LAPORAN TAHUNAN PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL

Transkripsi

1 LAPORAN TAHUNAN PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL Pemanfaatan Ekstrak Tanaman Rempah Asal Kalimantan Timur sebagai Produk Pengendalian Penyakit Bakterial pada Budidaya Ikan Air Tawar Dr. ESTI HANDAYANI HARDI NIDN Dr. WIWIN SUWINARTI NIDN AGUSTINA, S.Pi, M.Si NIDN UNIVERSITAS MULAWARMAN NOVEMBER 2015

2 ii HALAMAN PENGESAHAN PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL Judul Kegiatan : Pemanfaatan ekstrak Tenaman Rempah Asal Kalimantan Timur sebagai Produk Pengendalian Penyakit Bakterial pada Budidaya Ikan Air Tawar Tema Isu Strategis Nasional : Kesehatan, Penyakit tropis, gizi dan obat-obatan (Health, tropical diseases nutrition dan medicine) Ketua Peneliti : A. Nama Lengkap : Dr. Esti Handayani Hardi S.Pi., M.Si B. NIDN : C. Jabatan Fungsional : Lektor Kepala D. Program Studi : Budidaya perairan E. Nomor HP : F. Surel ( ) : estie_hardie@yahoo.com Anggota Peneliti (1) : A. Nama Lengkap : Agustina, S.Pi., M.Si B. NIDN : C. Perguruan Tinggi : UNIVERSITAS MULAWARMAN Anggota Peneliti (2) : A. Nama Lengkap : Dr. Wiwin Suwinarti, S.Hut., M.P B. NIDN : C. Perguruan Tinggi : UNIVERSITAS MULAWARMAN Institusi Mitra : A. Nama Institusi Mitra : Dinas Kelautan dan Perikanan Kutai Kartanegara B. Alamat : Tenggarong, Kabupaten Kutai Kartanegara C. Penanggung Jawab : Ardiansyah, S.Pi Lama Penelitian Keseluruhan : 2 Tahun Penelitian Tahun ke : 1 (satu) Biaya Penelitian Keseluruhan : Rp Biaya Tahun Berjalan : yang diusulkan ke DIKTI Rp ,- Mengetahui Dekan Samarinda, November 2015 Ketua Peneliti, (Ir. Sulistyawati, M.Si) NIP (Dr. Esti Handayani Hardi, S.Pi, M.Si) NIP Menyetujui Ketua lembaga Penelitian (Prof. Dr. Ir. Mustopa Agung Sardjono) NIP

3 iii RINGKASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji potensi kandungan bahan antibakterial dan imunostimulan pada tumbuhan rempah yang tumbuh di Kalimantan Timur, yang nantinya dapat dimanfaatkan sebagai bahan untuk penanggulangan (pencegahan dan pengobatan) penyakit bakterial yang disebabkan oleh bakteri Aeromonas hydrophila dan Pseudomonas sp pada budidaya ikan nila di Kalimantan Timur. Penanggulangan penyakit bakterial dapat dilakukan melalui upaya pencegahan dan pengobatan. Pencegahan dilakukan dengan memberikan imunostimulan dengan target meningkatkan ketahanan tubuh ikan, juga dilakukan dengan memberikan antibakterial pada inang baik melalui injeksi, pakan maupun perendaman dengan tujuan menekan pertumbuhan bakteri dalam tubuh inang. Sebanyak 32 jenis tanaman rempah asal Kalimantan Timur telah diskreening kandungan bahan antibakterialnya terhadap kedua bakteri tersebut, dan hasilnya ada 5 jenis tanaman rempah yang memiliki kemampuan antibakterial diatas 10 mm yaitu terung asam, lempuyang, temu kunci, jeruk pecel, dan asam jawa. Pada penelitian ini dilakukan beberapa tahapan yaitu : Tahap 1, mencari ekstrak yang memiliki kemampuan antibakterial terbaik terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. secara in vitro, uji dilakukan dengan metode zona hambat. Tahap 2, mencari konsentrasi dan dosis efektif dari ekstrak tanaman rempah yang bersifat antibakterial untuk menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. pada ikan nila secara invitro dengan metode zona hambat dan kultur bersama. Tahap 3, melakukan isolasi bahan aktif yang terkandung di dalam ekstrak tanaman yang memiliki kemampuan antibakterial terbaik. Tahap 4, mencari dosis yang efektif dan tidak bersifat toksik terhadap ikan nila melalui uji toksisitas ekstrak. Tahap 5, mencari dosis dan metode pemberian yang paling efektif untuk mencegah infeksi kedua bakteri secara in vivo. Serta Tahap 6, mencari dosis dan metode pemberian yang paling efektif untuk mengobati infeksi bakteri Aeromonas dan Pseudomonas secara in vivo. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari 32 ekstrak tanaman rempah yang diuji, 30 ekstrak memiliki antibakterial terhadap A. hydrophila dan 29 ekstrak terhadap Pseudomonas sp. Konsentrasi temu kunci (Boesenbergia pandurata) 600 dan 900 ppm dan lempuyang (Zingiber zerumbet) 200 dan 2000 ppm merupakan konsentrasi antibakterial terbaik terhadap bakteri A. hydrophila sedangkan konsentrasi ekstrak terung asam (Solanum ferox) 400 dan 900 ppm menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas sp. dari hasil isolasi bahan aktif, diketahui bahwa ekstrak temu kunci mengandung alkaloid, flavonoid dan karbohidrat; terung asam mengandung alkaloid dan karbohidrat dan lempuyang mengandung bahan yang lebih banyak yaitu alkaloid, flavonoid, steroid dan karbohidrat. Konsentrasi temu kunci (Boesenbergia pandurata) 600 ppm, lempuyang (Zingiber zerumbet) 200 ppm dan terung asam (Solanum ferox) 900 ppm merupakan konsentrasi antibakterial terbaik yang aman digunakan pada ikan untuk penelitian selanjutnya. Untuk pencegahan, dosis 600 ppm temu kunci efektif digunakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dengan menggunakan metoda melalui pakan, ekstrak terung asam 900 ppm efektif mencegah Pseudomonas sp. melalui perendaman dan lempuyang 200 ppm efektif untuk mencegah infeksi bakteri A. hydrophila melalui pakan. Untuk Pengobatan, dosis 600 ppm temu kunci efektif digunakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila melalui injeksi, ekstrak terung asam 900 ppm efektif mengobati infeksi Pseudomonas sp. melalui pakan dan perendaman dan lempuyang 200 ppm efektif untuk mengobati infeksi bakteri A. hydrophila melalui ketiga metode injeksi, pakan dan perendaman. Kata kunci : antibakterial, imunostimulan, ikan nila,tanaman rempah

4 iv PRAKATA Penelitian dengan judul Pemanfaatan Ekstrak Tanaman Rempah Asal Kalimantan Timur sebagai Produk Pengendalian Penyakit Bakterial pada Budidaya Ikan Air Tawar merupakan penelitian yang di danai oleh DIKTI melalui Penelitian Kompetitif Nasional Strategis Nasional tahun anggaran 2015/2016. Penelitian ini terlaksana atas bantuan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman, Dinas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Kabupaten Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur. Penelitian ini diharapkan menghasilkan beberapa keluaran seperti artikel yang dapat diterbitkan dalam jurnal internasional dan atau jurnal nasional terakreditasi, buku ajar yang berjudul Parasit Biota Akuatik dan Penanggulangannya serta PATEN yang akan dihasilkan pada akhir tahun kedua tentang Esktrak Temu kunci, terung asam dan lempuyang sebagai bahan antibacterial untuk ikan nila. Penulis sangat menyadari bahwa penulisan laporan ini masih terdapat kekurangan, sehingga dibutuhkan saran dan masukan untuk perbaikan penulisan laporan penelitian ini. Samarinda, November 2015 Esti Handayani Hardi

5 v DAFTAR ISI HALAMAN SAMPUL HALAMAN PENGESAHAN RINGKASAN PRAKATA DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN i ii iii iv v vii ix xi BAB 1. PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Lokasi Kegiatan Output Penelitian 3 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 4 BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN Tujuan penelitian Manfaat Penelitian 8 BAB 4. METODE PENELITIAN Persiapan Ikan Uji Persiapan bakteri uji Pengumpulan dan identifikasi tanaman Ekstraksi tanaman Uji Aktivitas antibakterial Uji penentuan dosis efektif ekstrak tanaman temu kunci, terung asam dan lempuyang sebagai bahan antibakterial Uji toksisitas Bahan ekstraksi tanaman rempah 12

6 vi 4.8 Uji aktivitas imunostimulan dan antibakterial secara in vivo 13 a. Uji Penentuan Dosis Efektif Untuk Pengendalian (Pencegahan dan Pengobatan) Penyakit Bakterial Melalui Metoda Injeksi 13 b. Uji Penentuan Dosis Efektif Untuk Pengendalian (Pencegahan dan Pengobatan) Penyakit Bakterial Melalui Metoda Pakan 14 c. Uji Penentuan Dosis Efektif Untuk Pengendalian (Pencegahan dan Pengobatan) Penyakit Bakterial Melalui Metoda Perendaman Parameter Penelitian 16 BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas antibakterial Penentuan konsentrasi ekstrak untuk pencegahan dan pengobatan penyakit 21 a. Temu Kunci 21 b. Terung Asam 24 c. lempuyang Isolasi bahan aktif yang terkandung dalam ekstrak Temu Kunci, Terung Asam dan Lempuyang Uji Toksisitas Konsentrasi ekstrak Temu kunci, Terung Asam dan Lempuyang pada ikan nila Aktivitas imunostimulan dan antibakterial secara in vivo 31 BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA 51 BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN 53 DAFTAR PUSTAKA 55 LAMPIRAN 58

7 vii DAFTAR TABEL Gambar Keterangan Halaman 4.1 Jenis tanaman rempah yang berasal dari Kalimantan Timur yang digunakan dalam uji aktivitas antibakterial terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp Pengujian toksisitas ekstrak tanaman rempah pada ikan nila Pengujian kemampuan ekstrak tanaman rempah untuk mencegah infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. pada ikan nila 5.1 Hasil uji aktivitas antibakterial ekstrak tanaman rempah terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp Hasil analisis fitokimia pada beberapa ektrak etanol tanaman rempah Perubahan tingkah laku berenang dan nafsu makan ikan nila pada uji coba toksisitas ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang 5.4 Patologi anatomi ikan nila pada uji coba toksisitas ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang 5.5 Perubahan tingkah laku berenang ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. 5.6 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. 5.7 Perubahan tingkah laku berenang ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode pakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. 5.8 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. 5.9 Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode injeksi untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak 44

8 viii temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode injeksi untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui perendaman untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui perendaman untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp

9 ix DAFTAR GAMBAR Gambar Keterangan Halaman 2.1 Alur pelaksanaan penelitian effectivitas antibakterial beberapa tanaman rempah asal Kalimantan timur Skema proses ekstraksi tumbuhan rempah tradisional Aktivitas antibakterial tumbuhan rempah terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. yang menginfeksi ikan nila 5.2 Aktivitas antibakterial tumbuhan rempah Temu kunci terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode daya hambat jam ke jam 5.3 Aktivitas antibakterial tumbuhan temu kunci terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode daya hambat pada waktu 24 jam 5.4 Aktivitas antibakterial tumbuhan temu kunci terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode kultur bersama masa inkubasi 24 jam 5.5 Aktivitas antibakterial tumbuhan terung asam terhadap bakteri Pseudomonas sp. dengan metode daya hambat 5.6 Aktivitas antibakterial tumbuhan terung asam terhadap bakteri Pseudomonas sp. dengan metode kultur bersama masa inkubasi 24 jam 5.7 Aktivitas antibakterial tumbuhan lempuyang terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode daya hambat pada jam 24 dan Aktivitas antibakterial tumbuhan lempuyang terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode kultur bersama masa inkubasi jam Kematian kumulatif ikan nila pada uji toksisitas ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang 5.10 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melaui metode melalui pakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp

10 x 5.12 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp 5.15 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp

11 xi DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Keterangan Halaman I Lampiran Instrumen 58 II Lampiran Personalia tenaga peneliti beserta kualifikasinya 61 III Publikasi 72

12 1 BAB 1. PENDAHULUAN 1.1. Latar belakang Tanaman rempah banyak tumbuh di hutan tropikal Indonesia khususnya Kalimantan Timur, sebanyak 80 % ditumbuhi dengan tanaman obat, diduga terdapat spesies tanaman obat dimana spesies belum diketahui manfaatnya dan belum digunakan di bidang kesehatan (Pramono, 2002). Tanaman rempah seperti daun jambu air, sambiloto, daun jambu monyet, daun kayu salam, sambiloto dan daun brotowali diketahui memiliki kandungan bahan antioksidan yang tinggi (Arung et al., 2009). Sedangkan Kusuma et al. (2009) menguji akifitas anti jamur dari ekstrak daun tanaman bawang tiwai (Eleutherine americana), lamtoro (Leucaena glauca), salam (Eugenia polyantha), waru (Hibiscus tiliaceus), diketahui semua bahan tersebut mampu menghambat pertumbuhan jamur sebesar 35-61%. Penggunaan bahan fitofarmaka untuk penanggulangan penyakit sudah banyak di lakukan dalam perikanan. Penggunaan bahan antibakterial dari jambu biji (Psidium guajava L.), sambiloto (Andrographis paniculata Nees) dan sirih (Peper betle L.) terhadap bakteri Aeromonas hydrophila dibuktikan oleh Angka (2005). Penggunaan imunostimulan juga banyak diterapkan dalam budidaya karena imunostimulan membantu meningkatkan resistensi terhadap infeksi penyakit dengan meningkatkan mekanisme pertahanan spesifik dan nonspesifik. Beberapa imunostimulan yang banyak diterapkan dalam akuakultur antara lain glukan (Chen dan Ainsworth, 1992), lactoferrin (Sakai et al., 1993), chitosan (Siwicki et al., 1994), aloe (Kim et al., 1999) dan extracellular products (ECPs) dari Mycobakterium (Chen et al., 1998). Imunostimulan mampu meningkatkan status imunitas ikan dengan cara memacu kerja sel fagosit dan meningkatkan aktivitas lisosom, komplemen dan juga immunoglobulin (Yuan et al., 2007). Budidaya ikan nila di Kalimantan Timur berkembang sangat pesat namun serangan patogen masih menjadi penyebab utama kematian ikan. Dari hasil pengamatan tahun diketahui bahwa penyebab utama kematian ikan adalah penyakit bakterial yang disebabkan oleh Aeromonas sp dan Pseudomonas sp (Hardi dan Pebrianto, 2012). Ikan nila yang terinfeksi menunjukkan gejala eksoptalmia, permukaan tubuh menghitam, dan luka pada organ terinfeksi. Pada awal infeksi ikan tampak

13 2 berenang lemah, nafsu makan berkurang dan terkadang ikan berenang gasping dan whirling. Penanggulangan penyakit bakterial pada budidaya ikan nila sudah banyak dilakukan namun kejadian penyakit tetap terjadi sepanjang tahun. Penanggulangan penyakit dengan menggunakan bahan alami lebih direkomendasikan karena tidak memiliki efek resisten terhadap suatu penyakit. Penanggulangan penyakit bakterial dapat dilakukan dengan upaya pencegahan dengan menggunakan tumbuhan tanaman rempah yang mengandung bahan imunostimulan (peningkatan system imunitas ikan) dan tanaman tanaman rempah yang mengandung bahan antibakterial Perumusan Masalah Penelitian ini merupakan pengembangan penelitian-penelitian sebelumnya mengenai bioscreening bahan bioaktif dari tanaman rempah, kebaruan dari penelitian ini adalah ditemukannya tanaman rempah lokal yang dapat digunakan untuk mencegah infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan produk bahan antibakterial dan imunostimulan yang dapat digunakan secara mudah dan efektif oleh pembudidaya ikan air tawar khususnya ikan nila untuk membantu peningkatan produksi hasil panen. Beberapa hal yang diharapkan dapat dihasilkan dari penelitian ini selain dihasilkan produk antibakterial dan imunotimulan adalah dihasilkan juga publikasi pada jurnal ilmiah nasional terakreditasi atau jurnal bereputasi internasional. Selain itu juga diharapkan diketahuinya teknologi tepat guna terkait penggunaan bahan dari tanaman rempah yang dimanfaatkan oleh masyarakat pembudidaya. Selanjutnya penelitian ini dapat menghasilkan luaran tambahan berupa: buku ajar terkait mata kuliah parasit dan penyakit biota akuatik, manajemen kesehatan akuakultur dan bioprospektif bahan alam. Dalam penelitian ini akan dilakukan pengujian efektifitas bahan bioaktif dari tanaman rempah asal Kalimantan Timur berupa bahan antibakterial dan imonostimulan yang dapat digunakan untuk mencegah penyakit bakterial pada budidaya ikan nila. Sasarannya adalah ditemukan bahan alami yang dapat digunakan untuk menanggulangi penyakit bakterial sehingga budidaya ikan nila di Kalimantan Timur khususnya dapat berkembang dengan baik dan diperoleh hasil produksi yang optimal.

14 Lokasi kegiatan Penelitian pada tahun pertama dilakukan secara laboratoris di lingkungan Universitas Mulawarman yaitu laboratorium Mikrobiologi Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unmul dan Laboratorium Kimia Hasil Hutan Fakultas Kehutanan Unmul. Waktu pelaksanaan pada tahun pertama dilaksanakan pada bulan Maret - Oktober 2015 dengan lama waktu penelitian 8 bulan. Sampel tanaman rempah diambil dari pasar Tradisional di Kalimantan Timur. Bakteri uji yang digunakan (A. hydrophila dan Pseudomonas sp.) yang berasal dari Laboratorium Mikrobiologi Perairan, yang di isolasi dari ikan nila yang menunjukkan gejala aeromonasis dan pseudomonasis dari karamba jarring apung di Loa Kulu, Kutai Kartanegara, dan ikan uji yang digunakan adalah ikan nila berukuran berkisal 15 gram/ekor Output Penelitian Beberapa keluaran yang diharapkan dapat dihasilkan dari penelitian ini adalah: 1. Menghasilkan PATEN bahan alami yang memiliki kemampuan antibakterial dan imunostimulan bagi ikan air tawar. 2. Menghasilkan contoh produk yang dapat digunakan dalam budidaya ikan air tawar 3. Hasil penelitian dapat di publish di jurnal nasional akreditasi atau jurnal internasional 4. Selain itu juga akan dihasilkan bahan ajar untuk mata kuliah khusunya Bioteknologi Akuakultur.

