OLEH : Nur Rizqillah NIM:

Transkripsi

1 UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK n-heksan DAUN Garcinia benthami Pierre TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT) Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN OLEH : Nur Rizqillah NIM: PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1434 H/2013 M

2 ii

3 iii

4 iv

5 v

6 vi

7 ABSTRAK Nur Rizqillah. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Toksisitas Akut Ekstrak n- heksan Daun Garcinia benthami Pierre Terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Garcinia benthami Pierre merupakan salah satu spesies dari genus Garcinia di Indonesia.Daun ini mengandung senyawa xanton, kumarin, flavonoida dan terpenoid. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui toksisitas ekstrak n- heksan daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp lethality Test (BSLT). Penelitian ini menggunakan hewan uji 330 ekor larva Artemia salina Leach yang dibagi dalam 10 kelompok. Tiap kelompok terdiri dari 10 ekor, dengan replikasi 3 kali tiap kelompok. Kemudian ekstrak daun Garcinia benthami Pierre dimasukkan dalam konsentrasi akhir 5 ppm,10 ppm,20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, dan 1500 ppm. Pengamatan terhadap larva yang mati 24 jam setelah pemberian ekstrak. Berdasarkan data, LC 50 ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre ditentukan dengan analisis probit menggunakan metode probit. Hasil dari analisis probit menunjukkan harga LC 50 dari ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre adalah 3981 ppm. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak daun Garcinia benthami Pierre tidak mempunyai potensi toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach. Hal ini ditunjukkan dengan harga LC 50 >1000 ppm. Kata kunci : Toksisitas, ekstrak daun Garcinia benthami Pierre, Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ABSTRACT Nur Rizqillah. Medical Education Study Program. Acute Toxicity Test of Garcinia benthami Pierre Extract Against Artemia salina Leach Larvae Using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method Garcinia benthami Pierre is one kind of Garcinia species in Indonesia. The leaves contain xanton, kumarin, flavonoid and terpenoid bioactive coumponds. The aims of the research is determine the lethal toxicity value of Garcinia benthami Pierre n-hexane leaves extract toward Artemia salina Leach larva by Brine Shrimp lethality Test (BSLT) method. This research use 330 larva Artemia salina Leach that devided into 10 groups. Each group consist of 10 animals with three replication. Later Garcinia benthami Pierre leaves extract included in every concentration 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, and 1500 ppm. Observations were made during 24 hours of Artemia salina Leach larvae mortality. Based on the data, LC 50 extract n-hexane Garcinia benthami Pierre leave determined by analysis of probit by using probity method. The result of probity analysis shows LC 50 value from n-hexane extract Garcinia benthami Pierre leave is 3981 ppm. Result indicates that the extract Garcinia benthami Pierre leave didn`t have any potential toxicity to Artemia salina Leach larvae. In this case indicates with LC 50 >1000 ppm. Keywords : Toxicity,Garcinia benthami Pierre extract, BSLT vii

8 DAFTAR ISI LEMBAR JUDUL... LEMBAR PERNYATAAN... LEMBAR PERSETUJUAN... LEMBAR PENGESAHAN... KATA PENGANTAR... ABSTRAK... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang Rumusan masalah Tujuan penelitian Tujuan umum Tujuan khusus Manfaat penelitian Bagi masyarakat Bagi institusi Bagi peneliti... BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Landasan teori Obat Tradisional Toksikologi Garcinia benthami Pierre Uji Toksisitas metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Metode ekstraksi Kerangka konsep Definisi operasional... BAB III METODE PENELITIAN 1.1 Desain penelitian Waktu dan tempat penelitian Bahan yang diuji Alat dan bahan penelitian Alat penelitian Bahan penelitian Cara kerja penelitian Penyiapan sampel atau pembuatan Simplisia Pembuatan ekstrak daun Garcinia benthami Pierre Uji aktivitas toksisitas dengan metode BSLT Pengukuran toksisitas... i ii iii iv v vii viii x xi viii

9 1.5.5 Analisis data toksisitas... BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil ekstraksi daun Garcinia benthami Pierre Perhitungan nilai LC BAB V SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan Saran... DAFTAR PUSTAKA... LAMPIRAN ix

10 DAFTAR TABEL Tabel 4.1 Hasil mortalitas larva Artemia salina Leach dengan penambahan ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre Tabel 4.2 Hasil uji toksisitas ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre Tabel 4.3 Hasil Mortalitas larva Artemia salina Leach dengan pemberian 29 DMSO..... Tabel 6.1 Perhitungan % kematian larva Artemia salina Leach, nilai probit, dan LC 50 daun Garcinia benthami Pierre Tabel 6.3 Nilai probit x

11 DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Daun Garcinia benthami Pierre... 6 Gambar 6.1 Hasil determinasi... Gambar 6.2 Foto Depan Kaleng Telur Artemia salina Leach... Gambar 6.3 Foto Belakang Kaleng Telur Artemia salina Leach. Gambar 6.4 Grafik Regresi Linier ekstrak daun Garcinia benthami Pierre Gambar 6.5 Simplisia daun Garcinia benthami Pierre Gambar 6.6 Destilasi pelarut n-heksan... Gambar 6.7 Proses maserasi Gambar 6.8 Penyaringan filtrat daun Garcinia benthami Pierre Gambar 6.9 Pembuatan ekstrak kental Gambar 6.10 Ekstrak kental daun Garcinia benthami Pierre Gambar 6.11 Pemberian air laut Gambar 6.12 Wadah penetasan Artemia salina Leach Gambar 6.13 Telur Artemia salina Leach yang akan ditetaskan... Gambar 6.14 Ekstrak yang akan diencerkan. Gambar 6.15 Tabung Pengenceran xi

12 BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Obat-obatan yang bersumber dari bahan alam saat ini sudah dikenal dan digunakan pada sebagian besar masyarakat Indonesia atau yang biasa disebut sebagai obat tradisional. Obat tradisional mudah diterima oleh masyarakat karena harga lebih murah dan mudah di dapat. Banyak penelitian sebelumnya yang telah meneliti mengenai macam obat tradisional, kandungan kimia serta khasiat yang ada di dalamnya. Namun, adapula tanaman yang belum diketahui manfaatnya, sehingga perlu diteliti lebih lanjut. 1 Umumnya masih banyak tanaman yang dapat dijadikan bahan obat tradisional tetapi belum diketahui oleh masyarakat Indonesia karena jenisjenisnya dianggap tidak banyak memberikan manfaat. Ada beberapa jenis tanaman Garcinia yang ada di Indonesia, seperti G. Mangostana L, G. Lancilimba, dan G. benthami Pierre. Namun, masyarakat Indonesia hanya mengetahui satu jenis tanaman saja, yaitu manggis ( G. Mangostana L.). Sehingga mendorong para peneliti untuk mencari tahu kandungan kimia sampai manfaat atau khasiat yang dapat diperoleh dari tanaman Garcinia lainnya. Garcinia termasuk famili Clusiaceae yang telah diketahui mempunyai manfaat yang besar untuk kesehatan karena mengandung senyawa yang mempunyai bioaktivitas sebagai antioksidan. Garcinia benthami Pierre merupakan salah satu spesies dari genus Garcinia yang tumbuh di Indonesia. 2 Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa kandungan kimia yang terdapat dari spesies Garcinia diantaranya yaitu senyawa golongan xanton, kumarin, flavonoida dan terpenoid. Berdasarkan hasil penelitian, xanton dari genus Garcinia diketahui mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, antibakteri, antimalaria, antikanker dan antiinflamasi. Xanton dari G. Lancilimba berperan aktif terhadap sel kanker MDA-MB-435S pada payudara. 1

