoid Simplisia dipanaskan dengan campuran logam Magnesium dan asam klorida 5N, kemudian disaring. Adanya flavonoid akan menyebabkan filtrat berwarna merah yang dapat ditarik oleh amil alkohol. Untuk lebih memudahkan pengamatan, sebaiknya dilakukan percobaan blangko. Senyawa Kuinon tangas air, kemudian disaring. Filtrat ditambahkan larutan KOH 5%. Adanya senyawa kuinon ditandai dengan terjadinya warna kuning hingga merah. Senyawa Saponin tangas air, kemudian disaring. Setelah dingin filtrat dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selama lebih kurang 30 detik. Pembentukan busa sekurang-kurangnya setinggi 1 cm dan persisten selama beberapa menit, serta tidak hilang pada penambahan satu tetes asam klorida encer, menunjukan bahwa dalam simplisia terdapat saponin. Senyawa Polifenolat tangas air, kemudian disaring. Kepada filtrat ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida. Adanya senyawa fenolat ditandai dengan terjadinya warna hijau-biru hitam hingga hitam.

4 25 Formulasi Gel Fraksi n-heksan dan Gel Fraksi Etil Asetat Rimpang Kunyit. Formula sediaan gel dibuat dengan komposisi sebagai berikut (Herdiana 2007): karbopol sebagai basis gel, trietanolamin sebagai surfaktan dan pembuat basa, metil paraben dan propil paraben sebagai pengawet, propilen glikol sebagai humektan dan kosolven, air suling, ekstrak atau fraksi rimpang kunyit sebagai zat aktif. Pengujian Stabilitas Sediaan Gel Selama Penyimpanan. Evaluasi sediaan dilakukan dengan mengamati karakteristik fisika yang meliputi: organoleptik (warna, bau, kejernihan, konsistensi), ph, viskositas. Organoleptik Pada uji organoleptik diamati perubahan warna, bau, kejernihan, dan konsistensi dari sediaan gel. Pengamatan sediaan dilakukan pada hari ke 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, dan 56 (Herdiana 2007). Pengukuran ph Pengukuran ph dari formula yang dibuat dengan cara mencelupkan kertas ph universal ke dalam gel setelah tercelup dengan sempurna, ph universal tersebut dilihat perubahan warnanya dengan menggunakan standar ph universal. Pengukuran dilakukan untuk masing-masing sediaan pada hari ke 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, dan 56 (Herdiana 2007). Pengukuran Viskositas Pengukuran viskositas sediaan gel dilakukan dengan menggunakan Viscometer TV-10 Toki Sangyo Co. Ltd. (kecepatan 20 rpm, spindle nomor 21 M2). Prosedur pengukuran viskositas sebagai berikut: sediaan yang akan diperiksa ditempatkan dalam wadah bermulut besar, kemudian alat dinyalakan dan didiamkan beberapa lama hingga diperoleh angka yang stabil. Pengukuran dilakukan pada hari ke 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, dan 56 (Herdiana 2007). Uji keamanan Pada uji keamanan digunakan metode patch test. Pengujian dilakukan terhadap 10 orang sukarelawan dengan cara mengoleskan sediaan gel pada punggung tangan. Apabila sukarelawan tidak mengalami iritasi kulit setelah pemakaian gel maka diasumsikan sediaan gel aman digunakan (Sihombing 2007).

5 26 Pengamatan dilakukan terhadap sediaan selama penyimpanan hari ke 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, dan 56. Induksi Hiperglikemia dengan Streptozotocin Induksi hiperglikemia pada hewan coba menggunakan STZ (Eshrat dan Hussain 2002), sebelum diinduksi hewan coba dipuasakan semalam, kemudian disuntik dengan STZ secara intraperitonial (ip). Hewan coba diinjeksi STZ dengan dosis 40 mg/kg BB, kemudian secara interval dilakukan pemeriksaan kadar glukosa darah setiap mencit, untuk mengetahui keberhasilan induksi hiperglikemia. Hewan coba yang digunakan adalah yang mempunyai kadar gula darah 200mg/dl. Pemeriksaan kadar glukosa darah pada hewan coba dilakukan secara berkala diukur dengan glukometer (Eshrat dan Hussain 2002; Mazunder et al. 2005). Sampel darah diambil dari vena pada ekor, pada hari ke 1, 7, 14 dan hari ke 21 setelah penyuntikan STZ atau sampai kadar gula darah mencapai 200 mg/dl. Desain Penelitian Pada penelitian ini digunakan 40 ekor mencit strain DDY umur 4-6 minggu yang dibagi menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor mencit. a. Kelompok KN yaitu kontrol negatif (tidak diobati) b. Kelompok KP yaitu kontrol positif (obat luka komersial Neomycin sulfat 5%) c. Kelompok GE (sediaan gel fraksi etil asetat) d. Kelompok GH (sediaan gel fraksi n-heksan) Perlukaan dilakukan pada punggung mencit dengan membuat sayatan sepanjang 1,5 cm (Halper et al. 2003; Chen et al. 2005). Sebelum dilakukan perlukaan bulu di sekitar punggung dicukur dan dibersihkan dengan alkohol. Gel fraksi etil asetat dan gel fraksi n-heksan rimpang kunyit diberikan secara topikal yaitu dengan cara mengoleskannya pada bagian luka mencit 2 kali setiap hari pada pagi dan sore. Pemberian gel fraksi etil asetat dan gel fraksi n- heksan secara topikal pada luka dilakukan dari hari ke 1 sampai hari ke 21 (Halper et al. 2003). Sebagai pembanding digunakan kelompok KN dan kelompok KP

6 27 Pengamatan Histopatologi pada Hewan Coba Hiperglikemik Pada hari ke 2, 4, 7, 14, 21 pasca perlukaan dilakukan nekropsi untuk mengambil sampel organ kulit. Sampel organ kulit difiksasi dalam larutan Buffer Normal Formalin (BNF) 10%, didehidrasi dengan alkohol berbagai konsentrasi (70%, 80%, 90%, dan alkohol absolut I dan II), clearing dengan xylol dan diembedded dalam parafin. Jaringan dimasukan ke dalam alat pencetak parafin cair dan dibiarkan sampai parafin mengeras. Jaringan dipotong dengan mikrotom dengan ketebalan 5 mikron. Kemudian dilakukan proses rehidrasi dan sediaan diwarnai dengan hematoksilin eosin (HE) dan pewarnaan khusus (Masson Trichrome). Pengamatan histopatologi menggunakan metode lesio skoring menurut metode Chen et al dan Winarsih et al Peubah yang diamati adalah merapatnya lapisan epidermis kulit (reepitelisasi), jumlah sel radang, pembentukan neovaskularisasi (pembentukan pembuluh darah baru), pembentukan jaringan ikat (kolagen). Analisis Data Data yang didapat diuji secara statistika menggunakan uji anova yang dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat ada tidaknya perbedaan yang nyata (P 0.05).