15 4 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA Penelitian Effektivitas Antibakterial Beberapa Tanaman Rempah Asal Kalimantan Timur, pada Budidaya Ikan Nila di Kalimantan Timur ini sangat penting untuk dilakukan karena serangan patogen bakterial pada budidaya ikan nila terjadi sepanjang tahun terutama pada musim penghujan dan dapat menyebabkan kematian lebih dari 75%, sehingga penanggulangan penyakit bakterial harus segera dilakukan. Pemanfaatan tanaman rempah yang tumbuh di daerah lokal untuk menanggulangi serangan penyakit pada system budidaya sangat direkomendasikan karena tidak memiliki efek resistensi terhadap suatu obat dari bahan kimia nantinya. Penelitian ini merupakan lanjutan dan pendalaman penelitian terkait penanggulangan penyakit bakterial pada budidaya ikan nila di Loa Kulu Kutai Kartanegara. Laboratorium Mikrobiologi Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman berhasil mengisolasi isolat bakteri Aeromonas sp dan Pseudomonas sp, yang bersifat patogen pada ikan nila (Hardi dan Pebrianto, 2012). Rencananya penelitian ini akan dilakukan dalam dua tahun, yang terdiri dari serangkaian penelitian dengan tujuan yang saling berkaitan. Tahun pertama dilakukan untuk mengetahui potensi aktivitas antibakterial dan imunostimulan dari beberapa ekstrak tanaman rempah yang dimanfaatkan untuk pengendalian penyakit bakterial pada budidaya ikan nila secara laboratorium. Pada tahun pertama akan dikaji kandungan bahan antibakterial dari ekstrak 32 jenis tanaman rempah, 3 5 jenis ekstrak dengan hasil terbaik akan diuji secara invivo baik tingkat toksisitasnya maupun tingkat proteksinya dengan berbagai metode yaitu injeksi, melalui pakan dan melalui perendaman. Pada tahun kedua akan dilakukan pengujian terkait cara pengemasan dan penyimpanan produk terhadap aktivitas antibakterial dan imunostimulan dari ekstrak tanaman rempah. Penyimpanan dilakukan dalam botol plastik, kaca dan disimpan pada suhu ruang dan pada suhu 4 o C selama 1, 2, 3, dan 4 minggu. Hasil terbaik akan diuji secara langsung di karamba budidaya ikan nila di Loa Kulu, Kutai Kartanegara. Tahapan pertama yaitu menguji efektivitas antibakterial berbagai konsentrasi ekstrak tanaman rempah terung asam, lempuyang, temu kunci, jeruk pecel, dan asam jawa secara in vitro terhadap bakteri Aeromonas dan Pseudomonas sp. Dilanjutkan dengan uji toksisitas konsentrasi dari masing-masing tanaman rempah yang memiliki diameter zona hambat terbesar. Tujuannya adalah untuk meyakinkan bahwa kandungan

16 5 dan konsentrasi bahan alami yang digunakan aman (tidak menyebabkan ikan sakit dan atau mati) untuk biota budidaya. Tahapan ketiga adalah melakukan pengujian secara in vivo pada ikan nila, berupa pengujian pencegahan (peningkatan komponen system imun dan kemampuan mencegah infeksi kedua bakteri yang diberikan melalui penginjeksian) dan pengobatan pasca infeksi. Tahapan selanjutnya adalah melakukan pengujian secara in vivo pada ikan nila, berupa pengujian peningkatan komponen system imun dan kemampuan mencegah infeksi kedua bakteri yang diberikan melalui pakan dan melalui perendaman. Pada Tahun kedua akan dilakukan pengujian terkait penyimpanan bahan aktif dan efektifitas bahan aktif. Tahapan ini bertujuan untuk mengetahui teknik penyimpanan bahan yang paling baik sehingga nantinya dihasilkan produk yang benarbenar siap untuk dipasarkan kepada pembudidaya ikan. Penyimpanan dilakukan dengan berbagai metode dan diujii efektivitas antibakterial dan imunostimulan pada ikan nila. Selanjutnya pengujian dilakukan secara langsung pada karamba budidaya ikan nila di Loa Kulu, Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur. Pelaksanaan penelitian secara keseluruhan dan skematis disajikan pada Gambar 2.1, yang merupakan penelitian secara laboratorium untuk menggambarkan permasalahan secara menyeluruh dan jelas.

17 6 EKSTRAKSI DAUN TANAMAN REMPAH Ekstraksi dengan menggunakan etanol, konsentrasi ekstrak: 500 dan 600ppm UJI AKTIVITAS ANTIBACTERIAL 32 EKSTRAK TANAMAN Metode Agar Disc Diffusion PENENTUAN DOSIS EFEKTIF EKSTRAK TANAMAN SEBAGAI BAHAN ANTIBACTERIAL Temu kunci, terung asam dan lempuyang: Metode Agar Disc Diffusion dan kultur bersama ISOLASI BAHAN AKTTIF Ekstrak Temu Kunci, Terung Asam dan Lempuyang UJI TOKSISITAS BAHAN HASIL EKSTRAKSI Perubahan tingkah laku berenang, perubahan patologi anatomi organ dalam dan luar, gambaran darah dan kematian ikan UJI KANDUNGAN MUNOSTIMULAN DAN ANTIBAKTERIAL Secara In Vivo (Melalui injeksi, pakan dan perendaman) TAHUN PERTAMA UJI PENCEGAHAN INFEKSI UJI PENGOBATAN INFEKSI PUNGUJIAN PENYIMPANAN/PENGEMASAN BAHAN AKTIF DAN EFEKTIVITAS PROTEKSI TAHUN KEDUA UJI KEMAMPUAN MUNOSTIMULAN DAN ANTIBAKTERIAL Secara In Vivo (Melalui pakan dan perendaman) di Lapangan (dalam KJA) PRODUK IMUNOSTIMULAN DAN ANTIBAKTERIAL UNTUK MENCEGAH INFEKSI bakteri Aeromonas sp dan Pseudomonas sp Gambar 2.1 Alur pelaksanaan penelitian Effektivitas Antibakterial Beberapa Tanaman Rempah Asal Kalimantan Timur

18 7 Penelitian ini diharapkan akan menghasilkan suatu produk yang dapat digunakan secara langsung oleh pembudidaya ikan nila di Kalimantan Timur khususnya dan yang tersebar di seluruh wilayah Indonesia umumnya untuk mencegah penyakit bakterial agar budidaya dapat berlangsung terus menerus dengan adanya peningkatan produksi. Mitra yang terlibat dalam penelitian ini adalah laboratorium Mikrobiologi Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Unmul, Laboratorium Kimia Hasil Hutan Fakultas Kehutanan Unmul, Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman, Dinas Kelautan dan Perikanan Kutai Kartanegara, Balai Benih Perikanan Tawar Sebulu Kutai Kartanegara dan pembudidaya ikan nila di Loa Kulu, Loa Janan kabupaten Kutai Kartanegara. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat diproduksi oleh Unmul bekerja sama dengan Dinas Perikanan dan Kelautan Kutai Kartanegara untuk didistribusikan kepada pembudidaya Ikan nila di Kalimantan Timur. Dinas Kelautan dan Peikanan terlibat dalam penelitian Effektivitas Antibakterial Beberapa Tanaman Rempah Asal Kalimantan Timur dalam hal : Membantu menyiapkan ikan sampel (1500 ekor) yang akan digunakanan dalam uji invivo. Menjebatani antara peneliti dan masyarakat pembudidaya dalam hal pengumpulan informasi masalah yang terjadi dalam budidaya ikan air tawar Menyiapkan karamba jarring apung yang akan digunakan untuk pengujian hasil penelitian di lahan budidaya secara langsung. Membantu menyebarkan informasi kepada pembudidaya terkait produk yang dihasilkan dari penalitian ini.

19 8 BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN 3.1 Tujuan Penelitian Tujuan jangka panjang penelitian ini adalah untuk menghasilkan produk imunostimulan dan antibakterial alami untuk menanggulangi infeksi bakterial pada budidaya ikan nila yang disebabkan oleh bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Untuk mencapai tujuan besar tersebut perlu dilakukan beberapa tahapan penelitian dengan tujuan antara lain : 1. Diketahui ekstrak yang memiliki kemampuan antibakterial terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. secara in vitro. 2. Diketahui konsentrasi dan dosis efektif dari ekstrak tanaman rempah yang bersifat Antibakterial untuk menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas pada ikan nila secara invitro. 3. Mengetahui jenis bahan aktif yang terkandung di dalam ektrak yang memiliki kemampuan antibakterial terbaik terhadap A. hydrophila dan Pseudomonas. 4. Diketahui dosis yang efektif dan tidak bersifat toksik terhadap ikan nila. 5. Ditemukan dosis dan metode pemberian yang paling efektif untuk mencegah infeksi bakteri Aeromonas dan Pseudomonas secara in vivo. 6. Ditemukan dosis dan metode pemberian yang paling efektif untuk mengobati infeksi bakteri Aeromonas dan Pseudomonas secara in vivo. 3.2 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya produk yang mudah digunakan, mudah diperoleh, murah harganya dan memiliki tingkat proteksi yang tinggi terhadap infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. yang menginfeksi ikan nila yang dapat menjadi pilihan para pembudidaya di Kalimantan Timur khususnya.

20 9 BAB 4. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret hingga Oktober 2015 di Laboratorium Mikrobiologi Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur. Namun untuk ekstraksi tanaman rempah dilakukan di Laboratorium Kimia Kayu, Fakultas Kehutanan, Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan, yaitu : 4.1 Persiapan Ikan Uji Ikan uji yang digunakan adalah ikan nila yang berasal dari Balai Benih Perikanan Tawar Sebulu Kabupaten Kutai Kartanegara. Ikan yang digunakan berukuran ±15g yang sebelumnya dikarantina dan diisolasi selama 5 hari untuk meyakinkan bahwa ikan yang digunakan tidak membawa penyakit bakterial. 4.2 Persiapan Bakteri uji Bakteri yang digunakan adalah bakteri Aeromonas hydrophila (EA-01) dan Pseudomonas sp. (EP-01) yang diperoleh dari ikan nila yang mengalami sakit dan mati di Loa Kulu Kutai Kartanegara Kalimantan Timur. Sebelum bakteri digunakan, bakteri terlebih dahulu dilakukan uji Postulat Koch untuk mempertahankan tingkat keganasan bakteri pada inang. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui dampak dari infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas pada ikan nila, ini sebagai upaya untuk meyakini bahwa perubahan yang terjadi baik perubahan tingkah laku maupun patologi anatomi organ luar dan organ dalam ikan nila disebabkan oleh kedua bakteri ini. Ikan yang digunakan dalam percobaan ini berjumlah 5 ekor untuk setiap bakteri. Ikan dinjeksi dengan masing-masing bakteri dengan kepadatan CFU/ml sebanyak 0.2 ml/ekor, penginjeksian dilakukan melalui intraperitonial. Beberapa parameter yang diamati yaitu perubahan tingkah laku berenang, perubahan anatomi organ luar dan organ dalam secara makroskopis serta pengamatan kematian ikan. Pengamatan parameter dilakukan setiap 24 jam pasca injeksi hingga jam ke-120 (hari ke 5). 4.3 Pengumpulan dan Identifikasi Tanaman Sampel tumbuhan rempah tradisional dikumpulkan dari beberapa pasar tradisional di Samarinda. Pemilihan jenis tumbuhan yang dikumpulkan terutama

21 10 berbasis pada informasi etnobotani oleh masyarakat lokal, khususnya jenis-jenis tumbuhan yang digunakan sebagai rempah dan aromatik dalam masakan, pengawet pangan, pewangi dan informasi lainnya. Konfirmasi identitas jenis dilakukan oleh staf pengenal jenis dari Fakultas Kehutanan dan dikonfirmasi di Balai Penelitian Perbenihan, Samboja. Proses ekstraksi dilakukan di Laboratorium Kimia Kayu, Jurusan Teknologi Hasil Hutan, Fakultas Kehutanan, Universitas Mulawarman. Beberapa jenis tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : Tabel 4.1. Jenis tanaman rempah yang berasal dari Kalimantan Timur yang digunakan dalam uji aktivitas antibakterial terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Jenis Tanaman Rempah Nama Indonesia Nama Latin Cengkeh Syzygium aromaticum Daun Kunyit Curcuma domestica Terong Asam Solanum ferox Temu Giring Curcuma heyneana Kapulaga Amomum compactum Kemangi Ocimum sanctum Asam Jawa Tamarindus indica Temu Kunci Boesenbergia pandurata Lengkuas Alpinia galanga (L.) Sw. Lempuyang Zingiber zerumbet Linn Lada Hitam Piper nigrum L. Jintan Putih Cuminum cyminum Kecombrang Etlingera elatior Ketumbar Coriandrum sativum Kencur Kaempferia galanga L Jahe Merah Zingiber officinale var Biji Pala Myristica fragrans Bunga Sisir Illicium verum Kunyit Curcuma longa Merica Piper nigrum Kalabat Trigonella foenum-graecum Daun Jeruk Purut leaf Citrus hystrix Kayu Manis Cinnamomum verum Selasih Ocimum Sereh Cymbopogon citrates Adas Foeniculum vulgare Daun Pandan Pandanus amaryllifolius Jeruk Pecel Citrus hystrix Temu Ireng Curcuma aeruginosa Sereh Wangi Cymbopogon citrates Kluwek Artocarpus camansi Jinten Hitam Nigella sativa

22 Ektraksi Tanaman Sampel tumbuhan yang diteliti (Tabel 3.1) dibuat serbuk simplisia dengan menggunakan blender kering sehingga menjadi serbuk sampel. Setelah itu, sampel dikeringkan dalam ruangan dengan suhu konstan. Setelah kering maka sampel diserbuk dengan menggunakan blender dan siap untuk di ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan cara merendam 100 g sampel dengan etanol dalam tabung Erlenmeyer. Sampel selanjutnya dihomogenkan dengan menggunakan shaker selama 48 jam pada suhu kamar. Setelah itu larutan ekstrak disaring dan dipekatkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator sehingga didapatkan ekstrak kasar. Alur proses ekstraksi sampel tumbuhan dapat dilihat pada Gambar 3.1. Serbuk Sampel Ekstrak Etanol Cair Ekstrak Pekat Shaker (2 x 24 jam) Disaring kemudian dievaporasi pada suhu C Ekstrak Kasar Vakum oven (2 x 24 jam) Gambar 4.1 Skema Proses Ekstraksi Tumbuhan Rempah Tradisional 4.5 Uji Aktivitas Antibakterial Pengujian dilakukan melalui uji daya hambat secara in vitro dari bahan ekstraksi dengan Disc Diffusion Assay (Dulger dan Gonuz, 2004). Konsentrasi ekstrak yang digunakan berkisar antara ppm, selanjutnya masing-masing bahan ekstrak dilakukan uji hambat terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. dengan prosedur sebagai berikut : a) Konsentrasi ekstrak tanaman rempah masing-masing diteteskan pada kertas widman steril sebanyak 25 µm, selanjutnya diletakkan diatas media yang telah

23 12 berisi biakan bakteri pada media TSA (Triptic Soy Broth), selanjutnya biakan bakteri yang telah berisi kertas cakram diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 o C. b) Pengamatan zona bening dilakukan pada jam ke 24 dan 48 dengan mengukur diameter zona bening yang terbentuk dalam mm. c) Evaluasi zona bening yang terbentuk. 4.6 Uji penentuan dosis efektif ekstrak tanaman Temu kunci, terung asam dan lempuyang sebagai bahan antibakterial Pengujian dilakukan untuk mengetahui dosis secara tepat yang efektif dari ketiga ekstrak yaitu temu kunci (Boesenbergia pandurata), terung asam (Solanum ferox), dan lempuyang (Zingiber zerumbet). Ketiga ekstrak tanaman tersebut dipilih karena memiliki zona hambat yang luas untuk masing-masing bakteri, pengujian dilakukan dengan dua metode yaitu metode Diffusion Assay method (Dulger and Gonuz, 2004) dan metode kultur bersama. Konsentrasi yang digunakan adalah ppm Boesenbergia pandurata dan Solanum ferox serta ppm ekstrak Zingiber zerumbet. Ketiga ekstrak tersebut dipilih karena selain memiliki kemampuan antibakterial yang tinggi, ketiga bahan tersebut murah, mudah diperoleh, dan berpeluang untuk dikembangkan sebagai obat-obat tradisional untuk budidaya ikan air tawar. 4.7 Uji Toksisitas Bahan Ekstraksi Tanaman Rempah Ikan yang digunakan dalam percobaan ini berjumlah 10 ekor perakuarium, dimana setiap perlakuan di ulang sebanyak tiga kali. Konsentrasi yang akan diuji pada tahapan ini adalah dua konsentrasi dari tanaman rempah terbaik (memiliki diameter zona hambat terlebar) dari masing-masing tanaman. Dalam pelaksanaan tahapan uji toksisitas bahan ekstraksi tanaman rempah dilakukan pengukuran beberapa parameter yaitu perubahan tingkah laku, tingkah laku makan, perubahan anatomi organ luar dan organ dalam secara makroskopis, serta pengamatan kematian ikan. Uji toksisitas dilakukan untuk memastikan keamanan bahan bioaktif yang terkandung di dalam tanaman rempah bagi ikan nila. Ekstrak tanaman rempah