13 2 Selain itu, pada G. Mangostana L yaitu mangostenon C juga mempunyai aktivitas aktif terhadap sel kanker. Senyawa tersebut aktif terhadap tiga cell line kanker manusia, epidermoid carcinoma of the mouth (KB), breast cancer (BC-1) dan small sell lung cancer (NCI-H187). 2 Peneliti belum menemukan penelitian tentang uji toksisitas pada daun Garcinia benthami Pierre dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Penelitian ini menerapkan metode BSLT dengan menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan uji. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki hubungan dengan daya sitotoksitas senyawa antikanker pada suatu tanaman. Selain itu, metode ini sering digunakan sebagai skrining awal untuk mengetahui senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak tanaman. 3 Oleh karena itu, penting dilakukannya penelitian ini untuk mengetahui potensi toksisitas akut ekstrak n-heksana daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode BSLT. Hasil yang didapatkan diharapkan dapat dijadikan bahan informasi tentang potensi toksisitas akut pada ekstrak n-heksana daun Garcinia benthami Pierre sebagai salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai tanaman obat tradisional dan dapat digunakan secara luas oleh masyarakat Indonesia. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas rumusan masalah dalam penelitian ini adalah apakah ekstrak n-heksana daun Garcinia benthami Pierre mempunyai potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach. 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan Umum Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mengetahui toksisitas akut ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva larva Artemia salina Leach dengan metode BSLT.

14 Tujuan Khusus Tujuan khusus penelitian ini adalah untuk menentukan nilai LC 50 ekstrak n- heksan daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode BSLT. 1.4 Manfaat Penelitian Bagi Masyarakat Menambah informasi tentang tumbuhan keluarga manggis yang berpotensi sebagai tanaman obat Bagi Institusi 1. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi toksisitas akut ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre sehingga dapat digunakan sebagai alternatif dalam pengembangan obat-obat alami sebagai pengobatan serta pencegahan dari penyakit kanker. 2. Dapat dijadikan bahan rujukan penelitian di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Bagi Peneliti 1. Sebagai salah satu syarat mendapatkan gelar Sarjana Kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Dapat menambah pengalaman peneliti dalam melakukan uji potensi toksisitas terutama pada tanaman Garcinia benthami Pierre.

15 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Landasan Teori Obat Tradisional Obat tradisional adalah pilihan pengobatan yang akhir-akhir ini diminati dan sering menjadi pilihan masyarakat luas, terlebih lagi dengan kesadaran untuk memilih pengobatan dari bahan alami, bahkan dengan perkembangan zaman, kini pengobatan alternatif dalam melayani kesehatan pada masyarakat juga banyak diminati. Dari banyak penelitian, obat tradisional memang sudah diakui kekhasiatannya oleh masyarakat. Oleh karena itu, memanfaatkan tanaman dari bahan alami dan menggunakannya untuk kesehatan dapat meningkatkan berkembangannya obat-obatan tradisional. 3 Selain itu, memanfaatkan tanaman obat yang terbuat dari bahan alami juga dapat digunakan untuk mengatasi penyakit kanker, telah diketahui bahwa pengobatan kanker saat ini sangat mahal. Di Indonesia, penyakit kanker merupakan urutan kelima, karena itulah penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang menakutkan bagi masyarakat. Sudah banyak penelitian yang telah dilakukan untuk mencari senyawa antikanker yang terkandung pada berbagai tanaman tradisional sehingga akan dikembangkan menjadi obat tradisional yang efektif dalam menghambat dan menghentikan aktivitas sel kanker di dalam tubuh seseorang. Sehingga upaya pengembangan obat tradisional perlu dikembangkan dan disebarluaskan. 3 Salah satu tumbuhan yang perlu dikembangkan sebagai obat antikanker adalah daun Garcinia benthami Pierre. Tumbuhan ini merupakan tumbuhan yang belum banyak diketahui oleh masyarakat luas dan juga dapat digunakan menjadi salah satu obat tradisional Toksikologi Uji toksisitas merupakan salah satu bagian dari toksikologi. Uji toksisitas diawali dari skrining mencari senyawa aktif kemudian dapat 4

16 5 dilanjutkan kembali dengan uji efektivitas atau selektivitas pada hewan coba. 4 Toksikologi merupakan ilmu yang mempelajari secara kuantitatif dan kualitatif pengaruh yang buruk dari zat kimiawi, fisis, dan biologis terhadap suatu sistem biologis. 4 Selain itu, dapat diartikan sebagai ilmu yang mempelajari racun, tidak saja efeknya, tetapi juga mekanisme terjadinya efek tersebut pada organisme. Racun tersebut dapat berupa zat kimia, fisis, dan biologis. Toksin atau racun diartikan sebagai zat yang bila masuk ke dalam tubuh dalam dosis cukup, bereaksi secara kimiawi dapat menimbulkan kematian/kerusakan berat pada orang sehat. 5 Sedangkan toksisitas merupakan kemampuan racun (molekul) untuk menimbulkan kerusakan apabila masuk ke dalam tubuh dan lokasi organ yang rentan terhadapnya. 6 Suatu zat mempunyai kadar toksisitas yang berbeda sehingga menentukan tingkat toksisitas suatu toksin yang sedang diuji coba pada berbagai organisme. Tetapi toksisitas ini bergantung pada berbagai faktor, antara lain : 7 a) Spesies uji b) Cara racun memasuki tubuh/ portal entri c) Frekuensi dan lamanya paparan d) Konsentrasi zat pemapar e) Bentuk, sifat kimia/fisik zat pencemar f) Kerentanan berbagai spesies terhadap pencemar Semuanya faktor- faktor yang dapat menentukan efek yang terjadi. Ada 2 jenis sifat efek toksik, yakni bersifat reversible (dapat kembali seperti semula) dan bersifat irreversible (tidak dapat dirubah kembali). Berikut ciri efek toksik yang bersifat reversible, yaitu : 7 1. Bila jumlah zat toksik dalam tempat kerjanya atau reseptornya telah habis, maka reseptor akan kembali seperti keadaan semula. 2. Efek toksik yang diakibatkan akan cepat hilang atau kembali normal.

17 6 3. Ketoksikan sangat tergantung pada dosis, kecepatan absorbs, distribusi, dan eleminasi Sedangkan ciri-ciri dari sifat efek toksik yang bersifat irreversible, yaitu : 7 1. Kerusakan yang terjadi sifatnya permanen 2. Paparan berikutnya akan menimbulkan kerusakan yang sifatnya sama sehingga memungkinkan terjadinya akumulasi efek toksik. 3. Paparan dengan takaran yang sangat kecil dalam jangka panjang akan menimbulkan efek toksik yang sama efektifnya dengan yang ditimbulkan oleh paparan dosis besar jangka pendek. Ini menunjukkan zat yang dapat menimbulkan efek toksik irreversible adalah zat beracun yang terakumulasi atau sangat sukar dieleminasi Garcinia benthami Pierre Umumnya Garcinia merupakan tumbuhan yang masih belum diketahui oleh banyak masyarakat luas karena jenis-jenisnya tidak banyak memberikan manfaat kecuali manggis (Garcinia Mangostana L.). Gambar 2.1 Garcinia benthami Pierre Sumber : Dokumen pribadi

18 7 Klasifikasi taksonomi tumbuhan Garcinia benthami Pierre : 2 a. Regnum : Plantae b. Divisi : Spermatophyta c. Anak divisi : Angiospermae d. Kelas : Dicotyledoneae e. Sub kelas : Archichlamydeae f. Ordo : Guttiferales g. Familia : Clusiaceae h. Genus : Garcinia i. Species : Garcinia benthami Pierre Tumbuhan Garcinia, sudah banyak ditemukan sebagian besar hutan di Indonesia, selain itu juga dapat ditemukan di India dan Sri Lanka. Di Indonesia, tumbuhan Garcinia juga terdapat di Kalimantan Timur, Borneo, Sarawak, Sabah. 8 Garcinia merupakan tumbuhan yang tidak terlalu besar, dan sering ditemukan di bawah pohon-pohon yang besar. Garcinia benthami Pierre merupakan salah satu spesies dari garcinia. Tumbuhan ini memiliki tinggi sekitar 17 meter, diameter tajuk 12 m dan memiliki diameter batang sekitar 43,13 cm. 9 Memiliki batang yang lurus, mengecil ke arah ujung. Bentuk pohon seperti kerucut, memiliki percabangan berselang-seling. Selain itu, tanaman ini juga mempunyai nama lain yaitu Garcinia ferrea Pierre. 2 Jika dipotong, pada seluruh bagian tanaman akan mengeluarkan getah kuning yang kental dan lengket. Daunnya berwarna hijau. Bunga berada di ketiak daun. Daun kelopak dan daun mahkota terdiri dari 4-5 helai. Bunga jantan memiliki benang sari yang jumlahnya bervariasi, dengan tangkai sari bersatu menjadi satu. Pada bunga betina biasanya berukuran lebih besar dari bunga jantan, benang sari semu dengan tangkai sarinya yang bersatu menjadi sebuah cincin di bagian pangkal, bakal buah beruang 2-12 dan biasanya berbentuk papila. Bijinya besar, biasanya terbungkus oleh arilus yang berisi banyak sari buah. Embrionya berupa masa padat, hanya tersusun atas hipokotil, sedangkan bijinya tidak ada. 10

19 Uji Toksisitas Metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Zat yang telah diuji dengan uji toksisitas, akan melalui beberapa test keamanan pada hewan coba, meliputi : 7 1. Uji toksisitas akut, yaitu uji untuk mengetahui nilai LC 50 atau LD 50 yang masih dapat ditoleransi oleh binatang percobaan, yang hasilnya akan ditransformasi pada manusia. 2. Uji toksisitas subakut, adalah suatu uji untuk menentukan organ sasaran (organ yang rentan) atau tempat kerjanya. Umumnya dilakukan dengan menggunakan 3 dosis dan menggunakan 2 spesies yang berbeda. 3. Uji toksisitas kronik, adalah suatu uji yang tujuannya hampir sama dengan toksisitas sub akut. Uji ini diperlukan jika obat nantinya akan digunakan dalam jangka waktu yang panjang. 4. Uji efek pada organ reproduksi, suatu uji untuk melihat perilaku yang berkaitan dengan reproduksi (perilaku kawin), perkembangan janin, kelainan janin, proses kelahiran, dan perkembangan janin setelah dilahirkan. 5. Uji karsinogenik, adalah uji untuk mengetahui apakah suatu zat jika dipakai jangka panjang akan dapat menimbulkan kanker. Uji ini dilakukan jika obat tersebut nantinya akan digunakan dalam jangka panjang. 6. Uji mutagenik, adalah suatu uji untuk melihat adanya perubahan gen jika zat digunakan jangka panjang. Metode BSLT merupakan salah metode uji toksisitas akut. Metode BSLT yang digunakan menggunakan cara Meyer yang biasanya dilakukan untuk penapisan pada ekstrak dari tumbuhan ataupun buah yang diperkirakan memiliki sifat antitumor atau antikanker sebelum melakukan uji in vitro yang menggunakan sel lestari tumor. 11 Metoda ini diketahui digunakan sebagai bioassay guided fractionation bahan alam, juga dapat digunakan untuk metoda pra-skrining penelitian sel tumor di Cell Culture Labaratory of the Purdue Cancer Center, Purdue University. Metode Meyer ini ditujukan terhadap tingkat mortalitas larva udang Artemia salina L. yang disebabkan oleh ekstrak uji. 12

20 9 Hasil uji toksisitas dengan metode BSLT telah dibuktikan memiliki korelasi dengan daya sitotoksitas dari senyawa antikanker. 3 Hasil uji toksisitas dinyatakan dalam persen LC 50 (Lethal Consentration). 12 LC 50 didefinisikan sebagai dosis atau konsentrasi yang diberikan sekali (tunggal) atau beberapa kali dalam 24 jam dari suatu zat yang secara statistik diharapkan dapat mematikan 50% hewan coba. 7 Besarnya toksisitas tergatung dari jumlah kematian larva setelah pemberian zat yang mengandung senyawa antikanker. Ekstrak dikatakan bersifat toksik jika harga LC 50 < 1000 ppm, sedangkan untuk senyawa murni jika LC 50 <200 ppm berpotensi sebagai antikanker. 13 Ekstrak atau fraksi senyawa yang memiliki harga LC 50 > 0-30 ppm berpotensi sebagai antikanker, LC 50 > ppm berpotensi sebagai antibakteri, sedangkan LC 50 > ppm berpotensi sebagai pestisida. 13 Artemia salina Leach merupakan kelompok udang-udangan (Crustaceae) dari filum Arthropoda, kingdom Animalia. Artemia salina Leach biasanya hidup di lingkungan danau berair asin. Kadar garam perairan sangat berpengaruh pada proses penetasan udang, kadar garam < 6% menyebabkan telur udang tenggelam dan tidak bisa menetas. Jika kadar garam > 25%, telur akan berada pada kondisi tersuspensi, sehingga telur udang dapat menetas dengan normal. 14 Siklus hidup Artemia salina Leach dimulai dari saat penetasan telur atau embrio. Setelah jam, pada suhu 25 0 C kista akan menetas menjadi embrio. Dalam waktu jam, embrio tersebut berubah menjadi naupli (larva udang) yang dapat berenang bebas. Siklus hidup Artemia salina Leach dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya ph, cahaya, suhu, kadar garam, dan aerasi O2. ph terbaik untuk siklus hidup Artemia salina Leach adalah sebesar 8-9, sedangkan ph di bawah 5 atau di atas 10 dapat membunuh Artemia salina Leach. Cahaya sangat diperlukan untuk proses penetasan dan pertumbuhan Artemia salina Leach. Selain itu, kadar oksigen harus tetap dijaga dengan baik untuk mendukung pertumbuhan Artemia salina Leach. 15