24 13 diinjeksikan sebanyak 0.1 ml/ekor melalui intraperitoneal. Ikan dipelihara selama 5 hari dan dilakukan pengamatan kematian ikan, perubahan tingkah laku dan patologi anatomi organ luar setiap 24 jam hingga hari ke 5. Pengujian toksisitas dilakukan menggunakan 2 konsentrasi masing-masing pada ikan nila untuk mengetahui tingkat keamanan bahan ekstrak terhadap ikan nila. Tabel 4.2 Pengujian toksisitas ekstrak tanaman rempah pada ikan nila Perlakuan Ekstrak Tanaman Rempah Konsentrasi (PPM) 1 Temu Kunci Temu Kunci Terung Asam Terung Asam Lempuyang Lempuyang Kontrol NaCl Fisiologis 4.8 Uji aktivitas imunostimulan dan antibakterial secara in vivo a. Uji Penentuan Dosis Efektif Untuk Pengendalian (Pencegahan dan Pengobatan) Penyakit Bakterial Melalui Metoda Injeksi Pengujian pengendalian penyakit bakterial yang disebabkan oleh A. hydrophila dan Pseudomonas sp. baik pencegahan maupun pengobatan menggunakan dosis zona hambat terbesar dari uji in vitro, yaitu temu kunci 600 ppm, terung asam 900 ppm dan lempuyang 200 ppm. Pengujian pencegahan, ikan uji diinjeksi melalui intraperitonial dengan dosis 0.1 ml/ekor masing-masing konsentrasi ekstrak dan dipelihara selama 7 hari, kemudian hari ke-8 disuntik dengan bakteri uji CFU/ml sebanyak 0.1 ml/ekor yang diinjeksi melalui intramuscular kemudian diamati hingga hari ke 14. Secara terperinci dijabarkan pada Tabel 4.3 berikut. Tabel 4.3 Pengujian kemampuan ekstrak tanaman rempah untuk mencegah infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. pada ikan nila Perlakuan Ekstrak Rempah Konsentrasi (ppm) Uji Tantang 1 Temu Kunci 600 A. hydrophila

25 14 2 Terung Asam 900 Pseudomonas sp. 3 Lempuyang 200 A. hydrophila 4 Kontrol NaCl Fisiologis A. hydrophila 5 Kontrol NaCl Fisiologis Pseudomonas sp. Pengujian pengobatan dilakukan dengan dosis yang sama dengan uji pencegahan hanya injeksi dengan bakteri uji dilakukan diawal melalui intramuscular sebanyak 0.1 ml/ekor kepadatan bakteri CFU/mL pada D1 dan ditunggu hingga hari ke 7, kemudian pada hari ke 8 dilakukan pengobatan menggunakan ekstrak melalui injeksi intraperitonial. Rangkaian percobaan pengobatan diuraikan sebagai berikut: Perlakuan : Ikan uji disuntik secara intramuscular dengan bakteri uji sebanyak 0.1 ml, diamati selama 7 hari kemudian hari ke-8 disuntik dengan ekstrak dan diamati hingga 14 hari. Kontrol : Ikan uji disuntik secara intramuscular dengan bakteri uji sebanyak 0.1 ml, diamati selama 7 hari selanjutnya disuntik dengan PBS pada hari ke 8 dan dilakukan pengamatan hingga hari ke 14 hari. b. Uji Penentuan Dosis Efektif Untuk Pengendalian (Pencegahan dan Pengobatan) Penyakit Bakterial Melalui Metoda Pakan Tahap ini diawali dilakukan dengan mencampur ekstrak tanaman rempah pada pakan ikan komersil dengan konsentrasi masing-masing bahan, yaitu temu kunci 600 ppm, terung asam 900 ppm dan lempuyang 200 ppm, pencampuran diberikan sebanyak 2 % dari jumlah pakan yang diberikan. Sebelum dicampur dengan pakan, masingmasing konsentrasi ekstrak ditambahkan kuning telur sebanyak 2 % dari bahan ekstrak, setelah tercampur baru ditambahkan pada pakan pellet. Pakan yang telah tercampur ekstrak harus segera diberikan pada ikan maksimal 8 jam setelah pencampuran. Uji pencegahan dengan metode pakan dilakukan dengan memberikan pakan sebanyak 2 kali per hari secara ad satiation, pemberian pakan yang dicampur dengan ekstrak diberikan selama 7 hari dan hari ke 8, diuji tantang dengan cara diinjeksi dengan bakteri patogen melalui intramuscular dan selanjutnya diamati hingga hari ke 14. Skema percobaan dijabarkan di bawah ini.

26 15 Perlakuan kontrol : Ikan diberi pakan PK yang tlah dicampur dengan masing-masing ekstrak tanaman hingga hari ke 7 (2x sehari), selanjutnya pada hari ke 8 diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. : Ikan diberi pakan komersil biasa hingga hari ke 7 (2x sehari), selanjutnya pada hari ke 8 diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Proses pencampuran ekstrak fitofarmaka dengan pakan dilakukan dengan urutan sebagai berikut : Pakan komersil + 2 % Ekstrak + 2 % kuning telur pencampuran dengan pakan dikeringanginkan disimpan hingga diberikan pada ikan (masa penyimpanan tidak boleh lebih dari 6 jam). Uji pengobatan dilakukan dengan dosis yang sama, hanya infeksi kedua bakteri dilakukan diawal (D1) kemudian pada hari ke 8 di beri pakan yang telah dicampur dengan fitofarmaka hingga hari ke 14. c. Uji Penentuan Dosis Efektif Untuk Pengendalian (Pencegahan dan Pengobatan) Penyakit Bakterial Melalui Metoda Perendaman Dosis yang digunakan sama dengan dosis pada 2 metode sebelumnya. Tahap ini diawali dilakukan dengan membuat larutan dalam 1 liter air dengan konsentrasi bahan ekstrak masing-masing, yaitu temu kunci 600 ppm, terung asam 900 ppm dan lempuyang 200 ppm. Pengujian pencegahan dilakukan dengan merendam ikan dalam larutan ekstrak selama 30 menit kemudian selanjutnya ikan dimasukkan ke dalam akuarium uji, ditunggu hingga hari ke 7. Selanjutnya pada hari ke 8 diinjeksi melalui intramuscular dengan masing-masing bakteri uji kepadatan CFU/mL selanjutnya dimasukkan ke dalam akuarium uji hingga hari ke 14. Kontrol : Ikan direndam dengan larutan NaCl fisiologis selama 30 menit dan dimasukkan dalam akuarium uji dipelihara hingga hari ke 7. selanjutnya ikan diinjeksi dengan bakteri A. hydrophila atau Pseudomonas sp. pada hari ke 8.

27 16 Perlakuan : Ikan direndam dengan larutan ekstrak dengan konsentrasi masing-masing selama 30 menit dan dimasukkan dalam akuarium uji dipelihara hingga hari ke 7. selanjutnya ikan diinjeksi dengan bakteri A. hydrophila atau Pseudomonas sp. pada hari ke 8. Uji pengobatan dilakukan dengan mengginjeksi ikan uji dengan bakteri A. hydrophila atau Pseudomonas sp. dengan kepadatan CFU/mL melalui intramuscular dan diamati hingga hari ke 7. Kemudian pada hari ke 8 ikan direndam dengan ekstrak rempah dengan konsentrasi masing-masing selama 30 menit, selanjutnya di pelihara kembali hingga hari ke Parameter Penelitian Parameter yang diukur dalam setiap tahapan berbeda, sesuai dengan tujuan yang akan dicapai. Parameter yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: 1. Perubahan tingkah laku berenang dan nafsu makan yang diamati berupa: berenang gasping, lemah, agresif dan penurunan nafsu makan. Pengamatan dilakukan selama 5 menit dimulai D1 hingga D Patologi anatomi organ luar ikan. Perubahan yang diamati pada anatomi luar berupa kondisi mata (eksoptalmia), warna tubuh, sirip gripis. Pengamatan dilakukan setiap hari mulai D1 hingga D Pengamatan gambaran darah diawali dengan pengambilan darah ikan dengan jarum suntik dari vena caudalis. Pengukuran parameter gambaran darah antara lain diferensial leukosit, total leukosit serta total eritrosit dilakukan mengikuti prosedur Blaxhall dan Daisley (1973). Pengamatan dilakukan pada D0, D7, dan D Pengukuran patologi klinik darah : kadar hemoglobin diukur menurut metode Sahli dengan Sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake, 1977), kadar hematokrit diukur menurut metode Anderson dan Siwicki (1995); kadar glukosa darah juga diamati dalam setiap perlakuan, mengikuti metoda Wedemeyer dan Yasutake (1977). Pengamatan dilakukan pada D0, D7, dan D Kematian kumulatif (KM) dihitung dengan menjumlahkan setiap ikan yang mati dari hari ke hari dengan rumus :

28 17 KM (Dn) = jumlah ikan yang mati pada Dn jumlah ikan diawal penelitian X 100

29 18 BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Aktivitas antibacterial dari tanaman rempah Hasil pengujian secara invitro terhadap 32 jenis tumbuhan rempah tradisional asal Kalimantan Timur yang telah dilakukan, di jabarkan dalam Gambar 5.1. Sebagai kontrol digunakan antibiotik tetrasiklin dan akuades. Tabel 5.1 Hasil uji aktivitas antibakterial ekstrak tanaman rempah terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Ekstrak Tanaman Rempah No Indonesia Latin Konsentrasi (ppm) 1 Tetrasiklin Phzer Cengkeh Syzygium aromaticum Daun Kunyit Curcuma domestica Terong Asam Solanum ferox Temu Giring Curcuma heyneana Kapulaga Amomum compactum Kemangi Ocimum sanctum Asam Jawa Tamarindus indica Temu Kunci Boesenbergia pandurata Lengkuas Alpinia galanga (L.) Sw Lempuyang Zingiber zerumbet Linn Lada Hitam Piper nigrum L Jintan Putih Cuminum cyminum Kecombrang Etlingera elatior Ketumbar Coriandrum sativum Kencur Kaempferia galanga L Jahe Merah Zingiber officinale var Biji Pala Myristica fragrans Bunga Sisir Illicium verum Kunyit Curcuma longa Merica Piper nigrum Kalabat Trigonella foenum-graecum Daun Jeruk Purut leaf Citrus hystrix Kayu Manis Cinnamomum verum Selasih Ocimum Sereh Cymbopogon citratus Adas Foeniculum vulgare Daun Pandan Pandanus amaryllifolius Jeruk Pecel Citrus hystrix Temu Ireng Curcuma aeruginosa Sereh Wangi Cymbopogon citrates Kluwek Artocarpus camansi Jinten Hitam Nigella sativa 546 Tanaman rempah yang digunakan semua berasal dari pasar tradisional di sekitar Kota Samarinda. Hasil pengujian menunjukkan hampir ke 32 ekstrak tanaman rempah

30 Diameter Zona Hambat (mm) 19 mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen baik A. hydrophila maupun Pseudomonas sp. secara terperinci dijabarkan pada Gambar 5.1 berikut Jenis Tanaman Rempah Pseudomonas sp. A. hydrophila Gambar 5.1 Aktivitas antibakterial tumbuhan rempah terhadap bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. yang menginfeksi ikan nila. Gambar 4.1 menunjukkan bahwa dari 32 jenis tumbuhan rempah yang diujikan 30 jenis memiliki kemampuan antibakterial terhadap bakteri A. hydrophila dan 29 jenis terhadap bakteri Pseudomonas sp. dengan tingkatan yang berbeda. Sepuluh jenis tumbuhan rempah yang memiliki aktivitas bakterial terhadap kedua bakteri berturutturut dimiliki oleh tanaman jinten hitam, bunga sisir, asam jawa, jeruk pecel, terong asam, temu kunci, cengkeh, kunyit, merica dan lempuyang. Tumbuhan temukunci sangat baik kandungan antibakterialnya terhadap A. hydrophila dan kurang baik terhadap Pseudomonas sp. Begitu pula dengan selasih memiliki bahan yang dapat mencegah pertumbuhan bakteri A. hydrophila namun tidak bagi Pseudomonas sp. Jenis tumbuhan bunga sisir, terong asam dan jeruk pecel memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan kedua jenis bakteri yang hampir sama. Kemampuan menghambat pertumbuhan kedua bakteri diduga karena ekstrak tanaman tersebut mengandung sterol, hydroxychavicol, eugenol dan phenolic compounds (Pelczar et al dan Pauli, 2002). Selain itu, bahan kimia lain seperti fatty acid (stearic acid dan palmitic acid) dan hydroxyl fatty acids esters (hydroxyl esters, palmitic dan myristic acids) juga diketahui memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri (Liao et al., 1999 dan Bhattacharya et al., 2007). Sedangkan menurut Hayes dan Berkovitz

31 20 (1979), bahan fatty acids dapat merusak dinding permukaan bakteri dan jamur khususnya yang tumbuh pada suhu rendah. Fatty acids dipercaya merusak stuktur dan fungsi dari dinding dan membrane sel bakteri (Hayes, 1979). Hasil penelitian yang dilakukan Haniffa dan Kavitha (2012) menunjukkan bahwa golongan Lamiaceae seperti C. aromaticus, Mentha arvensis dan Leucasaspera membentuk zona hambat berkisar mm, 9.67 mm, dan 9.33 mm sedangkan T. divaricata dari tanaman Apocynaceae menunjukkan zona hambat 7.33 mm, Catharanthus roseus 9.67 mm dan Rauvolfia tetraphylla 9.33 mm. Keseluruhan hasil uji menunjukkan bahwa C. aromaticus paling efektif untuk menghambat pertumbuhan A. hydrophila. Jika dibandingkan dengan ke 32 jenis ekstrak tanaman rempah terdapat 12 jenis tanaman rempah yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri A. hydrophila dengan zona hambat 10 mm antara lain cengkeh, terong asam, kapulaga, asam jawa, temu kunci, lempuyang, bunga sisir, merica, kalabat, jeruk pecel, temu ireng, dan jinten hitam. Sebanyak 6 jenis tanaman herbal yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas sp. yaitu terung asam, asam jawa, bunga sisir kunyit, jeruk pecel, dan jinten hitam. Pada umumnya, masing-masing ekstrak dari tanaman herbal ini menunjukkan aktivitas yang beragam hal ini disebabkan oleh kandungan bahan yang ada di dalam ekstrak. Begitu pula hasil penelitian yang dilakukan oleh Kolanjinathan et al. (2009) menunjukkan bahwa crude ekstrak dengan menggunakan etanol dari rumput laut menunjukkan aktivitas antibakterial yang berbeda terhadap bakteri Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis dan Bacillus cereus. Hasil pengujian Gracilaria edulis menunjukkan kemampuan menghambat pertumbuhan semua bakteri uji kecuali Bacillus cereus dan Enterobacter aerogenes. Sedangkan ekstrak dari Calorpha peltada terbukti mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram negative dan positif seperti Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Streptococcus faecalis. Ekstrak Hydroclothres sp. mampu menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa. Hasil pengujian aktivitas antibakterial tanaman tradisional memang sangat bervariasi tidak seperti penggunaan antibiotik, dimana hasilnya cenderung konstan pada sat pengujian dengan bakteri. Aktivitas antibakterial tertinggi terkandung dalam tanaman jinten hitam mencapai 20 mm terhadap bakteri Pseudomonas dan 23 mm terhadap

32 21 bakteri Aeromonas. Sama halnya dengan penelitian yang dilakukan oleh Babuselvam et al. (2012) hasil pengujian secara invitro ekstrak Rhizophora mucronata dan Salichornia brachiata menggunakan ethanol terhadap bakteri pathogen pada udang seperti Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio anginllarum dan Vibrio lohi dan bakteri pathogen pada ikan seperti Bacillus subtilis, Serratia sp., Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi dan Vibrio parahaemolyticus menunjukkan hasil yang berbeda. Ekstrak Salichornia brachiata memiliki aktivitas menghambat bakteri lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak Rhizophora mucronata, yaitu Vibrio alginolyticus (14 mm) dan Vibrio parahaemolyticus (15 mm). Keberagaman hasil pengujian aktivitas antibakterial ini sangat dipengaruhi oleh kandungan bahan dalam masing-masing tanaman. Namun secara keseluruhan hasil pengujian ini dapat ditindaklanjuti secara invitro. 5.2 Penentuan konsentrasi ekstrak untuk pencegahan dan pengobatan penyakit bakterial dari ekstrak Temu Kunci, Terung Asam dan Lempuyang a. Temu Kunci Hasil pengujian secara in vitro beberapa konsentrasi ekstrak temu kunci terhadap bakteri A. hydrophila menunjukkan hasil penghambatan yang beragam. Namun umumnya konsentrasi yang diujikan mampu menghambat pertumbuhan kedua bakteri. Berdasarkan uji in vitro dengan menggunakan uji hambat konsentrasi terbaik adalah 800 dan 900 ppm. Secara lebih jelas dapat dilihat pada Gambar 5.2 Berikut.

33 Diameter Zona Hambat (mm) Diameter Zona Hambat (mm) sensitif Intermediet Resisten K+ K Konsentrasi Ekstrak Jam ke- 18 Jam ke- 24 Jam ke- 36 Jam ke- 48 Jam ke- 60 Gambar 5.2 Aktivitas antibakterial tumbuhan rempah Temu kunci terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode daya hambat jam ke jam Konsentrasi 800 dan 900 ppm merupakan konsentrasi dengan zona hambat terluas berkisar mm yang digolongkan kelompok intermediet, konsentrasi ini juga berpeluang untuk digunakan sebagai bahan antibakterial dan imunostimulan pada ikan Konsentrasi Temu Kunci (ppm) konsentrasi bahan Gambar 5.3 Aktivitas antibakterial tumbuhan temu kunci terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode daya hambat pada waktu 24 jam

34 TPC (CFU/mL) 23 Gambar 5.2 dan 5.3 menunjukkan bahwa hingga jam ke 60 masa inkubasi, kemampuan antibakterial dari ekstrak temu kunci relatif tetap sehingga, hal ini juga menunjukkan bahwa kemampuan antibakterial dari ektrak temu kunci ini relatif kuat dan bertahan lama sehingga memungkinkan untuk digunakan dalam budidaya ikan air tawar. Selain menggunakan metode daya hambat, metode kultur bersama sel bakteri dengan ekstrak tanaman rempah juga dilakukan, tujuannya juga untuk mengetahui kemampuan antibakterial dari bahan, perbedaan metoda ini terkait dengan pengaplikasian pengobatan pada ikan sehingga perlu dilakukan pengujian dengan metode yang berbeda. Hasil aktivitas bakterial dengan metode kultur bersama sel dapat dilihat pada Gambar 5.4. Konsentrasi 600 ppm mempu menekan pertumbuhan bakteri paling tinggi, kemudian 900 dan 700 ppm sedangkan konsentrasi 800 ppm pengurangan jumlah bakteri yang tumbuh tidak signifikan dibandingkan dengan pertumbuhan bakteri normal. Metode daya hambat dan kultur bersama dilakukan untuk mengetahui sifat antibakterial terbaik dari ekstrak temu kunci dalam menghambat pertumbuhan bakteri A. hydropila Amoxilin NaCl Fisiologis Konsentrasi Temu Kunci (ppm) A. hydrophila Gambar 5.4 Aktivitas antibakterial tumbuhan temu kunci terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode kultur bersama masa inkubasi 24 jam.