21 10 Jika faktor-faktor tersebut dapat dilakukan dengan optimal, Artemia salina Leach akan tumbuh dan berkembang dengan cepat. Apabila kadar oksigen dalam air rendah, air mengandung polutan organik, atau salinitas perairan meningkat, Artemia salina Leach akan memakan bakteri, plankton, dan sel khamir. Pada kondisi tersebut, Artemia salina Leach akan memproduksi hemoglobin sehingga tampak berwarna jingga kemerahan. 14 Pada proses inkubasi selama 24 jam, larva udang Artemia salina Leach membutuhkan proses aerasi dengan menggunakan aerator. Aerasi merupakan proses terjadinya kontak antara air dan udara, sehingga terjadi perpindahan seyawa yang bersifat volatile. Proses aerasi dapat meningkatkan jumlah O 2 di dalam air, menghilangkan CO 2, H 2 S, dan menghilangkan rasa serta bau yang disebabkan oleh zat-zat organik. Aerasi juga dapat meningkatkan ph dan menurunkan suhu termal air laut. 16 Proses aerasi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara pertama adalah dengan memompakan udara atau oksigen ke dalam air, sehingga dihasilkan gelembung udara yang berkontak langsung dengan air. Cara yang kedua adalah dengan menekan air ke atas untuk berkontak langsung dengan udara, proses tersebut dilakukan dengan bantuan pemutaran baling-baling pada permukaan air. 17 Pemilihan larva udang sebagai hewan uji pada penelitian didasarkan karena Artemia salina Leach memiliki beberapa kesamaan dengan mamalia, misalnya pada tipe DNA-dependent RNA polimerase Artemia salina Leach serupa dengan yang terdapat pada mamalia dan organisme yang memiliki ouabainesensitive Na + dan K + dependent ATPase, sehingga senyawa maupun ekstrak yang terdapat aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi. 18 Selain itu, pemilihan Artemia salina Leach dikarenakan telur Artemia salina Leach memiliki daya tahan yang lama (dapat tetap hidup dalam kondisi kering, selama beberapa tahun), lebih mudah menetas dalam waktu 48 jam, sehingga dapat dihasilkan naupli (larva udang) dalam jumlah banyak untuk diuji. 15 Larva udang pun memiliki kemampuan untuk mengatasi perubahan tekanan osmotik dan regulasi ionik yang tinggi. 19 Alasan lain yang menyebabkan dipilihnya larva udang (naupli) sebagai hewan uji adalah karena larva udang memiliki

22 11 membran kulit yang tipis, sehingga kematian suatu larva akibat efek sitotoksik dari senyawa bioaktif dapat dianalogikan dengan kematian sebuah sel dalam organisme. 20 Disamping itu, larva udang juga memiliki toleransi yang tinggi terhadap selang salinitas yang luas, mulai dari air tawar hingga air yang bersifat jenuh garam. 21 Persen kematian Artemia salina Leach dapat dihitung setelah periode inkubasi selama 24 jam, setelah pemberian sejumlah larutan uji pada media hidupnya. Kematian tersebut disebabkan, karena larva udang mengalami keracunan (toxicity) akibat keberadaan senyawa bioaktif yang masuk ke dalam tubuhnya. Selain itu, sistem pertahanan tubuh (imunitas) yang dibentuk larva udang masih belum mampu untuk menghambat dan menoleransi senyawa bioaktif yang terdapat pada media hidupnya. Kematian larva udang dinyatakan berdasarkan hasil pengamatan menggunakan kaca pembesar dan ditunjukkan dengan tidak adanya motilitas (pergerakan) dari larva udang. Selanjutnya dihitung efek farmakologis, berdasarkan analisis probit (LC 50 ) Metode Ekstraksi Ekstraksi adalah penarikan dari kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Ada beberapa cara pembuatan ekstraksi : Cara Dingin a. Maserasi Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (suhu kamar). Cara ekstraksi ini menggunakan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Remaserasi adalah melakukan beberapa kali pengulangan dengan menambahkan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya. 2

23 12 b. Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) biasanya dilakukan pada suhu kamar. Terdapat beberapa proses yang terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan Cara Panas a. Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali. Sehingga termasuk proses ekstraksi sempurna. 2 b. Soxhlet Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. 2 c. Digesti Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur C. 2 d. Infus Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur ( C) selama waktu tertentu (15-20 menit). 2

24 13 e. Dekok Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai titik didih air selama 30 menit. 2

25 Kerangka Konsep Ekstrak daun Garcinia benthami Pierre Memiliki Senyawa Bioaktif UJI TOKSISITAS Uji Toksisitas Akut METODE BSLT Penetasan Artemia salina Leach selama 48 jam Pemberian larutan uji (ekstrak n- heksan daun Garcinia benthami Pierre) dan menghitung persen kematian Artemia salina Leach menggunakan kaca pembesar setelah periode inkubasi selama 24 jam Didapatkan hasil penelitian Persentase Persen kematian larva udang Nilai Probit, Persamaan linier y=a+bx NILAI LC 50

26 Definisi Operasional No Variabel Definisi Cara ukur Alat ukur Skala ukur 1. Konsentra Konsentrasi V 1 M 1 =V 2 M 2 si ekstrak larutan uji (perbandingan daun dalam ppm (1 μg ekstrak Garcinia μg/ml) dengan ml n- benthami heksan) Pierre 2. Toksisitas sampel Nilai toksisitas sampel yang diuji pada masing-masing konsentrasi 3. LC 50 Dosis atau konsentrasi yang diberikan dalam 24 jam dari suatu zat dan dapat mematikan 50% hewan coba Pengukuran dilakukan dengan menghitung jumlah Artemia salina Leach yang mati sebanyak 50 % dari total larva uji (10 ekor pada tabung reaksi). Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis Hasil ukur - Numerik 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm 1000 ppm Menggunaka n kaca pembesar dan ditunjukkan dengan tidak adanya motilitas (pergerakan) dari larva udang. Numerik Hasil toksisitas dalam persen LC 50 - Kategorik Ekstrak LC 50 < 1000 ppm = bersifat toksik Sedangkan senyawa murni LC 50 <200 ppm = antikanker

27 BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan pendekatan Post Test-Only Control Group Design dan cara pengambilan sampel yaitu Purposive Random Sampling terhadap larva Artemia salina Leach di Laboratorium untuk menguji potensi toksisitas. Perlakuan dengan pemberian ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Maret sampai bulan Agustus 2013 di Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka, Laboratorium Farmakologi, dan Laboratorium Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.3 Bahan yang Diuji Daun Garcinia benthami Pierre diambil dari Kebun Raya Bogor dan telah di determinasi di laboratorium LIPI-Bogor (lampiran 1). Tujuan dilakukannya determinasi dan identifikasi daun yaitu untuk mengetahui dan memastikan famili dan spesies tanaman yang akan diteliti. Proses ekstraksi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitofarmaka Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.4 Alat dan Bahan Penelitian Alat Penelitian Gelas ukur, neraca analitik, gelas beaker, tabung reaksi, pipet, batang pengaduk kaca, rotary evaporator, lup, vial atau botol kaca, lakban, kertas saring, lemari asam, wadah bening, mikropipet, dan lampu, sterofoam, aluminium foil, cawan penguap. 16

28 Bahan Penelitian Ekstrak daun Garcinia benthami Pierre, aquadest, pelarut yang digunakan yaitu n-heksan mempunyai sifat non polar sehingga akan melarutkan senyawa-senyawa nonpolar yang terdapat dalam ekstrak kasar n-heksan daun Garcinia benthami Pierre. Pemilihan n-heksan sebagai pelarut karena n-heksan memiliki titik didih rendah, mudah menguap, bersifat tidak berbahaya, dan tidak beracun. Hewan uji yang digunakan yaitu larva Artemia salina Leach, sebagai pelarut tambahan digunakan larutan DMSO (Dimethyl Sulfoxide) untuk membantu kelarutan ekstrak n-heksan dalam aquades, dan air laut. 3.5 Cara Kerja Penelitian Penyiapan Sampel atau Pembuatan Simplisia Daun Garcinia benthami Pierre yang dipilih dalam penelitian ini yaitu daun segar dan tidak cacat dari strukturnya sebanyak 6 kg, kemudian dikeringkan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITRO) dengan cara oven sampai kering. Setelah kering, simplisia dibersihkan dari kotoran-kotoran yang mungkin menempel pada permukaan maupun belakang daun. Selanjutnya simplisia dihaluskan dengan menggunakan blender sampai terlihat halus. Setelah itu, simplisia ditimbang sebanyak 1 kg untuk proses ekstraksi dan proses selanjutnya Pembuatan Ekstrak Daun Garcinia benthami Pierre Sebanyak 1 kg dari daun Garcinia benthami Pierre dimasukkan ke dalam botol untuk dilakukan maserasi dengan pelarut n-heksan sebanyak 6 L yang sebelumnya telah di destilasi dengan rotary evaporator. Maserasi dilakukan sebanyak 3 hari. Hasil maserasi disaring dengan menggunakan kertas saring dan dari hasil penyaringan diperoleh filtrat. Kemudian filtrat tersebut dipekatkan menjadi ekstrak kental dengan memasukkan ke dalam labu

29 18 evaporator. Pelarut diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu C sampai pelarut tidak keluar lagi pada labu alas bulat tempat sisa penampungan pelarut, sehingga didapatkan ekstrak kental n-heksan. Hasil penyaringan juga didapatkan ampas simplisia dan kemudian kembali maserasi dengan pelarut n-heksan hingga didapatkan filtat n-heksan mendekati hijau bening agar klorofil yang terdapat pada daun dapat hilang semua. Telah dilakukan tujuh kali proses maserasi dan dilakukan dalam waktu + 1 bulan. Setiap dilakukannya proses maserasi tersebut, masingmasing ekstrak kental yang disatukan dan dipindahkan ke dalam cawan penguap. Setelah diproses maserasi telah selesai, maka hasil ekstrak kental yang telah didapatkan dikeringkan dalam oven sampai didapatkan ekstrak n- heksan yang kering (konsentrasi 100 %) ditimbang Uji Aktivitas Toksisitas Dengan metode BSLT Pengujian dilakukan pada ekstrak kental daun Garcinia benthami Pierre dengan metode BSLT. Metode BSLT merupakan metode skrining awal terhadap senyawa aktif yang terdapat pada tanaman yang akan diuji. Selain itu, proses pengerjaannya pun mudah, relatif tidak mahal, dan tidak membutuhkan waktu yang lama. Metode BSLT pun mempunyai tingkat kepercayaan sekitar 95% untuk uji toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak kasar tanaman. 22 Sebelum melakukan pengujian, dilakukan penetasan larva Artemia salina Leach terlebih dahulu dengan menetaskan telurnya 48 jam. Air laut yang digunakan untuk penelitian, ph nya diukur terlebih dahulu. Dari hasil pengukuran didapatkan ph air laut adalah ph 8-9. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur tersebut dalam air laut secukupnya pada wadah. Wadah tersebut dibagi menjadi dua bagian dengan menggunakan sterofoam dan diberi lubang di bagian bawahnya. Wadah yang telah dibagi menjadi dua bagian tersebut, sebagian diberi lakban pada samping wadah dan ditutupi aluminium foil diatasnya serta tidak dikenai sinar lampu dan yang sebagian lagi tidak dilakban dan tidak diberikan aluminium foil di atasnya dan diberi

30 19 sinar lampu. Perlakuan tersebut digunakan untuk meletakkan telur pada tempat yang tidak di terang/gelap sehingga telur dapat menetas dan berpindah ke lubang pada daerah yang tidak diberi sinar lampu. Setelah didapatkan larva Artemia salina Leach, dilakukan penimbangan pada ekstrak n-heksan sebanyak 2000 mg. Kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades, akan tetapi karena n-heksan merupakan pelarut non polar sehingga pada ekstraknya diberikan tambahan 2 ml larutan DMSO dalam labu 100 ml ditambahkan aquades sampai batas kalibrasi. Kemudian dilakukan pengenceran dengan membuat konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, ppm, dan ppm dari masing-masing dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali (triplikat). Kemudian dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 9 ml air laut dan dicampurkan 1 ml larutan pengenceran dari masing-masing konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, ppm, dan ppm. Sehingga didapatkan konsentrasi ekstrak pada tabung reaksi terisi larva Artemia salina Leach yaitu 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, dan 1500 ppm, karena adanya penambahan dengan 9 ml air laut dan 1 ml ekstrak. Untuk memastikan efek DMSO terhadap larva Artemia salina Leach dilakukan uji BSLT hanya dengan menggunakan DMSO dengan cara memasukkan 2 ml DMSO di dalam labu 100 ml tanpa penambahan ekstrak ditambahkan aquades sampai batas kalibrasi labu tersebut. Kemudian dilakukan pengenceran dengan membuat konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm 1500 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, ppm, ppm, dan ppm. 10 ekor larva Artemia salina Leach dimasukkkan ke dalam tabung reaksi kemudian diambil 9 ml air laut dan ditambahkan 1 ml dari pengenceran DMSO tersebut, sehingga konsentrasi DMSO pada masing-masing tabung reaksi yaitu yaitu 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 2000 ppm. Selain itu, pembuatan kontrol negatif pada air laut juga telah dilakukan. Dimasukkan 10 ekor larva

31 20 Artemia salina Leach ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air laut tanpa penambahan ekstrak Pengukuran Toksisitas Uji toksisitas yang dilakukan dengan metode BSLT menggunakan larva Artemia salina Leach terhadap ekstrak n-heksan. Sehingga diperoleh suatu data yang kemudian diolah dengan menggunakan metode analisis probit untuk menentukan nilai LC50. Pengukuran dilakukan dengan menghitung jumlah Artemia salina Leach yang mati sebanyak 50 % dari total larva uji (10 ekor pada tabung reaksi). Kemudian nilai LC50 dihitung dengan memasukkan angka probit (50% kematian larva uji). Efek toksisitas dihitung dari persen kematian larva Artemia salina Leach.23 % kematian = x 100 % Kemudian membuat persamaan regresi linier:24 y = a+bx y = nilai probit, x = log konsentrasi. a =Intercept (garis potong) b = Slope (kemiringan dari garis regresi linear) LC50 adalah nilai y yang dimasukkan ke dalam nilai x = 50%. Apabila pada kontrol ada larva yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot: 23 % kematian = Keterangan : x 100 %