35 Inhibition zone (mm) 24 Berdasarkan kedua metode yang digunakan pada uji invitro ekstrak temu kunci, maka konsentrasi 600 dan 900 ppm dilakukan pengujian lanjutan untuk mengetahui tingkat toksisitas dari ekstrak temu kunci. b. Terung Asam Pengujian ekstrak terung asam menunjukkan bahwa ekstrak ini lebih efektif menekan pertumbuhan bakteri Pseudomonas dibandingkan A. hydrophila. sehingga pengujian konsentrasi efektif lebih ditekankan pada bakteri Pseudomonas sp. sebagian besar konsentrasi yang diujikan zona hambat yang terbentuk termasuk dalam kelompok resisten, hanya 3 konsentrasi (800, 900 dan 6000 ppm) yang termasuk intermediet dan 4 konsentrasi (100, 200, 400, 700 ppm) termasuk sensitif seperti terlihat pada Gambar sensitif Resisten intermediet Jam ke- 18 Jam ke- 24 Jam ke- 36 Jam ke- 48 Jam ke Consentration of Solanum ferox (ppm) Gambar 5.5 Aktivitas antibakterial tumbuhan terung asam terhadap bakteri Pseudomonas sp. dengan metode daya hambat Konsentrasi 300, 400, 500 ppm mampu menekan pertumbuhan bakteri dengan metode kultur bersama terbaik dibandingkan dengan konsentrasi lain namun ppm juga mampu menekan pertumbuhan Pseudomonas sp. meski tidak sebaik konsentrasi sebelumnya (Gambar 5.5). Jika digabungkan dengan hasil metoda daya hambat, konsentrasi 400 dan 900 ppm dipilih untuk uji toksisitas pada ikan nila sebelum digunakan dalam uji pencegahan dan pengobatan infeksi bakteri Pseudomonas sp. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa beberapa genus dari solanum atau terung-terungan seperti S. torvum menunjukkan kemampuan antibakterial terhadap

36 kontrol Jumlah Bakteri 25 Bacillus subtilis, B. cereus, Pseudomonas aeruginosa dan S. aureus (Wiart et al. 2004), sedangkan S. nigrum mampu menekan pertumbuhan Salmonella typhi (Rani and Khullar 2004). Jenis S. trilobatum mampu mengurangi bakteri pada system aquaculture (Citarasu et al. 2003) dan S. incanum dapat menghambat pertumbuhan B. subtilis, B. cereus, B. pumilus, Enterobacter aerogenes, E. cloacae, Micrococcus kristinae dan S. aureus (Kambizi and Afolayan, 2001) Konsentrasi Ekstrak terung Asam Pseudomonas sp. Gambar 5.6 Aktivitas antibakterial tumbuhan terung asam terhadap bakteri Pseudomonas sp. dengan metode kultur bersama masa inkubasi 24 jam c. Lempuyang Lempuyang dipilih untuk uji lanjutan menentukan konsentrasi terbaik yang tidak bersifat toksik bagi ikan nila. Hasil pengujian beberapa konsentrasi ekstrak lempuyang dapat dilihat pada Gambar 5.7 dan 5.8, kemampuan antibakterial dari ekstrak lempuyang tidak sebaik ekstrak temu kunci terhadap A. hydrophila. Sebagian besar konsentrasi lempuyang yang digunakan (dari ppm) kemampuan antibakterialnya di golongkan dalam kelompok resisten atau kurang, hanya dua konsentrasi yang masuk dalam golongan intermediet yaitu konsentrasi 25, 3000, dan 8000 ppm masuk dalam golongan sensitive. Namun ada empat konsentrasi yang berpeluang untuk dapat digunakan sebagai bahan pencegahan dan pengobatan pada ikan nila yang terinfeksi A. hydrophila yaitu 25, 200, 2000, 3000 dan 8000 ppm. Selisih konsentrasi yang sangat tinggi ini menunjukkan bahwa ekstrak dari tanaman rempah masih sangat alami, berbeda dengan bahan antibakterial sintetis atau dari bahan kimia yang cenderung lebih konstan sifat bahannya.

37 Jumlah bakteri Diameter Zona Hambat (mm) sensitif Resisten intermediet A. hydrophila 24 jam A. hydrophila 48 jam Pseudomonas 24 jam Pseudomonas 48 0 Konsentrasi Ekstrak Lempuyang (ppm) Gambar 5.7 Aktivitas antibakterial tumbuhan lempuyang terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode daya hambat pada jam 24 dan Konsentrasi Lempuyang A. hydrophila Gambar 5.8 Aktivitas antibakterial tumbuhan lempuyang terhadap bakteri Aeromonas hydropila dengan metode kultur bersama masa inkubasi jam 24. Uji kultur bersama dilakukan untuk mengetahui kerja dari bahan aktif dalam ekstrak lempuyang, hasilnya tidak begitu berbeda jauh dengan pengujian menggunakan daya hambat, konsentrasi 200, 2000 dan 3000 juga mampu menekan pertumbuhan A. hydrophila cukup baik, sehingga konsentrasi 200 dan 2000 akan digunakan dalam uji toksisitas selanjutnya.

38 Isolasi bahan aktif yang terkandung dalam ekstrak Temu Kunci, Terung Asam dan Lempuyang Isolasi ini dilakukan hanya untuk mengetahui kandungan secara kualitatif. Pengujian dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui ada tidaknya beberapa bioaktif seperti Alkaloid, Flavonoid, Saponin, Tanin, Triterpenoid, Steroid dan Karbohidrat. Hasil analisis fitokimia pada beberapa ekstrak etanol tanaman rempah menunjukkan temu kunci mengandung alkaloid, flavonoid dan karbohidrat; terung asam mengandung alkaloid dan karbohidrat dan lempuyang mengandung bahan yang lebih banyak yaitu alkaloid, flavonoid, steroid dan karbohidrat. Secara terperinci dapat dilihat pada Tabel 5.2 berikut. Tabel 5.2 Hasil analisis fitokimia pada beberapa ektrak etanol tanaman rempah Sampel Alkaloid Flavonoid Saponin Tanin Triterpenoid Steroid Karbohidrat Temu kunci Terung Asam Lempuyang Keterangan : + = terdapat kandungan; - = tidak terdapat kandungan Beberapa tanaman obat atau tanaman herbal diketahui memiliki bahan bioaktif dari proses metabolism yang bersifat antimikroba yang dapat dimanfaatkan sebagai pharmaceuticals dan obat therapies (Hammer et al.,1999); Fabricant and Famsworth, 2001). Beberapa bahan aktif yang merupakan produk sekunder dari proses metabolism antara lain alkaloid, flavonoid, glycosides, phenol, saponin, dan steroids yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen Gram-positif dan Gram-negatif (Baser, 1993; Jouad et al., 2001; Anyanwu and Dawet (2005); Koche et al., 2010). Menurut Haniffa dan Kavitha (2012), hasil screening phytochemical beberapa tanaman yang termasuk golongan Lamiaceae mengandung alkaloids, reducing sugars, tannin dan phenolic. Komponen seperti steroid, flavonoids dan catechin menunjukkan nilai Relatif Inhibition Zone Diameter yang sedang sedangkan komponen gula dan anthraquinones tidak terditeksi dalam ekstrak. Umumnya bahan-alami yang dapat bersifat sebagai antibakterial mengandung bahan-bahan seperti alkaloids, steroids, mereduksi gula, catechins, anthraquinones,

39 Kematian kumulatif (%) 28 flavanoids, terpenoids, gula, phenols, saponins, tannins and aminoacids (Brinda et al., 1981). 5.4 Uji Toksisitas Konsentrasi ekstrak Temu kunci, Terung Asam dan Lempuyang pada ikan nila a. Kematian kumulatif ikan nila Seluruh konsentrasi ekstrak tanaman rempah relatif aman untuk digunakan dalam pengendalian patogen karena kematian ikan yang diinjeksi ekstrak kurang dari 50 %. Jumlah ikan yang mati pada uji toksisitas ekstrak tanaman rempah dapat dilihat pada gambar 4.9. Ikan yang diinjeksi dengan ekstrak temu kunci 900 ppm dan terung asam 400 ppm menyebabkan kematian lebih dari 40 % pada hari ke 5, sedangkan konsentrasi 200 dan 2000 ppm ekstrak lempuyang menyebabkan kematian 45% pada hari ke 5. Kematian ikan pada uji ini disebabkan oleh kandungan pada ekstrak ke 3 tanaman rempah yang mempengaruhi fisiologi dalam tubuh ikan. Walaupun ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang masih menyebabkan kematian namun kematiannya masih rendah jika dibandingkan dengan kematian yang disebabkan oleh bakteri A. hydrophila (60%) dan Pseudomonas sp. (80%) pada hari ke 5. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ketiga ekstrak rempah masih aman digunakan pada ikan nila Waktu Pengamatan (jam ke-) TK 600 ppm TK 900 ppm TA 400 ppm TA 900 ppm L 200 ppm L 2000 ppm kontrol PBS Gambar 5.9 Kematian kumulatif ikan nila pada uji toksisitas ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang.

40 29 Pengujian toksisitas ini menghasilkan 3 konsentrasi yang akan digunakan untuk uji lanjut imunostimulan dan antibakterial yaitu ekstrak temu kunci konsentrasi 600 ppm, terung asam 900 ppm dan lempuyang 200 ppm. b. Perubahan tingkah laku berenang dan nafsu makan ikan nila pada uji toksisitas ekstrak tanaman temu kunci, terung asam dan lempuyang Kandungan bahan aktif dalam ketiga ekstrak tanaman rempah yang memiliki kemampuan antibakterial dan meningkatkan sisitem imun ikan, juga menyebabkan perubahan pada metabolism dan fisiologis ikan nila. Pada Tabel 5.3 terlihat temu kunci 600 ppm berpengaruh terhadap tingkah laku renang dan nafsu makan, ikan berenang lemah mulai jam ke 6 pasca injeksi, namun gejala tersebut hilang pada jam 48. Nafsu makan ikan nila mengalami penurunan pada jam ke 24 namun pada jam ke 48 selanjutnya, kan mulai mau makan kembali. Morbiditas ikan nila yang diinjeksi dengan temu kunci konsentrasi 600 dan 900 menunjukkan perbedaan. Perubahan tingkah laku renang seperti ikan lemah dan agresif lebih sering terjadi penginjeksian 900 ppm, ini menunjukkan bahwa konsentrasi lebih rendah lebih aman bagi ikan. Konsentrasi 400 dan 900 ppm terung asam, sebenarnya tidak menyebabkan perbedaan pada tingkah laku renang ikan pasca injeksi, ini menandakan sebenarnya kedua konsentrasi relatif aman untuk digunakan pada ikan. Umumnya perubahan pada tingkah laku renang yang terjadi hanya berenang lemah dan agresif pada sebagian ikan, sama halnya pada penginjeksian ekstrak temu kunci. Sedangkan penurunan nafsu makan hanya terjadi pada penginjeksian 900 ppm pada jam ke 24, setelah itu aktivitas makan ikan kembali normal. Persentase ikan yang mengalami perubahan tingkah laku renang juga sangat kecil berkisar % dari total ikan uji, hal ini menunjukkan bahwa penggunakan ekstrak terung asam aman bagi ikan nila. Tabel 5.3 Perubahan tingkah laku berenang dan nafsu makan ikan nila pada uji coba toksisitas ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang Perlakuan KONTROL Parameter Waktu Pengamatan (jam ke-) Gasping Berenang Lemah Agresif

41 30 TEMU KUNCI 600 PPM TEMU KUNCI 900 PPM TERUNG ASAM 400 PPM TERUNG ASAM 900 PPM LEMPUYANG 200 PPM LEMPUYANG 2000 PPM Nafsu Makan Menurun Gasping Berenang Lemah Agresif Nafsu Makan Menurun Gasping Berenang Lemah Agresif Nafsu Makan Menurun Gasping Berenang Lemah Agresif Nafsu Makan Menurun Gasping Berenang Lemah Agresif Nafsu Makan Menurun Gasping Berenang Lemah Agresif Nafsu Makan Menurun Gasping Berenang Lemah Agresif Nafsu Makan Menurun c. Patologi anatomi organ luar ikan nila yang diinjeksi ekstrak rempah Sama halnya dengan perubahan tingkah laku berenang ikan pasca pengujian toksisitas dengan 3 bahan ekstrak, patologi anatomi ikan juga tidak tampak. Hanya perubahan berupa tubuh ikan nila yang menghitam 10 % hingga jam ke 72 pasca injeksi, ini menunjukkan bahawa konsentrasi 600 ppm ekstrak temu kunci lebih aman bagi ikan dibandingkan dengan konsentrasi 900 ppm. Begitu juga halnya dengan penginjeksian dengan ekstrak terung asam konsentrasi 400 dan 900 ppm tidak menyebabkan perubahan pada organ luar dan dalam ikan nila, gejala yang muncul hanya warna tubuh yang menghitam sekitar 10 % populasi ikan sampel hingga jam ke 96. Lain halnya dengan ekatrak lempuyang 2000 ppm yang menyebabkan ikan mengalami perubahan warna berupa menghitam hingga 50 % ikan sampel, meskipun lama kelamaan jumlahnya mengalami penurunan.

42 31 Tabel 5.4 Patologi anatomi ikan nila pada uji coba toksisitas ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang Perlakuan Parameter Waktu Pengamatan (Hari ke-) KONTROL Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI 600 ppm Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI 900 ppm Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM 400 ppm Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM 900 ppm Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG 200 ppm Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG 2000 ppm Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Hasil pengujian toksisitas menunjukkan bahwa konsentrasi rendah aman untuk digunakan pada ikan untuk masing-masing ekstrak tanaman. Post mortum ikan nila pada pengujian toksisitas tidak menunjukkan perubahan pada organ luar ikan, perubahan mencolok hanya warna tubuh yang menghitam mencapai 50 % dan menurun hingga hari ke 7 pasca penginjeksian. 5.5 Aktivitas imunostimulan dan antibakterial secara in vivo Pencegahan Infeksi Bakteri Aeromonas hydropila dan Pseudomonas sp. 1. Pencegahan Metoda Injeksi Tiga ekstrak tanaman rempah dilakukan pengujian kemampuan bahan aktif untuk mencegah infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas. Beberapa data yang diamati

43 Kematian Kumulatif (%) 32 antara lain kematian kumulatif dan persentasi morbiditas ikan nila yang diinfeksi oleh bakteri patogen. a. Kematian kumulatif Penggunaan ekstrak temu kunci pada pengujian pencegahan infeksi bakteri A. hydrophila melalui injeksi menunjukkan bahwa pemberian ekstrak temu kunci berdampak positif pada ikan nila yang terinfeksi bakteri. Jumlah kematian ikan yang diinfeksi dengan A. hydrophila mengalami penurunan dibandingkan dengan ikan yang tidak diberi dengan ekstrak temu kunci Waktu Pengamatan (hari ke-) Temu Kunci Terung Asam Lempuyang kontrol (PBS) A. hydrophila Pseudomonas Gambar 5.10 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Penginjeksian dengan temu kunci berhasil mencegah saat infeksi bakteri A. hydrophila pada ikan nila, tidak ditemukan ikan mengalami kematian hingga hari ke 14 pasca infeksi. Penggunaan terung asam juga mampu menekan jumlah kematian kumulatif ikan nila sebesar 10 % pasca infeksi bakteri Pseudomonas sp. Sedangkan penggunaan lempuyang hanya mampu mencegah infeksi sebesar 60 % pada ikan nila. Hal ini menunjukkan bahwa temu kunci dan terung asam memiliki kandungan bahan yang dapat meningkatkan kerja sisitem imun dan mampu menekan pertumbuhan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. yang menginfeksi ikan nila. kemampuan mencegah infeksi kedua bakteri tersebut disebabkan karena adanya kandungan antibakterial seperti alkanoid, flavonoid dan karbohidrat namun kandungan flavonoid diduga merupakan

44 33 bahan yang dominan terkandung dalam ekstrak temu kunci dan terung asam, sedangkan ektrak lempuyang tidak mengandung bahan ini dan hasilnya menunjukkan tingkat protuksinya rendah. Flavonoid merupakan senyawa pereduksi yang baik, menghambat banyak reaksi oksidasi, baik secara enzim maupun non enzim. Flavonoid bertindak sebagai penampung yang baik radikal hidroksi dan superoksida dengan demikian melindungi lipid membran terhadap reaksi yang merusak. Aktivitas antioksidannya dapat menjelaskan mengapa flavonoid tertentu merupakan komponen aktif tumbuhan yang digunakan secara tradisional untuk mengobati gangguan fungsi hati (Robinson, 1995). Penelitian skrining fitokimia daun akway (Drimys becariana, Gibbs) menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tannin, dan steroid dengan jumlah sangat relatif banyak (Parubak dan Murtihapsari, 2005). b. Perubahan tingkah laku berenang dan nafsu makan Tabel perubahan tingkah laku ikan yang diinjeksi dengan ekstrak rempah, dan pada hari ke 7 diuji tantang dengan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. hasil pengujian pada data morbiditas menunjukkan bahwa pemberian ektrak temu kunci, terung asam dan lempuyang mampu menekan perubahan pada tingkah laku ikan nila pasca terinfeksi bakteri A. hydrophila maupun Pseudomonas sp. tidak seperti ikan nila yang terinfeksi kedua bakteri, ikan yang diberikan ektrak ketiga tanaman rempah tersebut hanya mengalami gasping pada 10% ikan sampel pada hari ke 7 dan hilang pada hari berikutnya. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan imunostimulan pada ektrak temu kunci dan lempuyang mampu meningkatkan system imun ikan pada saat terinfeksi A. hydrophila sedangkan ekstrak terung asam, mampu meningkatkan kerja system imun ikan sehingga mampu mencegah infeksi bakteri Pseudomonas sp.

45 34 Tabel 5.5 Perubahan tingkah laku berenang ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pencegahan Perubahan Tingkah laku KONTROL infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Waktu Pengamatan (hari ke-) gasping berenang lemah agresif TEMU KUNCI gasping berenang lemah agresif TERUNG ASAM gasping berenang lemah agresif LEMPUYANG gasping berenang lemah agresif A. hydrophila gasping berenang lemah agresif Pseudomonas sp. gasping berenang lemah agresif c. Patologi anatomi organ luar Perubahan pada organ luar ikan yang tampak pasca terinfeksi dengan A.hydrophila dan Pseudomonas sp. menurut Hardi dan Pebrianto (2012), ikan nila mengalami gejala eksoptalmia, permukaan tubuh menghitam, dan luka pada organ terinfeksi. Pada awal infeksi ikan tampak berenang lemah, nafsu makan berkurang dan terkadang ikan berenang gasping dan whirling. Pemberian temu kunci mampu mengurangi gejala yang muncul pasca infeksi bakteri A.hydrophila hal ini nampak tidak ada gejala yang muncul hingga hari ke 7. Begitu pula penggunaan terung asam juga

46 35 mampu mengurangi gejala yang muncul pasca infeksi Pseudomonas sp. gejala tidak muncul. Tabel 5.6 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pencegahan infeksi Parameter A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Waktu pengamatan (Hari ke-) KONTROL sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia TEMU KUNCI sirip/sisik gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia TERUNG ASAM sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia LEMPUYANG sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia A. hydrophila sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia Pseudomonas sp. sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia Pencegahan Metode Pakan a. Kematian Kumulatif Pencegahan infeksi bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. menggunakan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang menunjukkan hasil yang cukup baik.

47 Kematian Kumulatif (%) Waktu Pengamatan (Hari ke-) Temu Kunci Terung Asam Lempuyang PBS 0.45% A. hydrophila Pseudomonas Gambar 5.11 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melaui metode melalui pakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Pencegahan dengan ketiga ekstrak melalui metode pakan menunjukkan hasil yang cukup baik untuk ketiga ekstrak. Jumlah kematian ikan yang diberi ekstrak temu kunci tidak ada pasca uji tantang dengan A. hydrophila. ini menunjukkan bahwa ektrak temu kunci sangat baik untuk digunakan sebagai bahan untuk mencegah infeksi bakteri. Bahan antibakterial yang terkandung di dalam ekstrak temu kunci seperti alkaloid, flavonoid dan karbohidrat dapat menekan pertumbuhan bakteri dalam tubuh inang. Ekstrak terung asam dan lempuyang juga cukup baik digunakan dalam uji pencegahan ini melihat jumlah kematian pasca uji tantang dengan A. hydrophila pada ekstrak lempuyang dan Pseudomonas sp. pada uji terung asam hanya 20 %. Perbedaan ini disebabkan oleh sifat ekstrak dan kandungan steroid yang terdapat dalam kedua ekstrak tersebut. b. Perubahan tingkah laku Penggunaan ketiga ekstrak dilihat dari tingkah laku berenang dan nafsu makan cukup beragam namun perubahan gejala hanya sekitar % ikan sampel, hal ini menunjukkan ketiga ekstrak aman untuk digunakan juga mampu mengurangi gejala atau abnormalitas ikan pasca diinfeksi dengan bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp.

48 37 ikan yang diinfeksi dengan bakteri A. hydrophila mengalami berenang gasping, lemah atau agresif hingga hari ke 14, sedangkan ikan yang diberi temu kunci dan lempuyang ditemukan mengalami gasping dan berenang lemah hanya hingga hari ke 10 dan 11 ini menunjukkan bahwa ektrak temu kunci dan lempuyang mampu mengurangi abnormalitas berenang ikan yang terinfeksi. Begitu pula penggunaan terung asam, mampu mengurangi gejala abnormalitas berenang ikan pasca diinjeksi dengan bakteri Pseudomonas sp. Tabel 5.7 Perubahan tingkah laku berenang ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode pakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan KONTROL Waktu Pengamatan (Hari ke) Gasping Berenang Lemah Agresif TEMU KUNCI Gasping Berenang Lemah Agresif TERUNG ASAM Gasping Berenang Lemah Agresif LEMPUYANG Gasping Berenang Lemah Agresif A. hydrophila gasping berenang lemah agresif Pseudomonas sp. gasping berenang lemah agresif

49 38 c. Patologi anatomi organ luar Ikan yang diinfeksi dengan bakteri A. hydrophila akan tampak mengalami eksoptalmia, sirip gripis dan tubuh menghitam mulai jam ke 24 pasca infeksi namun dengan pemberian temu kunci gejala tersebut tidak muncul pasca uji tantang. Sedangkan dengan pemberian lempuyang, eksoptalmia muncul hanya 10 % dari ikan populasi hanya hingga hari ke 3 pasca uji tantang. Ini menunjukkan bahwa kedua ekstrak mampu mengurangi gejala Aeromonasis pada ikan yang terinfeksi. Begitu pula dengan pemberian terung asam, gejala seperti sirip gripis dan tubuh menghitam berkurang pasca ikan diinjeksi dengan Pseudomonas sp. Tabel 5.8 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan KONTROL Waktu Pengamatan (Hari ke-) Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia A. hydrophila sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia Pseudomonas sp. sirip gripis tubuh menghitam gejala eksoptalmia

50 Kematian Kumulatif (%) Pencegahan Metode Perendaman a. Kematian kumulatif Perendaman menggunakan ektrak terung asam cukup efektif mengurangi kematian ikan nila yang diinjeksi dengan Pseudomonas sp. jika tanpa menggunakan ekstrak kematiannya mencapai 80 %, maka dengan pemberian terung asam kematian yang terjadi hanya 20 %. Namun tidak halnya dengan penggunaan temu kunci dan lempuyang melalui perendaman, kematian masih mencapai 40 dan 70 % pasca uji tantang dengan A. hydrophila. Hal ini mungkin disebabkan oleh kemampuan penyerapan atau masuknya bahan ekstrak ke dalam tubuh ikan sehingga proses penghambatan bakteri kurang efektif Waktu Pengamatan (Hari ke-) Temu kunci terung asam lempuyang PBS 0.45% Aeromonas Pseudomonas Gambar 5.12 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. b. Perubahan tingkah laku Jika dilihat dari perubahan tingkah laku berenang ikan, penggunaan ketiga ekstrak ini mampu menekan gejala yang muncul pasca diinjeksi dengan kedua bakteri. Gejala seperti gasping, ikan berenang lemah atau beberapa ikan agresif yang muncul tidak sebanyak pada saat ikan terinfeksis tanpa diberi ekstrak.

51 40 Tabel 5.9 Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan KONTROL Waktu Pengamatan (Hari ke-) Gasping Berenang Lemah Agresif TEMU KUNCI Gasping Berenang Lemah Agresif TERUNG ASAM Gasping Berenang Lemah Agresif LEMPUYANG Gasping Berenang Lemah Agresif A. hydrophila Gasping Berenang Lemah Agresif Pseudomonas sp. Gasping Berenang Lemah Agresif c. Patologi anatomi organ luar Patologi anatomi ikan yang diinjeksi dengankedua bakteri dan diberi ekstrak menunjukkan adanya pengurangan gejala jika dibandingkan dengan tanpa diberi ekstrak. Ini menunjukkan bahwa ekstrak mampu memberikan proteksi terhadap infeksi bakteri.

52 41 Tabel 5.10 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan Waktu Pengamatan (Hari Ke-) KONTROL Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG Sirip Gripis Tubung Menghitam Gejala Eksoptalmia A. hydrophila Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Pseudomonas sp. Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia

53 Kematian Kumulatif (%) Uji Pengobatan Infeksi Bakteri Aeromonas hydropila dan Pseudomonas sp. 1 Pengobatan Metode Injeksi a. Kematian kumulatif Pemberian ketiga ekstrak untuk pengobatan cukup efektif, dilihat dari jumlah kematian yang berkisar 0 20 % pasca uji tantang denga bakteri A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Pemberian Lempuyang bahkan menekan kematian hingga 0 % pada infeksi A. hydrophila dan temu kunci hanya 10 % jumlah kematiannya. Ini menunjukkan bahwa kedua ekstrak selaian mampu menekan pertumbuhan bakteri yang ada dalam tubuh ikan, juga mampu membatu ikan melakukan penyebuhan pasca infeksi Waktu Pengamatan (hari ke-) Temu Kunci Terung Asam Lempuyang PBS 0.45% A. hydrophila Pseudomonas Gambar 5.13 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode injeksi untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. b. Perubahan tingkah laku Penggunanaan Ektrak temu kunci, terung asam dan lempuyang untuk pengobatan menunjukkan hasil yang baik. Awal penginfeksian dengan bakteri A. hydrophila ikan nila mengalami gasping, beberapa ikan berenang lemah mencapai 30 % sampel ikan, namun setelah diberikan temu kunci, gejala tersebut hilang pada hari ke 3 pasca pengobatan. Ini menunjukkan bahwa kedua ekstrak efektif membantu penyembuhan pasca infeksi. Begitu juga penggunaan terung asam, mampu mengurangi

54 43 perubahan tingkah laku berenang ikan nila pasca diinfeksi dengan bakteri Pseudomonas sp. Metode injeksi cukup efektif untuk mengobati ikan yang sakit pasca diinjeksi dengan kedua bakteri. Hal ini disebabkan karena bahan aktif yang terkandung di dalam ekstrak masuk secara menyeluruh ke dalam tubuh ikan melalui darah sehingga selain mampu mengurangi jumlah bakteri yang ada di dalam tubuh ikan, juga mampu membantu recoveri tubuh yang terinfeksi luka. Tabel 5.11 Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode injeksi untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Parameter Waktu Pengamatan (Hari ke-) KONTROL Gasping Berenang Lemah Agresif TEMU KUNCI Gasping Berenang Lemah Agresif TERUNG ASAM Gasping Berenang Lemah Agresif LEMPUYANG Gasping Berenang Lemah Agresif A. hydrophila Gasping Berenang Lemah Agresif Pseudomonas sp. Gasping Berenang Lemah Agresif

55 44 c. Patologi anatomi organ luar Ikan nila yang diinjeksi dengan bakteri A. hydrophila tampak mengalami sirip gripis, tubuh menghitam dan eksoptalmia baik ringan maupun berat, namun dengan pemberian temu kunci, sirip yang tadinya mengalami gripis perlahan mengalami penyembuhan dengan adanya tanda-tanda kembali pada kondisi normal pada hari ke 2 pasca pengobatan. Begitu pula dengan warna tubuh ikan nila mulai kembali cerah tidak menghitam pada hari yang sama. Ini menunjukkan bahwa bahan dalam temu kunci mampu membantu penyembuhan bekas infeksi. Hal yang sama terjadi pada pemberian ekstrak lempuyang, meskipun proses penyembuhan tidak secepat pada pemberian temu kunci, namun ikan sudah kembali normal pada hari ke 6 pasca pengobatan. Tabel 5.12 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode injeksi untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan Waktu Pengamatan KONTROL Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia A. hydrophila Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Pseudomonas sp. Sirip Gripis

56 Kematian Kumulatif (%) 45 Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Pengobatan Melalui Pakan a. Kematian kumulatif Waktu Pengamatan (hari ke-) Temu Kunci Terung Asam Lempuyang PBS 0.45% A. hydrophila Pseudomonas Gambar 5.14 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Dilihat dari data kematian ikan nila, baik temu kunci dan lempuyang mampu menekan jumlah kematian pasca infeksi A. hydrophila dan pengobatan bahkan kematian setelah pengobatan sudah tidak ditemukan, sedangkan pemberian lempuyang masih ditemukan sebanyak 10 % ikan sampel yang mengalami kematian pasca pengobatan. Secara keseluruhan metode pemberian melalui pakan juga efektif digunakan untuk pengobatan pasca infeksi. b. Perubahan tingkah laku Gejala spesifik perubahan tingkah laku ikan yang terinfeksi A. hydrophila juga mengalami pengurangan pasca pengobatan dengan temu kunci, namun proses penyembuhannya tidak secepat pada metode injeksi. Ini menunjukkan bahwa, bahan aktif di dalam ekstrak membutuhkan waktu yang lama untuk dapat masuk ke dalam aliran darah dan membantu proses penyembuhan. Penggunaan lempuyang untuk

57 46 pengobatan melalui pakan juga menunjukkan proses yang cukup lambat. Bahkan ikan masih ditemukan berenang lemah (10 %) dan 10 % ikan sampel berenang agresif pada hari ke 14 atau hari ke 7 pasca pengobatan. Hal yang sama terjadi pada penggunaan terung asam pasca infeksi dengan Pseudomonas sp. sebanyak 10 % ikan masih ditemukan berenang agresif. Tabel 5.13 Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan KONTROL Waktu Pengamatan Gasping Berenang Lemah Agresif TEMU KUNCI Gasping Berenang Lemah Agresif TERUNG ASAM Gasping Berenang Lemah Agresif LEMPUYANG Gasping Berenang Lemah Agresif A. hydrophila Gasping Berenang Lemah Agresif Pseudomonas sp. Gasping Berenang Lemah Agresif c. Patologi anatomi organ luar Perubahan pada organ luar ikan pasca pengobatan melalui metode pakan menunjukkan hal yang sama dengan perubahan tingkah laku berenang. Proses

58 47 pengobatan terjadi cukup lambat, proses penyembuhan pada sirip yang gripis dan eksoptalmia baru mulai terjadi pada hari ke 5 pasca pengobatan pada infeksi A. hydrophila sedangkan tubuh ikan menghitam sudah tidah ditemukan pada hari ke 6 pasca pengobatan. Penggunaan terung asam pada infeksi Pseudomonas sp. juga terjadi cukup lambat. Ikan yang menghitam mengalami penyembuhan pada hari ke 7 pasca pengobatan dan sirip ikan yang gripis terjadi pada hari ke 5. Namun secara keseluruhan ikan yang diberi esktrak membantu penyembuhan pasca luka. Tabel 5.14 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui pakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan KONTROL Waktu Pengamatan (Hari ke) Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia A. hydrophila Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Pseudomonas sp. Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia

59 Kematian kumulatif (%) Pengobatan Melalui Perendaman a. Kematian kumulatif Waktu Pengamtan (hari ke) Temu Kunci Terung Asam Lempuyang PBS 0.45% A. hydrophila Pseudomonas Gambar 5.15 Kematian kumulatif ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode perendaman untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Pengobatan dengan menggunakan ekstrak lempuyang cukup efektif menekan kematian ikan nil yang diinfeksi A. hydrophila. Sedangkan temu kunci belum efektif mengobati pasca infeksi sehingga kematian yang ditemukan masih tinggi mencapai 60 %. Penggunaan terung asam mampu menekan kematian pasca infeksi Pseudomonas sp. karena tidak ditemukan lagi kematian setelah dilakukan pengobatan. b. Perubahan tingkah laku Beberapa perubahan tingkah laku berenang lemah seperti berenang lemah sudah tidak ditemukan pada hari ke 3 pasca pengobatan dengan temu kunci, sedangkan ikan agresif masih ditemukan hingga hari ke 7. Metode perendaman ini menunjukkan hasil yang bervariasi. Proses pengobatan dengan metode perendaman ini terlihat lebih baik jika dilihat dari pengurangan perubahan tingkah laku berenang, dibandingkan dengan metode pakan, meskipun tidak sebaik melalui injeksi.

60 49 Tabel 5.15 Perubahan tingkah laku ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui perendaman untuk pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Perlakuan Waktu Pengamatan (Hari Ke-) KONTROL Gasping Berenang Lemah Agresif TEMU KUNCI Gasping Berenang Lemah Agresif TERUNG ASAM Gasping Berenang Lemah Agresif LEMPUYANG Gasping Berenang Lemah Agresif A. hydrophila Gasping Berenang Lemah Agresif Pseudomonas sp. Gasping Berenang Lemah Agresif c. Patologi anatomi organ luar Patologi anatomi organ luar ikan yang diinfeksi kedua bakteri tampak mengalami penyembuhan pasca pengobatan dengan ketiga ekstrak, meskipun prosesnya berjalan lambat namun gejala seperti gejala eksoptalmia sdh tidak ditemukan pada hari ke 3 pasca pengobatan dengan temu kunci. Sedangkan sirip ikan yang gripis masih ditemukan hingga hari terakhir pengamatan.

61 50 Tabel 5.16 Patologi anatomi organ luar ikan nila pada uji pemanfaatan Ekstrak Temu Kunci, Terung asam dan Lempuyang melalui metode melalui perendaman untuk Perlakuan KONTROL pengobatan infeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. Waktu Pengamatan (Hari Ke-) Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TEMU KUNCI Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia TERUNG ASAM Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia LEMPUYANG Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia A. hydrophila Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Pseudomonas sp. Sirip Gripis Tubuh Menghitam Gejala Eksoptalmia Penggunaan ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang secara keseluruhan dapat dimanfaatkan dalam upaya pencegahan dan pengobatan ikan nila yang terinfeksi A. hydrophila dan Pseudomonas sp. ketiga metode yang digunakan memiliki efektifitas yang berbeda, perbedaan itu disebabkan karena kandungan bahan aktif yang terkandung di dalam ketiga ekstrak.