32 21 T = jumlah larva uji yang mati, K = jumlah larva kontrol yang mati 10 = jumlah larva uji Analisis Data Toksisitas Ada banyak cara untuk menentukan nilai LC50. Salah satu cara yaitu dengan metode probit. Cara ini dilakukan dengan menghitung frekuensi (% respon) efek yang ditimbulkan kemudian dihubungkan dengan dosis dalam skala logaritma, maka akan diperoleh kurva dengan bentuk sigmoid ( ʃ ). Bagian tengah kurva yaitu, antara % respon cukup proporsional (lurus) untuk memperkirakan efek hubungan dosis versus respon, baik efek farmakologi (ED50) atau toksikologi (LC50). Sedangkan bagian yang tidak lurus, menunjukkan respon kematian kurang dari 16% atau lebih dari 84% dapat diluruskan dengan memprobitkan.7 Untuk menghitung LC50 berdasarkan metode probit, berikut merupakan langkah pembuatan perhitungan LC50, yaitu : 7 1. Mempunyai tabel probit 2. Menentukan nilai probit dari % kematian tiap kelompok hewan uji 3. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok 4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis, y= ax+b 5. Masukkan nilai 5 (probit dari 50% kematian hewan coba) pada persamaan garis lurus, pada nilai y. Nilai LC50 dihitung dari nilai anti logx pada saat Y= 5. Dari langkah-langkah yang telah disebutkan diatas, maka pada penelitian akan dibuat: 1. Data persentase kematian larva Artemia salina Leach dilihat pada tabel probit sehingga diperoleh nilai probit,

33 22 2. Kemudian membuat grafik antara log konsentrasi (x) dan nilai probit (y) sehingga diperoleh persamaan regresi linier y = a+bx. 3. Masukkan nilai y = 5 (probit dari 50%) pada persamaan y=a+bx, maka nilai LC 50 ditentukan dengan nilai x 4. Selanjutnya nilai X dikonversikan ke bentuk antilog. Ekstrak dikatakan bersifat toksik jika harga LC 50 < 1000 ppm, sedangkan untuk senyawa murni jika LC 50 <200 ppm berpotensi sebagai antikanker. 13

34 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre Ekstraksi dibuat dari daun Garcinia benthami Pierre yang diambil sebanyak 6 kg daun segar dari Kebun Raya Bogor. Pengeringan daun dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITRO) agar proses pengeringan berlangsung lebih cepat. Dari proses pengeringan didapatkan berat daun menjadi 3,5 kg. Daun juga telah diidentifikasi serta determinasi di Pusat Penelitian Biologi LIPI Bogor. Proses pembuatan ekstraksi daun Garcinia benthami Pierre dilakukan dengan cara maserasi bertingkat, berdasarkan tingkat kepolaran dari masing-masing pelarut. Pelarut yang digunakan secara berurutan, yaitu n-heksan, etil asetat, dan methanol. Pada penelitian ini, pelarut yang digunakan adalah n-heksan. Dari hasil proses maserasi didapatkan filtrat akhir pelarut n-heksan sebanyak 1100 ml. Hasil ekstrak kental dari daun Garcinia benthami Pierre yang didapat sebanyak 5 g. Hasil ekstrak kental yang telah didapat, ditimbang sebanyak 2 g kemudian dilakukan pengenceran pada konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, dan 1500 ppm. Untuk melarutkan ekstrak n-heksan perlu ditambahkan DMSO sebanyak 2 ml. Penambahan DMSO pada ekstrak n-heksan sebelum ditambahkan aquades bertujuan untuk membantu kelarutan senyawa uji dalam aquades sehingga senyawa dapat terlarut secara merata. 4.2 Perhitungan Nilai LC 50 Hasil potensi aktivitas antikanker dapat diketahui dari jumlah kematian larva Artemia salina Leach karena disebabkan adanya pengaruh dari pemberian ekstrak daun Garcinia benthami Pierre pada konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm dan 1500 ppm pada tabung 23

35 24 reaksi. Hal ini disebabkan karena adanya pengenceran akibat penambahan air laut 9 ml pada tabung reaksi. Tabel 4.1. Mortalitas Larva Artemia salina Leach dengan Ekstrak n-heksan Daun Garcinia benthami Pierre Ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre Mortalitas larva Artemia salina Leach Konsentrasi Pengulangan I Pengulangan II Pengulangan III % mati 5 ppm ,33 10 ppm ,67 20 ppm ppm , ppm ppm , ppm , ppm ppm , ppm ,67 Kontrol negatif (air laut) ,00 Hasil Artemia salina Leach yang mengalami kematian dengan penambahan ekstrak n-heksan yang telah dilakukan 3 kali pengulangan (triplikat) sehingga didapatkan persen kematian dari masing-masing konsentrasi sebagai berikut: 1. Pada konsentrasi 5 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 3, 33%. 2. Pada konsetrasi 10 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 6,67%. 3. Pada kosentrasi 20 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 10%.

36 25 4. Pada konsentrasi 50 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 16,67%. 5. Pada konsentrasi 100 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 20%. 6. Pada konsentrasi 150 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 23,33% 7. Pada konsentrasi 250 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 26,67% 8. Pada konsentrasi 500 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 30% 9. Pada konsnetrasi 1000 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 33,33% 10. Pada konsnetrasi 1500 ppm menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 36,67% 11. Pada kontrol negatif menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach sebesar 0,00% Dari tabel 4.1 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak n- heksan daun Garcinia benthami Pierre yang diberikan pada larva Artemia salina Leach maka semakin tinggi pula persen larva kematian Artemia salina Leach. Akan tetapi kematian 50% larva didapatkan pada konsentrasi >1000 ppm sehingga ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre disimpulkan tidak mempunyai potensi toksik dengan uji BSLT. Berikut hasil analisis uji toksisitas ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre dengan metode (BSLT) pada tabel di bawah ini.

37 26 Tabel 4.2 Data Hasil Uji Toksisitas Ekstrak n-heksan Daun Garcinia benthami Pierre dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Hasil Uji Hasil Perhitungan Konsentrasi (ppm) Log konsentrasi (X) % mati Probit (Y) X2 Y2 XY 0 0,00 0,00 0, ,69 3,33 3,1616 0,48 9,99 2, ,67 3, ,26 3, , ,7184 1,69 13,83 4, ,69 16,67 3,8877 2,86 15,11 6, , ,38 8, ,18 23,33 4,2710 4,75 18,24 9, ,39 26,67 4,3781 5,71 19,17 10, , ,4756 7,24 20,03 12, ,33 4, ,87 13, ,18 36,67 4, ,11 21,72 14,82 20,12 40,79 46,84 168,6 85,75 Nilai slope (m) = Intersep (b) = Sehingga nilai slope (m) = ( ) ( ) ( ( ( )) ( ( ) ( ) ( )( ( = = = 0,57 ) ) ) ) ( ( ( )) ( ) ) ( ( ) )

38 27 Intersep (b) = ( )( ) ( ( ) )( ( ) ) = = = 2,91 Sehingga persamaan garis lurus hubungan antara Y (nilai probit dari % kematian) dengan X (log dosis) adalah Y = 0,57X +2,91 Y=0,57X+2,91 5=0,57X+2,91 2,09=0,57X X=3,6 Antilog 3,6= 3981, jadi LC50 untuk zat uji diatas adalah 3981 ppm. Untuk memastikan kebenaran perhitungan, maka dilakukan perhitungan regresi linier dengan Microsoft Excel. Nilai Probit Regresi Linier Ekstrak Daun Garcinia benthami Pierre 5 y = 0,5814x + 2,9075 R² = 0, Series1 1 Linear (Series1) Log Konsentrasi Grafik 4.1 Grafik Regresi Linier ekstrak daun Garcinia benthami Pierre Sehingga didapatkan persamaan linier Y= 0,581x + 2,907