62 51 BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA Rencana penelitian yang akan dilakukan pada tahu kedua atau tahun anggaran 2016/2017 dijabarkan pada Gambar 6.1 berikut : PUNGUJIAN PENYIMPANAN/PENGEMASAN BAHAN AKTIF DAN EFEKTIVITAS PROTEKSI TAHUN KEDUA UJI KEMAMPUAN MUNOSTIMULAN DAN ANTIBAKTERIAL Secara In Vivo (Melalui pakan dan perendaman) di Lapangan (dalam KJA) PRODUK IMUNOSTIMULAN DAN ANTIBAKTERIAL UNTUK MENCEGAH INFEKSI bakteri Aeromonas sp dan Pseudomonas sp Gambar 6.1 Alur pelaksanaan penelitian Effektivitas Antibakterial Beberapa Tanaman Rempah Asal Kalimantan Timur Penelitian tahun kedua ini merupakan penelitian lapangan percobaan di beberapa lokasi budidaya ikan nila di Kabupaten Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur. Dengan tujuan untuk menguji tingkat protektif dan kemampuan imunostimulan dari bahan ekstrak agar dapat menjadi produk yang siap dilepas kepasaran. Penelitian ini terdiri dari 3 tahapan utama yaitu : Tahap 1 : Penyimpanan bahan aktif dalam botol sampel yang disimpan dalam lemari pendingin selama 1 dan 3 bulan. Tahap 2 : Pengujian kemampuan peningkatan daya tahan tubuh ikan nila melalui metode pakan dan perendaman. Tahap 3 : Tersedianya produk imunostimulan dan antibacterial untuk pencegahan infeksi bakteri. Uji Percobaan dilakukan menggunakan karamba jarring apung yang berisi benih ikan nila. percobaan yang dilakukan hanya upaya pencegahan dengan memberikan ketiga ekstrak tanaman rempah, temu kunci, terung asam dan lempuyang menggunakan metode pakan dan perendaman. Metode ini dipilih berdasarkan penelitian yang telah dilakukan secara laboratorium. Berdasarkan hasil dari penelitian yang telah dilakukan secara laboratorium, ekstrak temu kunci dan lempuyang efektif diberikan melalui metode pakan, sedangkan terung asam efektif melalui metode perendaman. Konsentrasi bahan ekstrak dari ketiga

63 52 bahan tersebut berbeda, disesuaikan dengan dosis efektif hasil penelitian secara laboratorium, yaitu ekstrak temu kunci, terung asam dan lempuyang secara berturutturut adalah sebagai berikut : 600, 900 dan 200 ppm. Pencampuran dengan pakandilakukan dengan cara mencampur 2% ekstrak yang telah ditambahkan 2 % kuning telur sebagai perekat ke dalam pakan komersil. Setelah tercampur, pakan dikeringanginkan terlebih dahulu selama kurang lebih 5-10 menit selanjutnya pakan siap diberikan pada ikan. Pemberian pakan plus ekstrak diberikan kurang lebih 5 7 hari secara ad libitum. Cara ini efektif membantu meningkatkan daya tahan tubuh ikan nila sampai masa produksi 3 bulan. Metode perendaman dilakukan dengan merendam benih ikan dalam larutan ekstrak selama 30 menit sebelum ikan dipindahkan ke dalam karamba jarring apung budidaya. Sama halnya dengan metode pakan, metode perendaman ini dapat meningkatkan ketahanan ikan nila hingga panen (3 bulan). Akhir penelitihan tahun kedua ini diharapkan dapat dihasilkan produk yang dapat dilepas dipasarkan dan digunakan oleh pembudidaya ikan nila khususnya, budidaya ikan air tawar pada umumnya. Keunggulan produk ini diharapkan murah, mudah diperoleh dan memiliki tingkat proteksi yang tinggi.

64 53 BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN 7.1. Kesimpulan Beberapa kesimpulan yang dapat ditarik dari hasil penelitian adalah sebagai berikut : 1. Ketiga puluh dua ekstrak tanaman rempah yang diuji, diketahui 30 ekstrak memiliki antibakterial terhadap A. hydrophila dan 29 ekstrak terhadap Pseudomonas sp. 2. Konsentrasi temu kunci (Boesenbergia pandurata) 600 dan 900 ppm dan lempuyang (Zingiber zerumbet) 200 dan 2000 ppm merupakan konsentrasi antibakterial terbaik terhadap bakteri A. hydrophila sedangkan ekstrak terung asam (Solanum ferox) 400 dan 900 ppm pada bakteri Pseudomonas sp. 3. Ekstrak temu kunci mengandung alkaloid, flavonoid dan karbohidrat; terung asam mengandung alkaloid dan karbohidrat dan lempuyang mengandung bahan yang lebih banyak yaitu alkaloid, flavonoid, steroid dan karbohidrat. 4. Konsentrasi temu kunci (Boesenbergia pandurata) 600 ppm, lempuyang (Zingiber zerumbet) 200 ppm dan terung asam (Solanum ferox) 900 ppm merupakan konsentrasi antibakterial terbaik yang aman digunakan pada ikan untuk penelitian selanjutnya. 5. Untuk pencegahan, dosis 600 ppm temu kunci efektif digunakan untuk pencegahan infeksi A. hydrophila dengan menggunakan metoda melalui pakan, ekstrak terung asam 900 ppm efektif mencegah Pseudomonas sp. melalui perendaman dan lempuyang 200 ppm efektif untuk mencegah infeksi bakteri A. hydrophila melalui pakan. 6. Untuk Pengobatan, dosis 600 ppm temu kunci efektif digunakan untuk pengobatan infeksi A. hydrophila melalui injeksi, ekstrak terung asam 900 ppm efektif mengobati infeksi Pseudomonas sp. melalui pakan dan perendaman dan lempuyang 200 ppm efektif untuk mengobati infeksi bakteri A. hydrophila melalui ketiga metode injeksi, pakan dan perendaman Saran Saran yang dapat diberikan untuk keberhasilan produk ini adalah dilakukan penelitian mengenai pencampuran ekstrak seperti temu kunci plus terung asam, dan terung asam dan lempuyang agar memiliki tingkat proteksi terhadap bakteri A.

65 54 hydrophila dan Pseudomonas sp. karena dari uji sebelumnya masing-masing ekstrak memiliki tingkat proteksi yang spesifik. Selanjutnya bahan imunostimulan juga berpeluang digunakan sebagai adjuvant yang dapat dicampur dengan vaksin, sehingga tingkat proteksi yang lebih baik. 7.3 Ucapan Terima Kasih Penelitian ini dapat berlangsung karena adanya dukungan dana dari Departemen Pendidikan dan Riset Teknologi Republik Indonesia melalui riset Kopetensi Nasional Stategis Nasional Tahun Anggaran 2015/2016. (248/UN 17.16/PG/2015 tanggal 2 Maret 2015) Serta dukungan dari Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman dan Dinas Kelautan dan Perikanan Kabupaten Kutai Kartanegara atas pendampingan selama penelitian.

66 55 DAFTAR PUSTAKA Aknin M, Dayan TLA, Rudi A, Kashman Y, Gaydou EM Hydroquinone Antioxidant from the Indian Ocean Tunicate Aplidium savignyi. Journal Agriculture Food Chemistri. 47 : Anyanwu, G.I. and Dawet, A. (2005). Pharmacological and phytochemical screening of Hyptis suaveolens Poit (Lamiaceae) for bioactivity in rodents, Nig J Bot, Arung E.T., Irawan Wijaya Kusuma, Enih Rosamah, Wiwin Suwinarti, Harlinda Kuspradini, Jaehong Han Antioxidant Effect of Some Medicinal Plants from East Kalimantan, Indonesia. Journal of Oriental Medicine Industry,1,1: Baser, K.H.C. (1993). Essential Oils of Anatolian Lamiaceae: A Profile, Acta Hort, Bhattacharya,S. Mula, S.Gamre, J.P.Kamat, S.K. Bandyopadhyay, S. Chattopadhyay, Inhibitory property of Piper betel extract against photosensitization-induced damages to lipids and proteins. Food Chem. 100 : Brinda, P., Sasikala, B. and Purushothaman, K.K. (1981). Pharmacognostic studies on Merugan kilzhangu, BMEBR, 3(1) 84 Casiano H., Choresca Jr., Dennis K., Gomez, Jee-Eun Han, Sang-Phil Shin, Ji-Hyung Kim, Jin-Woo Jun, Se-Chang Park Molecular detection of Aeromonas hydrophila isolated from albino catfish (Clarias sp.) reared in an indoor commercial aquarium. Korean J Vet Res. 50(4):331~333 Chan, C.H. Hsiao Contact leukomelanosis induced by the leaves of Piper betle L. (Piperaceae): A clinicaland histopathologic survey. J. Am. Acad. Dermatol, 40 : Citarasu T, Venkatramalingam K, Babu Mm, Sekar Rrj And Petermarian M Influence of the antibakterial herbs, Solanum trilobatum, Andrographis paniculata and Psoralea corylifolia on the survival, growth and bakterial load of Penaeus monodon post larvae. Aquaculture Int 11: Esteve, T.H. Birkbeck Secretion of haemolysins and proteases by Aeromonas hydrophila EO63: separation and characterization of the serine protease (caseinase) and the metalloprotease (elastase). Journal of Applied Microbiology. 96: Fabricant, D.S. and Famsworth, N.R. (2001). The value of plant used in traditional medicine for drug discovery, Environ Health perspect, Hammer, K.A., Carson, C.F. and Riley, T.V. (1999). Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts, J Appl Microbiol, Haniffa, M.A and Kavitha, K Antibakterial activity of medicinal herbs against the fish pathogen Aeromonas hydrophila. Journal of Agricultural Technology. 8(1): Hardi EH, Pebrianto CA Isolasi dan Uji Postulat Koch Aeromonas sp dan Pseudomonas sp pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) di Sentra Budidaya Loa

67 56 Kulu Kabupaten Kutai Kartanegara. Jurnal Ilmu Perikanan Tropis. Vol.16, 2: Hardi EH, Sukenda, Harris E, dan Lusiastuti AM Karakteristik dan Patogenitas Streptococcus agalactiae tipe β-hemolitik dan Non-hemolitik pada Ikan Nila. Jurnal Veteriner. Vol. 12, 2: Hayes, M.L., B.K.Berkovitz The reduction of fissure caries in Wistar rats by a soluble salt of nonanoinic acid,arch. Oral Biol.24 : Jouad, H., Dubois, M.A., Lyoussi, B. and Eddouks, M. (2001). Effects of the flavonoids extracted from Spergularia purpurea Pers on arterial blood pressure and renal function in normal and hypertensive rats, J Ethnopharmacol, 76(2) 159. Julia W. Pridgeon, Phillip H., Klesius, Lin Song, Dunhua Zhang, Kyoko Kojima, James A. Mobley Identification, virulence, and mass spectrometry of toxic ECP fractions of West Alabama isolates of Aeromonas hydrophila obtained from a 2010 disease outbreak. Veterinary Microbiology. 164 : Kambizi L And Afolayan AJ An ethnobotanical study of plants used for the treatment of sexually transmitted diseases (njovhera) in Guruve District, Zimbabwe. J Ethnopharmacol 77: 5 9 Koche, D., Shirsat, R., Imran, S. and Bhadange, D.G. (2010). Phytochemical screening of eight traditionally used ethnomedicinal plants from Akola district India, Int J Pharm Bio Sci, 1(4) 253. Leungt, K.Y., R.M.W Stevenson Characteristics and Distribution of Extracellular Proteases from Aevomonas hydrophila. Journal of General Microbiology, 134: M.A.S. McMahon The expression of proteinases and haemolysins by Aeromonas hydrophila under modified atmospheres. Journal of Applied Microbiology, 89: Martı nez-rosales, C. Susana Castro-Sowinski Antarctic bakterial isolates that produce cold-active extracellular proteases at low temperature but are active and stable at high temperature. Polar Research, 30, 7123 Pauli, A Antimicrobial properties of catechol derivatives 3rd World Congress on Allelopathy, Tsukuba, Japan, pp Pelczar, M.J., ECS Chan, NR Kreig, Microbiology Vol Tata. McGrow HillPublication, NewDelhi, India. Pramono, E The Commercial Use of Traditional Knowledge and Medicinal Plants in Indonesia. Scientific Paper on Multi-Stakeholder Dialoque on Trade, Intellectual Property and Biological Resources in Asia, BRAC Centre for Development Management, Rajendrapur, Bangladesh, April pp Rani P and Khullar N Antimicrobial evaluation of some medicinal plants for their anti-enteric potential against multi-drug resistant Salmonella typhi. Phytother Res 18: Rattanachuay, P., Duangporn Kantachote, Manee Tantirungkij, Teruhiko Nitoda, Hiroshi Kanzaki Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular

68 57 compounds from a proteolytic bakterium Pseudomonas sp. W3. Electronic Journal of Biotechnology. 13:1 Soo-Jin Cho, Jong-Ho Park, Seong Joo Park, Jong-Soon Lim, Eung Ho Kim, Yeon-Jae Cho, and Kwang-Soo Shin Purification and Characterization of Extracellular Temperature-Stable Serine Protease from Aeromonas hydrophila. The Journal of Microbiology, September : Vasantha, S.T., Abhilash Thankappan Subramanian Optimization of cultural conditions for the production of an extra-cellular protease by Pseudomonas species Vasantha and Subramanian. International Current Pharmaceutical Journal, 2(1): 1-6. Wiart C, Mogana S, Khalifah S, Mahan M, Ismail S, Buckle M, Narayana Ak And Sulaiman M Antimicrobial screening of plants used for traditional medicine in the state of Perak, Peninsular Malaysia. Fitoterapia 75: Zacaria, J., A.P.L. Delamare, S.O.P. Costa, S. Echeverrigaray Diversity of extracellular proteases among Aeromonas determined by zymogram analysis. Journal of Applied Microbiology 109: Parubak, A. S. & Murtihapsari, 2005, Isolasi dan Identifikasi Alkaloid dari Kulit Kayu Akway(Drimys beccariana.gibbs)asal Manokwari, Laporan Penelitian, (Proseding Seminar Nasional SPMIPA 2006) Undip Semarang.

69 58 LAMPIRAN I INSTRUMEN Anggaran Biaya Anggaran biaya untuk mendukung penelitian ini terdiri dari gaji dan upah, bahan penunjang kerja di Laboratorium, perjalanan ke lokasi hutan tanaman rempah dan lainlain yang dijabarkan pada Tabel berikut. Tabel 1. Format ringkasan anggaran biaya penelitian strategi nasional yang diajukan setiap tahun No Jenis pengeluaran Tahun I (Rp) 1 Gaji dan Upah 22,800, Bahan perekat/penunjang 26,600,000 3 Perjalanan 15,200,000 4 Lain-lain (administrasi, publikasi, 11,400,000 lokakarya/seminar, laporan dan lain-lain TOTAL Jadwal Penelitian Tabel 2. Format Jadwal Kegiatan Tahun 1. No Jenis Kegiatan BULAN KE Mempersiapkan izin penelitian 2 Pengambilan sampel ikan 3 Postulat Koch bakteri uji 4 Pengambilan tanaman tanaman rempah 5 Ekstraksi bahan antibakterial 6 Uji antibakterial secara invitro 7 Uji toksisitas bahan ekstrak 8 pengujian pencegahan infeksi bakteri 9 pengujian pengobatan bakteri 10 Analisis data 11 Penulisan laporan akhir 12 Laporan akhir

70 59 Rincian Penggunaan Dana penelitian Tabel 3. Rincian penggunaan anggaran penelitian tahun pertama No URAIAN UNIT SATUAN HARGA/UNIT JUMLAH A. GAJI DAN UPAH Ketua 1 paket 8,000,000 8,000,000 Anggota 1 1 paket 7,400,000 7,400,000 Anggota 2 1 paket 7,400,000 7,400,000 B. BAHAN HABIS PAKAI akuades 20 L 10, ,000 Alkohol 70% 5 1 L 50, ,000 Alkohol 95% 3 1 L 80, ,000 baskom plastik 10 buah 15, ,000 Chloramphenicol 1 pak 500, ,000 Ciprofloxacin 1 pak 500, ,000 Cover glass 10 kotak 30, ,000 Furazolidone 1 pak 500, ,000 Gentamycin 1 pak 500, ,000 Ikan Sampel 3000 ekor 1,500 4,500,000 Jarum ose 3 buah 30,000 90,000 kapas 1 pak 80,000 80,000 kertas label 2 pak 50, ,000 L-glass 1 buah 50,000 50,000 larutan hayem 1 500, ,000 larutan turks 1 500, ,000 Media KF Streptococcus gr 3,150,000 3,150,000 media motil 1 pak 525, ,500 media OF 1 pak 700, ,000 Media TSA gr 950, ,000 Media TSB gr 929, ,500 metanol 1 liter 1,500,000 1,500,000 Nalidixic acid 1 pak 500, ,000 Nitrofuratoin 1 pak 500, ,000 Norfloxacin 1 pak 500, ,000 Objek Glass 10 kotak 30, ,000 Oxyteracycline 1 pak 500, ,000 pakan ikan 15 kg 10, ,000 parafilm 1 pak 500, ,000 pipet tetes 2 pak 250, ,000 plastik sampel 2 pak 80, ,000 serok ikan besar 15 buah 10, ,000 serok ikan kecil 10 buah 10, ,000 Spuit 1 ml 10 kotak 100,000 1,000,000 22,800,000.0

71 60 Tabung Hematokrit 5 kotak 55, ,000 Tabung mikropipet 1 kotak 750, ,000 tabung sampel 4 pak 750,000 3,000,000 tanaman rempah 15 kg 50, ,000 tisue 5 pak 50, ,000 C. PERJALANAN pendaftaran was 1 Paket 6,565,000 6,565,000 pendaftaran ICAI 1 Paket 1,800,000 1,800,000 pemesanan proceeding 1 Paket 400, ,000 publikasi fee procedia 1 Paket 750, ,000 perjalanan seminar ICAI 1 Paket 5,685,000 5,685,000 26,600,000 15,200,000 D. PENGELUARAN LAIN-LAIN konsumsi rapat 3 paket 300, ,000 cetak poster 1 paket 900, ,000 pencetakan buku ajar 1 paket 600, ,000 modul sosialisasi 1 paket 1,250,000 1,250,000 cetak laporan 6 paket 250,000 1,500,000 pembuatan liflet hasil penelitian 1000 lembar 1,250 1,250,000 biaya ekstraksi tanaman rempah 1 paket 3,000,000 3,000,000 publish jurnal 2 paket 1,000,000 2,000,000 11,400,000 TOTAL 76,000,000

72 61 II PERSONALIA TENAGA PENELITI BESERTA A. Identitas Diri BIODATA KETUA PENELITI 1. Nama Lengkap (dengan gelar) : Dr. Esti Handayani Hardi, S.Pi, M.Si 2. Jabatan : Lektor 3. Jabatan Struktural : - 4. NIP : NIDN : Tempat dan tanggal lahir : Lampung, 4 Januari Alamat rumah : Jl. Padat Karya Perumahan Tirta persada No. 23 Kel. Sempaja Utara Kec. Samarinda Utara Kota Samarinda Kalimantan timur 8. Telepon/Fax : - 9. HP : Alamat Kantor : Jl. Gunung Tabur Kampus Gunung Kelua Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Mulawarman Samarinda, Kalimantan timur 11. Alamat estie_hardie@yahoo.com 12 Lulusan yang telah dihasilkan : S-1= 6 orang; S-2= 2 Orang; S-3= 0 Orang 13 Mata Kuliah yang diampu Penyakit Biota Akuatik Parasit Biota Akuatik Manajemen Kesehatan akuakultur Metode Ilmiah Bioteknologi akuakultur B. Riwayat Pendidikan S-1 S-2 S-3 Universitas Universitas Diponegoro Institut Pertanian Institut Pertanian Bogor Bogor Bidang ilmu Budidaya perairan Ilmu Perairan Ilmu Akuakultur Tahun Masuk-Lulus C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir Hasil Penelitian Sumber Tahun Kandidat Vaksin Potensial Streptococcus agalactiae Untuk Mandiri 2010 Pencegahan Penyakit Streptococcosis Pada Ikan Nila (Oreochromis Niloticus) Evaluasi Faktor Virulensi Bakteri Aeromonas dan Pseudomonas yang Menginfeksi Ikan Nila di Sentra Budidaya Ikan Nila Loa Kulu Hibah fundamental Kabupaten Kutaikartanegara dikti Aquatic Biota and Environmental Ponds Health 2012 TOTAL 2012 Aquatic Biota and Environmental Ponds Health 2013 TOTAL 2013 Substansi Aktif Antibakteri dan Sitotoksik dari Tumbuhan Rempah dan Aromatik di Kalimantan Timur Hibah bersaing dikti 2013 Penggunaan Vaksin Monavalen Pseudomonas sp. untuk Penanggulangan Balitbangda 2014

73 62 Penyakit Bakterial pada Budidaya Ikan Nila Di Loa Kulu Kabupaten Kutaikartanegara Pemprov Kaltim D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir No Tahun Judul Kegiatan Sumber Diagnosa dini Penyakit Streptococcosis pada budidaya ikan Mandiri nila di Kutai Kartanegara Kalimantan Timur Peran Modal Sosial dalam Rangka Pengelolaan Tambak Ramah Lingkungan di Delta Mahakam UPTD Dinas Perikanan dan Kelautan Kec. Anggana Manajemen Budidaya Udang Sehat dan Minim Patogen Di Kecamatan Marang Kayu Kabupaten Kutai Kartanegara DKP Kutai Kartanegara Manajemen Budidaya Udang Sehat dan Minim Patogen Di DKP Kutai Kecamatan Muara Badak Kabupaten Kutai Kartanegara Manajemen Budidaya Udang Sehat dan Minim Patogen Di Kecamatan Anggana Kabupaten Kutai Kartanegara 6 Kartanegara DKP Kutai Kartanegara E. Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal alam 5 Tahun Terakhir Hasil Penerbitan Karakteristik dan patogenisitas Streptococcus agalactiae tipe β-hemolitik dan non-hemolitik pada ikan nila (Oreochromis niloticus) Toksisitas Produk Ekstrasellular (ECP) Streptococcus agalactiae pada ikan nila (Oreochromis niloticus) Potensi Uji Postulat Koch Terhadap Tingkat Keganasan Streptococcus agalactiae Gambaran Darah Sebagai Indikator Kesehatan Pada Ikan Air Tawar. Prospect of A Combination Therapy of Herbs and Probiotic as An Alternative Control Bakterial Diseases In Freshwater Aquaculture. July Kajian Variabilitas Streptococcus agalactiae Pada Ikan, Sapi dan Manusia. Bakteria Levels Difference Pathogenecity Aeromonas sp and Pseudomonas sp. On Tilapia Isolasi dan Uji Postulat Koch Aeromonas sp. dan Pseudomonas sp. pada Ikan Nila (Oreocromis niloticus) di Sentra Budidaya Loa Kulu Kabupaten Tahun Publikasi Veterinar 12:2, Edisi Juni, 2011 Jurnal Natur Indonesia 13:3 Juni 2011 Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010 Buku 2: Prosiding Masyarakat Ikhtiyologi Indonesia, Cibinong 8-9 Juni 2010 Proceeding of International Congress 38th working group of Indonesian Medicinal Plant, Surabaya Prosiding Seminar Nasional Tahunan VII Hasil Penelitian Perikanan dan Kelautan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 24 Juli Proceeding The International Symposium On Human Development And Sustainable Utilization On Natural Reseources In Asian Countries (ISBN : ) Balikpapan, 9-12 Juli 2012 Jurnal Ilmu Perikanan Tropis 2012, Vol.16. 2:35-39

74 63 Kutai Kartanegara Efek Infeksi Bakteri Streptococcus agalactiae terhadap Kadar Hematokrit dan Glukosa Darah Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Patogenisitas Aeromonas hydrophila Melalui Jalur Infeksi yang Berbeda pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) di Loa Kulu Kutai Kartanegara Kalimantan Timur Kandidat Vaksin Potensial Streptococcus agalactiae untuk Pencegahan Penyakit Streptococcosis pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Efek Penginjeksiann ICP dan ECP bakteri Pseudomonas sp. terhadap Gambaran Darah ikan Nila (Oreochromis niloticus) Toksisitas Produk Ekstraselular dan Intrasellular Bakteri Pseudomonas sp. pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Jurnal Ilmu Perikanan Tropis Vol.15. 1:29-34 Juaral Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala Vol.8. No. I Maret 20l4 Jurnal Veteriner, Volume 14 No 4. Desember 2013 : Jurnal Ilmu Perikanan Tropis, Vol 19 No 1, Oktober 2013 :24-30 Jurnal Veteriner, Vol.15 No. 3 : September 2014 F. Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir No Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar 1 Seminar Nasional Perikanan Ix 2 Simposium Nasional Bioteknologi Akuakultur Tahun Seminar Nasional Pusat Kajian Lingkungan Pesisir 4 Seminar Teknologi Fakultas Teknik IX 5 The international Symposium on Human Development and Sustainable Utilization on Natural reseources in asian countries 6 Seminar Nasional Tahunan Hasil Penelitian Perikanan Dan Kelautan X 7 Konferensi Akuakultur Indonesia (Kai) 2013 Judul Artikel Ilmiah Efek Infeksi Bakteri Streptococcus agalactiae Terhadap Kadar Hematokrit Dan Glukosa Darah Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Efikasi Sel Utuh Dan Produk Ekstraselular Bakteri Streptococcus agalactiae Tipe Β- Hemolitik Dan Non-Hemolitik Sebagai Vaksin Untuk Pengendalian Streptococcosis Pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Toksisitas Produk Ekstrasellular (ECP) Streptococcus agalactiae Tipe Non-Hemolitik Pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Efikasi Vaksinasi Bakteri Streptococcus agalactiae dengan menggunakan teknik pembuatan vaksin yang berbeda Bakteria Levels Difference Patogenecity Aeromonas sp and Pseudomonas sp on Nila Tilapia Toksisitas ECP dan ICP Aeromonas hydrophila pada Ikan Nila (Oreochromis Niloticus) Asal Loa Kulu Kutaikartanegara, Kalimantan Timur Histopatologi Ikan Nila (Oreochromis Niloticus) Asal Loa Kulu Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur yang Diinjeksi Produk Waktu dan Tempat Yogyakarta, 2010 Bogor, 2010 Samarinda, 2011 Samarinda, 2012 Balikpapan, 9-12 Juli 2012 Jogjakarta, 31 Agustus 2013 Solo, 3-4 September 2013

75 64 Ekstraselular (ECP) dan Intrasellular (ICP) Bakteri Aeromonas hydrophila Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima sanksi. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan penelitian Strategis Nasional Tahun Samarinda, November 2015 Pengusul, (Dr. Esti Handayani Hardi, S.Pi, M.Si)

76 65 A. Identitas Diri BIODATA ANGGOTA PENELITI 1 1. Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. Wiwin Suwinarti, S.Hut., MP. 2. Jenis Kelamin P 3. Jabatan Fungsional Lektor Kepala 4. NIP/NIK/Identitas lainnya NIDN Tempat dan tanggal lahir Cianjur, 15 Februari w_suwinarti@yahoo.com 8. No Telepon/HP (0541) / Alamat Kantor Jl. Ki Hajar Dewantara Gunung Kelua Samarinda, Kalimantan timur 10. No Telepon/Faks (0541) Lulusan yang telah dihasilkan S-1 = 27 orang; S-2 = 3 orang; S-3 = 0 orang 12. Mata Kuliah yang diampu 1. Kimia Dasar 2. Pengolahan Kimiawi Hasil Hutan 3. Teknologi Pulp dan Kertas 4. Pengendalian Pencemaran 5. Bioenergi dan Konversi Biomassa 6. Teknologi Polimer 6. Serat Alam dan Pemanfaatannya B. Riwayat Pendidikan S-1 S-2 S-3 Nama Perguruan Tinggi Universitas Mulawarman, Indonesia Universitas Mulawarman, Indonesia Universitas Ehime, Jepang Bidang Ilmu Tek.Hasil Hutan Tek.Hasil Applied Bioresorces Hutan Science Tahun Masuk-Lulus Judul Skripsi/Tesis/ Disertasi Nama Pembimbing/ Promotor Analisis Kandungan Zat Ekstraktif dan Lignin pada Kayu Kelapa (Cocos nucifera Linn.) Prof. Dr. Sipon Muladi Proses Pulping Campuran dari Beberapa Jenis Kayu HTI Prof. Dr. Sipon Muladi High Quality Bast Fiber Production with Ammonium Oxalate from Kenaf (Hibiscus cannabinus L.) Prof.Dr. Kazuhiko Sameshima C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir No. Tahun Judul Penelitian Pendanaan Sumber* Jumlah (Juta Rp) PemanfaatanTanaman Kenaf (Hibiscus cannabinus L.) sebagai Bahan Baku Serat APBD

77 66 Berkualitas Tinggi Pengembangan Produk Herbal dari Tumbuhan Masisin (Rhodomyrtus tomentosa) Dengan Potensi Antioksidan dan Antidiabetes Isolation of Active Compound From Selected Traditional Dayaks Herbal Medicines for Cosmetic in East Kalimantan Pemanfaatan Limbah Padat Kelapa Sawit dan Gliserol dari Industri Biodiesel sebagai Bahan Baku dalam Pembuatan Pellet Energi Berkalori Tinggi (Bio-Coal) Pemanfaatan Limbah Padat Kelapa Sawit dan Gliserol dari Industri Biodiesel sebagai Bahan Baku dalam Pembuatan Pellet Energi Berkalori Tinggi (Bio-Coal) Pemanfaatan Limbah Kulit Kayu Akasia sebagai Bahan Baku Pellet Energi, Bahan Bakar Alternatif Pengganti Batu Bara Fruit Biodiversity from Woody Plant in East Kalimantan for Cosmetical Material Kajian Penggunaan Perlakuan Awal pada Proses Produksi Bioetanol dari Beberapa Jenis Kayu Cepat Tumbuh Pemanfaatan Biomassa Kayu Macaranga Sebagai Bahan Baku Bioetanol APBD Kerjasama Luar Negeri dan Publikasi INternasional Penelitian Unggulan PT Penelitian Unggulan PT Penelitian Unggulan PT MP3EI Hibah Bersaing Penelitian Unggulan PT D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat dalam 5 Tahun Terakhir No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Pendanaan Masyarakat Sumber* Jumlah (Juta Rp) E. Publikasi Artikel Ilmiah Dalam Jurnal alam 5 Tahun Terakhir No. Judul Artikel Ilmiah Nama Jurnal 1. Antioxidant Effect of Some Medicinal Plants from East Kalimantan, Indonesia. 2. A Study on the Production Method of Kenaf High Fiber Strength Journal of Oriental Medicine Industry Wood Research Journal Volume/ Nomor/Tahun Vol. 1/ No. 1/ 2009 Vol. 2/ No. 2/ 2011 F. Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation) dalam 5 Tahun Terakhir No Nama Pertemuan Ilmiah / Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Seminar Tempat 1. Seminar Nasional Aktivitas Senyawa Antioksidan dari 2008,

78 67 Masyarakat Peneliti Kayu Indonesia IX 2. Seminar Nasional Masyarakat Peneliti Kayu Indonesia X 3. Seminar Nasional Forum Teknologi Hasil Hutan 4. Seminar Nasional Masyarakat Peneliti Kayu Indonesia XI 7. The 1 st International Symposium of Indonesian Wood Research Society 8. The 4 th Korea-Thailand- Indonesia Joint Symposium on Biomass Utilization and Renewable Energy 9. Seminar Nasional Masyarakat Peneliti Kayu Indonesia XIV 10. The 4 th International Symposium of Indonesian Wood Research Society 11. The 7 th Korea-Thailand- Indonesia Joint Symposium on Biomass Utilization and Renewable Energy Tumbuhan Bawang Tiwai (Eleutherine americana L. Merr.) Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan dari Fraksi Etil Asetat pada Tumbuhan Bawang Tiwai (Eleutherine americana L. Merr.) Kajian Kualitas Pulp Akasia (Acacia mangium Willd.) yang Dihasilkan dari Proses Pulping Acetosolv Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Daun Tahongai (Kleinhovia Hospita Linn.) A Study on the Production Method of Kenaf High Fiber Strength The Production Of Biogas From Tropical Water Plant Biomass, Water Hyacinth (Eichornia Crassipes Solms) Potensi Daun Tumbuhan Masisin (Rhodomyrtus tomentosa (ait) hassk) sebagai Antibakteri Alami Study of Acetosolv Pulping as an Environmentally Friendly Process Alkaline Pretreatment Of Eucalyptus pellita F. Muell as Raw Material For Bioethanol Production Palangkaraya 2008, Palangkaraya 2009, Bogor 2009, Bogor 2009, Bogor 2010, Bangkok 2011, Yogyakarta 2011, Yogyakarta 2013, Bangkok G. Karya Buku dalam 5 Tahun Terakhir No Judul Tahun Jumlah Halaman Penerbit 1 H. Perolehan HKI dalam 5 10 Tahun Terakhir No. Tahun Judul Jenis Nomor P/ID 1 I. Pengalaman Merumuskan Kebijakan Publik/Rekayasa Sosial Lainnya dalam 5 Tahun Terakhir No. Tahun Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Lainnya yang Telah Diterapkan Tempat Penerapan Respon

79 68 Masyarakat 1. J. Penghargaan dalam 10 tahun Terakhir (dari pemerintah, asosiasi atau institusi lainnya) No Penghargaan Institusi Pemberi Penghargaan Tahun 1 Satya Lencana Karya Setia (10 tahun) Presiden Republik Indonesia Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima sanksi. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan penelitian Strategis Nasional Tahun Samarinda, November 2015 Pengusul, (Dr. Wiwin Suwinarti, S.Hut., MP.)

80 69 A. Identitas Diri BIODATA ANGGOTA PENELITI 2 1. Nama : Agustina, S.Pi, M.Si 2. NIDN : Tmp/Tanggal lahir : Muara Muntai/4 Agustus Alamat rumah : Jl. P. Suryanata Perum. BPBI Blok A4-A5 RT. 12 No No telepon/hp : agustinabdp95@hotmail.com 7. Pangkat/gol : Penata/IIIc 8. Jabatan fungsional : Lektor 9. TMT : 1 Desember 2003 (SK CPNS) 10. Gelar akademik : S.Pi., M.Si. 11. Bidang Keahlian : Budidaya Perairan (Mikrobiologi Perairan) B. Pendidikan Universitas/Institut dan Lokasi Gelar Tahun Selesai Bidang Studi Universitas Mulawarman S.Pi Budidaya Perairan Program Pasca Sarjana Program Studi Ilmu Perairan (AIR) Institut Pertanian Bogor M.Si 2006 Kesehatan Ikan 1.2. Pengalaman Kerja dalam Penelitian : Hasil Penelitian Profil Dasar dan Beban Sedimen Sungai Mahakam Bagian Hulu dan Tengah Studi Mikroba pada Ikan Nila yang Dibudidayakan dalam Karamba Di Desa Loa Kulu Kecamatan Loa Kulu Kabupaten Kutai Kartanegara Studi Kondisi Kesehatan Ikan Nila yang Dibudidayakan di Karamba pada Kolam Bekas Galian Tambang Batu Bara Di Kecamatan Tenggarong Seberang Kabupaten Kutai Kartanegara APBD Provinsi Kalimantan Timur Dinas Kelautan dan Perikanan Kab. Kutai Kartanegara Tahun Publikasi Ilmiah Hasil Penerbitan Seleksi Bakteri Perairan Penghambat Pertumbuhan Bakteri Aeromonas hydrophila dari Kolam Pemeliharaan Ikan Mas Cyprinus carpio L. Seleksi Bakteri Usus Ikan Mas Cyprinus carpio L. yang Mampu Menghambat Bakteri Aeromonas hydrophila Identifikasi Jamur dan Bakteri pada Ikan Nila (Oreochromis niloticus) yang Dibudidayakan dalam Karamba di Desa Loa Kulu Kota Kecamatan Loa Kulu Kabupaten Kutai Kartanegara Isolasi Bakteri pada Ikan Nila yang Dibudidayakan Tahun Publikasi Jurnal Ilmu Perikanan Tropis (Journal of the Tropical Fisheries Science) FPIK Universitas Mulawarman, vol 11 No. 1 Oktober 2009 Jurnal Badan Penelitian dan Pengembangan Daerah Gerbang Etam. Kab. Kutai Kartanegara Kalimantan Timur, Vol. 4 No. 1 Tahun 2010 Jurnal Ilmu-Ilmu Perikanan Umum, estuari dan Kelautan AQUARINE. Jurusan MSP FPIK Unmul. Vol. 4 no. 1, Maret 2013, hal : Disampaikan pada Semnaskan UGM Agustus

81 70 di Karamba Jaring Apung Di Kolam Bekas Galian Batubara Kecamatan Tenggarong Seberang Kabupaten Kutai Kartanegara Histopatologi Ikan Nila Asal Loa Kulu Kutai Kartanegara Kalimantan Timur yang Diinjeksi Produk Ekstraseluler dan Intraseluler Bakteri Aeromonas hydrophila 2013 Prosiding Konfrensi Akuakultur Indonesia 2013, 3-4 September 2013 Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima sanksi. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan penelitian Strategis Nasional Tahun Samarinda, November 2015 Agustina, S.Pi, M.Si NIP