39 28 Berdasarkan persamaan linier tersebut didapatkan nilai LC 50 : Y= 0,581x + 2,907 5= 0,581x + 2,907 2,093 = 0,581x X= 3,6 Antilog 3,6 = 3981 Dari tabel 4.2 menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan mempunyai nilai LC 50 sebesar 3981 ppm dapat dikatakan memiliki nilai LC 50 >1000 ppm. Ekstrak dikatakan bersifat toksik jika harga LC 50 < 1000 ppm, sedangkan untuk senyawa murni jika LC 50 <200 ppm berpotensi sebagai antikanker. 13 Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan memiliki nilai LC 50 > 1000 ppm bersifat non toksik terhadap larva Artemia salina Leach sehingga diperkirakan tidak memiliki potensi antikanker. Perhitungan nilai LC 50 juga dilakukan dengan menggunakan metode analisis probit dengan software SPSS 16. Melalui perangkat tersebut dapat ditentukan hubungan linearitas antara konsentrasi formula terhadap probit kematian dari larva udang. Berdasarkan pengujian menggunakan software SPSS 16 tersebut, diperoleh nilai LC 50 sebesar 4587,051 (lampiran 7). Distribusi data juga sudah diuji menggunakan uji normalitas. Sampel yang digunakan <50, maka menggunakan uji normalitas dengan Kolmogorov-Smirnov. Nilai p-value yang diperoleh > 0,05 artinya distribusi data normal (lampiran 7). Untuk menguji apakah kematian larva Artemia salina Leach disebabkan karena pengaruh DMSO maka dilakukan pengujian BSLT dengan DMSO tanpa ekstrak. Hasil pengujian dengan DMSO dapat dilihat pada tabel 4.3. Hasil pengujian menunjukkan bahwa pada kadar DMSO yang tertinggi sebesar 2000 ppm, persentase kematian larva Artemia salina Leach hanya 13.33%. Hal ini menunjukkan bahwa DMSO sebagai pelarut ekstrak tidak berefek signifikan pada kematian larva pada konsentrasi ekstrak 2000 ppm yang mengakibatkan kematian larva sebesar 90%. Bila dihitung 2000 ppm DMSO setara dengan 0.2 % kadar

40 29 DMSO dalam larutan. Hal ini masih sesuai dengan penelitian sebelumnya pada sel mast yang menyebutkan kadar DMSO 0.4% tidak menyebabkan eksositosis histamine dari sel mast. 25 Selain itu, pada penelitian lain juga menyebutkan penambahan DMSO tidak boleh lebih dari 50 μl, karena jika lebih akan dapat menyebabkan kematian pada larva udang. 26 Pada penelitian ini konsentrasi akhir terbesar pada ekstrak kadar DMSO nya 20 μl. Sedangkan kontrol negatif (mortalitas 0%) 10 ml air laut tanpa pemberian ekstrak yang telah diberikan tidak memberikan kematian pada larva Artemia salina Leach sehingga larva yang mati merupakan pengaruh senyawa toksik dari ekstrak daun Garcinia benthami Pierre yang diuji bukan karena pengaruh faktor lainnya. Tabel 4.3 Mortalitas Larva Artemia salina Leach dengan Pemberian DMSO Sebagai Kontrol DMSO Mortalitas larva Artemia salina Leach Konsentrasi Pengulangan I Pengulangan II Pengulangan III % mati Kontrol negatif (air laut) ,00 5 ppm ,00 10 ppm ,00 20 ppm ,00 50 ppm , ppm , ppm , ppm , ppm , ppm , ppm ppm ,33

41 BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan Kesimpulan penelitian ini adalah pada penghitungan nilai LC 50 didapatkan ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre mempunyai nilai sebesar 3981 ppm menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre tidak mempunyai potensi toksisitas terhadap larva Artemia salina Leach sehingga tidak dapat dijadikan sebagai obat antikanker. 5.2 Saran Berdasarkan kesimpulan, penelitian selanjutnya disarankan untuk dilakukan penelitian tentang potensi/manfaat ekstrak n-heksan daun Garcinia benthami Pierre selain dari potenssi toksik atau antikanker. Firman Allah SWT dalam surah Al-An am (6) ayat 141 menyebutkan: Artinya: Dan Dia-lah yang menjadikan kebun-kebun yang berjunjung dan yang tidak, berjunjung, pohon kurma, tanam-tanaman yang bermacam-macam buahnya, zaitun dan delima yang serupa (bentuk dan warnanya), tetapi tidak sama (rasannya) Makanlah dari buahnya (yang bermacam-macam itu) bila dia berbuah, dan tunaikanlah haknya di hari memetik hasilnya (dengan dikeluarkan zakatnnya); dan janganlah kamu berlebih-lebihan. Sesungguhnya Allah tidak menyukai orang-orang yang berlebihan." (Q.S Al An am: 141). 30

42 DAFTAR PUSTAKA 1. Ramadhani, A. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Sukun (Artocarpus altilis) Terhadap Larva Artemia Salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Tesis. Semarang, Amelia, P. Isolasi, Elusidasi, Struktur dan uji aktivitas antioksidan senyawa kimia dari daun Garcinia Benthami. Tesis. Jakarta: Farmasi UI, Mutia, D.Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Anggur (Vitis vinifera) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Tesis. Yogyakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Soemitrat, Juli. Toksikologi Lingkungan. Bandung: Gadjah Mada University Press, Goodman, L.S. and Gilman, A. The Pharmacological Basis of Therapeutics.2 nd ed. N.Y.: The MacMilan Co., Sax, N.I. et al. Dangerous Properties of Industrial Materials. N.Y.: Reinhold Pub.Co., Priyanto. Toksikologi Mekanisme, Terapi Antidotum, dan Penilaian Resiko. Depok : Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia (LESKONFI), Garcinia benthami Pierre, Fl. Forest. Conchinch Sari, R. Garcinia (Clusiaceae) Di Kebun Raya Bogor : Fisiognomi, Keragaman dan Potensi, Rachman, I. Sumber Koleksi Herbarium Bogoriense. Bogor: Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Widjhati R, A., Supriyono dan Subintoro. Pengembangan Senyawa Bioaktif dari Biota Laut. Forum Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. Pusat Riset Pengolahan Produk dan Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan, Depertemen Kelautan dan Perikanan,

43 Alam G. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Sebagai Bioassay Dalam Isolasi Senyawa Bioaktif dari Bahan Alam. Majalah Farmasi dan Farmakologi., Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. Brine Shrimps: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituent. Planta Medica, Purwakusumah W. Artemia Salina (Brine Shrimp). [terhubung berkala]. O-fish.com/artemia/php, Kurniawan, A. Aktivitas Antioksidan dan Potensi Hayati dari Kombinasi Ekstrak Empat Jenis Tanaman Obat Indonesia. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, Setiarto HB. Deteksi dan uji toksisitas LC 50 Senyawa Aflatoksin B1, B2, G1, G2 Pada Kacang Tanah (Arachis hypogeal L) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor, Moss B. Ecology of Fresh Waters. Norwich: Anglia, Panjaitan, RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae Cortex) dengan metode brine Shrimp Lethality test (BSLT). Universitas Sata Dharma Fakultas Farmasi. Yogyakarta: Croghan PC. The osmotic and ionic regulation of Artemia salina. Zoology Journal, Fenton J. Toxicology : A Case Oriental Approach. Boca Raton; ORC Pr, Diah SH. Pembenihan udang galah Macrobrahium rosenbergi de Man [laporan kerja praktik]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung, Lisdawati, V., Wiryowidagyo, S., Kardono S. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah dan Kulit Biji Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa). 23. Septyanti, C. Potensi Pelepah Temulawak (Curcuma xanthorriza) Sebagai Antikanker dan Antioksidan. Bogor: Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, 2012.

44 Rahmah, M. Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Heksana, Diklorometana dan Metanol Daun Keji Beling (Sericocalyx crispus. L) Terhadap Artemia salina Leach. 25. Agung EN, et all. Anti-allergic Effects Of 1,5-(4 -HYDROXY-3 - METHOXYPHENYL)-1,4-PENTADIENE-3-ONE On Mast Cell-Mediated Allergy Model. Malaysian Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 7, No. 1, 51 71, Noveri R, et all. Skrining Aktivitas Sitotoksik Ekstrak dan Fraksi Beberapa Jenis Spon Laut Asal Pulau Mandeh Sumatera Barat.

45 LAMPIRAN Lampiran 1 Gambar 6.1 Hasil determinasi 34

46 35 Lampiran 2 Gambar 6.2 Foto Depan Kaleng Telur Artemia salina Leach Gambar 6.3 Foto Belakang Kaleng Telur Artemia salina Leach

47 36 Lampiran 3 Tabel 6.1 Perhitungan % kematian larva Artemia salina Leach, nilai probit, dan LC 50 daun Garcinia benthami Pierre Hasil Uji Hasil Perhitungan Konsentrasi (ppm) Log konsentrasi (X) % mati Probit (Y) X 2 Y 2 XY 0 0,00 0,00 0, ,69 3,33 3,1616 0,48 9,99 2, ,67 3, ,26 3, , ,7184 1,69 13,83 4, ,69 16,67 3,8877 2,86 15,11 6, , ,38 8, ,18 23,33 4,2710 4,75 18,24 9, ,39 26,67 4,3781 5,71 19,17 10, , ,4756 7,24 20,03 12, ,33 4, ,87 13, ,18 36,67 4, ,11 21,72 14,82 20,12 40,79 46,84 168,6 85,75 Regresi Linier y = a+bx jadi, y = a+ bx Y=0,57X+2,91 5=0,57X+2,91 2,09=0,57X X=3,6 Antilog 3,6= 3981 LC 50 = 3981 ppm

48 37 Lampiran 3 Nilai Probit 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y = 0,5814x + 2,9075 R² = 0,9694 Regresi Linier Log Konsentrasi Series1 Linear (Series1) Gambar 6.4 Grafik Regresi Linier ekstrak daun Garcinia benthami Pierre

49 38 Pembuatan larutan ekstrak induk ppm : = = µg/ml = ppm Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi ppm M1 V1 = M2 V V1 = (15000) (25) V1 = 18,75 ml V1 = µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi ppm M1 V1 = M2 V V1 = (10000) (25) V1 = 12,5 ml V1 = µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 5000 ppm M1 V1 = M2 V V1 = (5000) (25) V1 = 6,25 ml V1 = 6250 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 2500 ppm M1 V1 = M2 V V1 = (2500) (25) V1 = 3,125 ml V1 = 3125 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 1500 ppm M1 V1 = M2 V V1 = (1500) (25)

50 39 V1 = 1,875ml V 1 = 1875 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 1000 ppm M 1 V 1 = M 2 V V 1 = (1000) (25) V1 = 1,25 ml V 1 = 1250 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 500 ppm M 1 V 1 = M 2 V V 1 = (500) (25) V1 = 0,625 ml V 1 = 62,5 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 200 ppm M 1 V 1 = M 2 V V 1 = (200) (25) V1 = 0,25 ml V 1 = 25 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 100 ppm M 1 V 1 = M 2 V V 1 = (100) (25) V1 = 0,125 ml V 1 = 12,5 µl Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 50 ppm M 1 V 1 = M 2 V V 1 = (50) (25) V1 = 0, 0625 ml V 1 = 6,25 µl

51 40 Pembuatan larutan DMSO induk ppm : = 0,02 Sehingga persen DMSO yang digunakan pada larutan induk ppm yaitu 0,02 x 100% = 2%, kadar DMSO dilakukan pengenceran sesuai dengan pembuatan konsentrasi ekstrak. Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi ppm M1 V1 = M2 V2 (18,75) (2%) = M2 (25) M2 = 1,5% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan yaitu 1,5% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi ppm M1 V1 = M2 V2 (12,5) (2%) = M2 (25) M2 = 1% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan yaitu 1% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 5000 ppm M1 V1 = M2 V2 (6,25) (2%) = M2 (25) M2 = 0,5% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 5000 yaitu 0,5% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 2500 ppm M1 V1 = M2 V2 (3,125) (2%) = M2 (25) M2 = 0,25% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 2500 yaitu 0,25%

52 41 Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 1500 ppm M 1 V 1 = M 2 V 2 (1,875) (2%) = M 2 (25) M 2 = 0,15% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 1500 yaitu 0,15% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 1000 ppm M 1 V 1 = M 2 V 2 (1,25) (2%) = M 2 (25) M 2 = 0,1% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 1000 yaitu 0,1% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 500 ppm M 1 V 1 = M 2 V 2 (0,625) (2%) = M 2 (25) M 2 = 0,05% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 500 yaitu 0,05% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 200 ppm M 1 V 1 = M 2 V 2 (0,25) (2%) = M 2 (25) M 2 = 0,02% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 200 yaitu 0,02% Pembuatan pengenceran dengan konsentrasi 100 ppm M 1 V 1 = M 2 V 2 (0,125) (2%) = M 2 (25) M 2 = 0,01% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 100 yaitu 0,01%

53 42 Pembuatan Pengenceran dengan konsentrasi 50 ppm M 1 V 1 = M 2 V 2 (0,0625) (2%) = M 2 (25) M 2 = 0,005% Sehingga persen DMSO yang terdapat pada larutan 50 yaitu 0,005

54 43 Tabel 6.2 Nilai Probit Lampiran 4

55 44

56 45

57 46

58 47 Gambar Alat dan Bahan Penelitian Lampiran 5 Gambar 6.5 Simplisia daun Garcinia benthami Pierre Gambar 6.6 Proses destilasi pelarut n-heksan Gambar 6.7 Proses maserasi Gambar 6.8 Penyaringan filtat n-heksan daun Garcinia benthami Pierre Gambar 6.9 Pembuatan ekstrak kental Gambar 6.10 Ekstrak kental daun Garcinia benthami Pierre

59 48 Gambar 6.11 Pemberian air laut Gambar 6.12 Wadah penetasan Artemia salina Leach Gambar 6.13 Telur Artemia salina Leach yang akan ditetaskan Gambar 6.14 Ekstrak yang akan diencerkan Gambar 6.15 Tabung pengenceran

60 49 Lampiran 6 DAFTAR RIWAYAT HIDUP Nama : Nur Rizqillah Tempat, tanggal lahir : Jakarta, 7 Juli 1992 Alamat : Jln. Tebet Timur Dalam XI/76 Rt: 008 RW: 006 Jakarta Selatan No. HP : nur_rizqi@yahoo.co.id Riwayat Pendidikan : 1. SDN Tebet Timur 20 Pagi ( ) 2. SMPN 73 Jakarta ( ) 3. SMAN 37 Jakarta ( ) 4. PSPD FKIK UIN Jakarta ( Sekarang)

61 50 Lampiran 7

62 51

63 52