82 71 SUSUNAN ORGANISASI TIM PENELITI DAN PEMBAGIAN TUGAS No Nama/NIDN Instansi Asal Bidang Ilmu Alokasi Waktu (jam/ minggu) 1 Esti Handayani Hardi/ Wiwin Suwinarti/ Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan 3 Agustina/ Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Kesehatan Biota Akuatik Uraian Tugas 10 Melakukan semua kegiatan penelitian yang tercantum dalam metode. Mengevaluasi rencana, pelaksanaan dan hasil dari penelitian Fakultas Kehutanan Mikrobiologi 8 Membantu melakukan ekstraksi tanaman rempah dan analisis hasil ekstrak yang tercantum dalam metode. Menyelesaikan masalah. Mikrobiologi Perairan 8 Membantu melakukan semua kegiatan penelitian yang tercantum dalam metode. Menyelesaikan masalah penggandaan laporan, administrasi

83 72 III PUBLIKASI 1. P u b l i k a s i p a d a J o u r n a l A A C L B i o f l u x ( Q 4 ) Country: Romania Subject Area: Agricultural and Biological Sciences Environmental Science Publisher: Bioflux Publishing House. Publication type: Journals. ISSN: , Antibacterial activities of some borneo traditional plant extracts to against Aeromonas hydrophila and Pseudomonas sp. bacteria pathogen Esti Handayani Hardi 1, Irawan Wijaya Kusuma 2, Wiwin Suwinarti 2, Agustina 1, Ibnu Abbas 1 1 Lab. Microbiology, Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries and Marine Science, Mulawarman University, East Kalimantan Indonesia. 2 Lab. of Forest Product Chemistry, Faculty of Forestry, Mulawarman University, East Kalimantan, Indonesia. Corresponding author : E. H. Hardi, estieriyadi2011@gmail.com Abstract. East Kalimantan region is largely tropical rain forest overgrown by traditional herbal plants that have been widely used, but the use in the fisheries has not been done. This study was conducted to determine the antibacterial ability from some plant extracts to against the bacteria Aeromonas hydrophilla and Pseudomonas sp. bacteria pathogen on nila tilapia. A total of 32 types of herbal plants extracted ethanol, tested in vitro test inhibition against both pathogens. The concentration of the extract used range of 500 ppm with inhibition test which measures the inhibition zone formed after 24 and 48 h incubation at 30 C. The results showed that 30 kinds of herbal plants extracts have antibacterial activity to A. hydrophila and 29 extract against Pseudomonas sp. The highest activity was shown by the black cumin extract against both bacteria. Most of extract have inhibitory zone more than 10 mm against A. hydrophila (12 extract) and 6 extract against Pseudomonas sp. Key Words : Aeromonas hydrophilla, Antibacterial and Pseudomonas sp. Introduction. Aeromonas hydrophila and Pseudomonas sp. infection were factor caused of death in the aquaculture of tilapia, carp and catfish in the area of fish aquaculture. Tilapia infected with both bacteria have experienced the death of up to 80% within a period of 5-7 days post-infection. Both of these bacteria infect simultaneously, but clinical symptoms in fish infected by A. hydrophila and Pseudomonas sp. separately differently. Aeromonas infection caused the fish bleed until the wound on the outside of infected organs such as the surface of the body, skin and operculum. While, Pseudomonas sp. caused fish internal organ looks pale, watery and the gall bladder rupture (Hardi 2012). Both bacterial infections found in almost all freshwater fish farming areas ranging from Sumatra, Java, Kalimantan and Sulawesi. However, the characteristics of Aeromonas bacteria that infect in those area are different, this causes the pathogenicity of bacteria is different in fish.

84 73 Aeromonas infection prevention using group Lamiaceae herbs and Apocynaceae (Haniffa & Kavitha, 2012) showed varying results. Utilization of dichloromethane, methanol and extract from 26 species of seaweed as an antibacterial compound for five types of fish pathogens (Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas anguilliseptica, Vibrio anguillarum, Yersinia ruckeri). Dichloromethane extract material from Asparagopsis armata, Ceramium rubrum, Drachiella minuta, Falkenbergia rufolanosa, Gracilaria cornea and Halopitys incurvus showed antibacterial activity against to V. anguillarum and P. anguilliseptica. Prevention of bacterial infection using traditional plant extracts more desirable addition to the ingredients are easily available, can also be antibacterial as well as an imunostimulant to improve the health of the fish. This study was conducted to test the antibacterial activity of 32 traditional plant extracts to against A. hydrophila and Pseudomonas sp. bacteria that infect tilapia in Kutai Kartanegara, East Kalimantan. Material and Method. The study was conducted in January - December 2014 at the Environment Microbiology Laboratory, Faculty of Fisheries and Marine Science, Mulawarman University, East Kalimantan Indonesia. Collection and identification of herbal plant. Traditional herb plant samples were collected from some traditional markets in Samarinda. Selection of plant species collected mainly based on information ethnobotany by local communities, especially the types of plants that are used as a spice and aromatic in cooking, food preservatives, fragrances and other information. Confirmation of the identity of the type carried out by the staff of the Faculty of Forestry identifier types and confirmed at the Research Institute Germination, Samboja. The extraction process is done in Wood Chemistry Laboratory, Department of Forest Products Technology, Faculty of Forestry, Mulawarman University. Extraction Herb Plant. Samples of plants were used in this studied is made of powder simplicia using a dry blender. After that, the samples were dried in a room with a constant temperature. After drying the sample ready for extraction. Extraction is done by soaking 100 g sample with ethanol in the Erlenmeyer. The next sample was homogenized using a shaker for 48 hours at room temperature. After the extract solution is filtered and concentrated by using a rotary vacuum evaporator to obtain a crude extract.

85 74 Bacteria Test. The bacteria used in this research are A. hydrophila and Pseudomonas sp. obtained from tilapia are ill and died in Loa Kulu Kutai, East Kalimantan. The bacteria postulate Koch test before used, to maintain the level of pathogenicity of bacteria in the host. The postulate Koch test was done to determine the impact of both bacterial infections in tilapia, and attempt to believe that the changes that occur both bacteria in behavior and external organs and anatomical pathology organ in tilapia caused by these bacteria. The fish used in these experiments amounted to 6 animals for each bacterium. Fish injected with each bacterium with a density CFU ml -1, 0.2 ml fish -1. Some parameters were observed, they are changes in swimming patterns, anatomy organ organs and fish mortality. Observation of the parameters is done every 24 hours post-injection up to 120 hours. Antibacterial activity test. Antibacterial test done by in vitro inhibition with Disc Diffusion Assay (Dulger & Gonuz 2004). Extract concentrations used ranged from ppm, and then tested extracts inhibitory to bacteria A. hydrophila and Pseudomonas sp. with the following procedures: a) The concentration of each extract dropped on Widman sterile paper as much as 25 μm, then placed on a media that already contain bacteria cultures on TSA medium (Triptic Soy Agar), subsequent bacterial culture containing paper disc that has been incubated for 24 hours at a temperature of 30 o C. b) Observations inhibitor zone on hours by measuring the diameter of clear zone formed. Determination test of an effective dose of herbal plant extracts. In vitro testing in the determination of an effective dose of the extract as an antibacterial substance to against A. hydrophila and Pseudomonas sp. are they have a inhibit zone more than 12 mm. The three of them are Boesenbergia pandurata, Solanum ferox, and Zingiber zerumbet, the test using Diffusion Assay method (Dulger & Gonuz 2004) with the concentration of the extract used range between ppm of Boesenbergia pandurata, Solanum ferox and ppm of Zingiber zerumbet. The third extract selected because they are traditional herb that have a high antibacterial activity, the cheap price, easy to colect and can be developed as a commercial antibacterial medicine for fish aquaculture.

86 Tradicional Plant Extract 75 Result and Discussion. Results of in vitro testing against 32 extract of herb plant origin from East Kalimantan that has been done, in elaborate in Figure 1. Nigella sativa Artocarpus camansi Cymbopogon citrates Curcuma aeruginosa Citrus hystrix Pandanus amaryllifolius Foeniculum vulgare Cymbopogon citrates Ocimum Cinnamomum verum leaf Citrus hystrix Trigonella foenum-graecum Piper nigrum Curcuma longa Illicium verum Myristica fragrans Zingiber officinale var Kaempferia galanga L Coriandrum sativum Etlingera elatior Cuminum cyminum Piper nigrum L. Zingiber zerumbet Linn Alpinia galanga (L.) Sw. Boesenbergia pandurata Tamarindus indica Ocimum sanctum Amomum compactum Curcuma heyneana Solanum ferox Curcuma domestica Syzygium aromaticum aquades Tetrasiklin Inhibition Zone (mm) Aeromonas hydrophila Pseudomonas sp. Figure 1. Antibacterial activity of traditional herb against Aeromonas hydrophila and Pseudomonas sp.

87 76 Figure 1 shows that from 32 extract, 30 extract have antibacterial activity to A. hydrophila bacterium and 29 extract against Pseudomonas sp. with different levels. Ten extract of herb plant against both bacterial, they are Nigella sativa, Illicium verum, Tamarindus indica, Citrus hystrix, Solanum ferox, Boesenbergia pandurata, Syzygium aromaticum, Curcuma longa, Piper nigrum and Zingiber zerumbet. Boesenbergia pandurata has best antibacterial activity against A.hydrophila and less against Pseudomonas sp. Similarly, the Ocimum can prevent the growth of A. hydrophila bacteria, but either Pseudomonas sp. Illicium verum, Solanum ferox and leaf Citrus have compound to inhibit both bacteria. Conducted Haniffa & Kavitha (2012), C. aromaticus Lamiaceae, Mentha arvensis and Leucasaspera forming inhibitory zone around mm, 9.67 mm, and 9:33 mm, while T. divaricata of Apocynaceae plants showed inhibition zone 7.33 mm, Catharanthus roseus 9.67 mm and Rauvolfia tetraphylla 9.33 mm. Overall test results showed that C. aromaticus most effective to inhibit the growth of A. hydrophila. Compared with 32 extract of plant in this research, there are 12 extract of herbal plants that have the inhibitor of A. hydrophila growth activity with inhibition zone 10 mm, among others, Syzygium aromaticum, Solanum ferox, Amomum compactum, Tamarindus indica, Boesenbergia pandurata, Zingiber zerumbet, Illicium verum, Piper nigrum, Trigonella foenum-graecum, leaf Citrus, Curcuma aeruginosa and Nigella sativa. Six extract can suppress the Pseudomonas sp. growth, they are Solanum ferox, Tamarindus indica, Illicium verum, leaf Citrus, and Nigella sativa. The highest antibacterial activity contained in the black cumin plant reaches mm Pseudomonas sp. and Aeromonas against bacteria. Similarly, research conducted by Babuselvam et al (2012), extracts Rhizophora mucronata and Salichornia brachiata ethanol use against pathogenic bacteria such as Vibrio harveyi in shrimp, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio anginllarum and Vibrio lohi and bacteria pathogens in fish such as Bacillus subtilis, Serratia sp., Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus showed different results. Brachiata Salichornia extracts has antibacterial activity compound to Vibrio alginolyticus (14 mm) and Vibrio parahaemolyticus (15 mm) higher than Rhizophora mucronata extract. Diversity of antibacterial activity test results is strongly influenced by the ingredients in each plant. However, the overall results of this test can be followed in vitro.

88 77 Figure 2. Antibacterial activity of Boesenbergia pandurata (A), Solanum ferox (B), and Zingiber zerumbet (C) against to A. hydrophila and Pseudomonas sp. In general, each of the extracts of the herb shows this diverse activity caused by the ingredients contained in the extract. Similarly, the results of research conducted by Kolanjinathan et al (2009) showed that the crude extract using ethanol from seaweed showed different antibacterial activity against bacteria such as Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, and

89 78 Bacillus cereus. Gracilaria edulis test results the ability to inhibit the growth of all tested bacteria except for Bacillus cereus and Enterobacter aerogenes. While extracts from Calorpha peltada proved able to inhibit the growth of Gram negative and positive bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Streptococcus faecalis. Extract Hydroclothres sp. is able to inhibit the growth of Pseudomonas aeruginosa. Results of testing the antibacterial activity of traditional crops is highly variable does not like the use of antibiotics, which results tend to constant testing with bacteri. Concentrations of Boesenbergia pandurata (800 and 900 ppm) are the concentration of the inhibitory zone with the widest ranges from mm were classified as intermediate group to suppress the A. hydrophila growth, the concentration are also likely to be used as antibacterial on fish. Concentrations of 100, 200 ppm of Solanum ferox are the best concentration that able to suppress the growth of bacteria Pseudomonas sp. consentration of Zingiber zerumbet 25, 200 and 2000 ppm are best consentration and can used for antibacterial to suppress the A. hydrophila infection on fish. Phytochemical analysis results shown that Boesenbergia pandurata contains alkaloids, flavonoids and carbohydrates; Solanum ferox contains alkaloids and carbohydrates and Zingiber zerumbet consist alkaloids, flavonoids, steroids and carbohydrates. That s component are able to decrease the bacteria growth. Component of sterols, hydroxychavicol, eugenol and phenolic compounds can suppress the growth of bacteria (Pauli 2002). In addition, other chemicals such as fatty acids (stearic acid and palmitic acid) and hydroxyl fatty acids esters (hydroxyl esters, Myristic and palmitic acids) are also have the ability to inhibit the growth of bacteria (Bhattacharya et al 2007). Meanwhile, according to Hayes & Berkovitz (1979), the material fatty acids can damage the wall surface of the bacteria and fungi that grow particularly at low temperatures. Fatty acids is believed to damage the structure and function of the bacterial cell wall and membrane (Hayes & Berkovitz 1979). Conclusion. A total of 30 kinds of plant extracts of traditional herb plant have antibacterial activity to against A. hydrophila and 29 to Pseudomonas sp. The highest activity shown by the Nigella sativa extract against both bacteria. The in vitro test to determination of an effective dose of the extract as an antibacterial substance to against both bacteria are 800 and 900 ppm Boesenbergia pandurata, 100 and 200 ppm Solanum ferox, 25, 200 and 2000 ppm Zingiber zerumbet. Acknowledgements. This research supported by Directorate General of Higher Education of the Republic Indonesia (DIKTI) with National Strategic Research. We thank for Faculty of

90 79 Fisheries and Marine Sciences Mulawarman University and Marine and Fisheries Kutai Kartanegara of their assisted during in the field. Reference Pauli A., Antimicrobial properties of catechol derivatives; 3rd World Congress on Allelopathy, Tsukuba, Japan, pp Babuselvam M., Mohamed Farook K. A., Abideen S., Peer Mohamed M., Uthiraselvam M., Screening of Antibacterial Activity of Mangrove Plant Extracts Against Fish And Shrimp Pathogens. International Journal of Applied Microbiology Science 1(3): Dulger B., Gonuz A., Antimicrobial activity of certain plants used in Turkish traditional medicine. Asian Journal of Plant Sciences, 3: Hardi E.H., Bacteria Levels Difference Pathogenecity Aeromonas sp. and Pseudomonas sp. on Tilapia. Proceeding The international Symposium on Human Development and Sustainable Utilization on Natural reseources in asian countries. Balikpapan, Indonesia. Kolanjinathan K., Ganesh P., Govindarajan M., Antibacterial activity of ethanol extracts of seaweeds against fish bacterial pathogens. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 13 (3): Haniffa M.A., Kavitha K., Antibacterial activity of medicinal herbs against the fish pathogen Aeromonas hydrophila. Journal of Agricultural Technology 8 (1): Hayes M.L., Berkovitz B.K., The reduction of fissure caries in Wistar rats by a soluble salt of nonanoinic acid,arch. Oral Biol. 24 : Bhattacharya S., Mula S., Gamre S., Kamat J.P., Bandyopadhyay S.K., Chattopadhyay S., Inhibitory property of Piper betel extract against photosensitization-induced damages to lipids and proteins. Food Chem.100 :

91 80 2. Artikel di seminarkan pada International Conference on Science and Technology 2015 Activity Antagonistic of Extracelluler product and Component Bacteri of Pseudomonas sp. against Aeromonas hydrophila from Nila Tilapia aquaculture in East Borneo Esti Handayani Hardi 1,a), Irawan Wijaya Kusuma 2), Wiwin Suwinarti 2), Gina Saptiani 1), Agustina 1) 1 Dept. of Aquaculture, Mulawarman University, East Kalimantan, Indonesia 2 Dept. Forestry, Mulawarman University, East Kalimantan, Indonesia a) Corresponding author: estie_hardie@fpik.unmul.ac.id Abstract. Activity antagonistic whole cell and 103 protein fraction from Pseudomonas sp. were studied against Aeromonas hydrophila pathogen on nila tilapia. Antagonistic test as measured by the zone of inhibition in vitro sensitivity test after 24 and 48 hours incubation time on 30 o C. both the protein fraction and whole cell pseudomonas have potential action against A. hydrophila infection in nila tilapia, but just 10 fraction have inhibition zone more than 12 mm, 5 fraction more than 14 mm and 2 fraction effective to reducing A. hydrophila growth more than 16 mm. All of extracellular fractions of Pseudomonas sp. were effective in reducing growth of pathogen A. hydrophila. Keywords: Biocontrol; Pseudomonas sp.; Aeromonas hydrophila Introduction A. hydropila is bacterial pathogen that has a very wide host, freshwater, brackish and sea water have been reported infected by bacterium, the bacteria caused hemorrhagic septicemia (Paniagua et al., 1990). These bacteria are facultative or opportunistic that can live in water without a host for long time and found almost throughout the year on fish farming. Fish deaths caused by this bacterium is very high more than 60%. The incubation period is short enough bacteria achieve optimum growth of hours, these factors highly pathogenicity in the host, because when bacteria intro the fish body it only takes less than 24 hours to grow and virulence develop. Bacterial infections A. hydrophila is always accompanied by infection of Pseudomonas sp. both of bacteria are always found in healthy and diseased tilapia with different levels of pathogenicity. According to Hardi (2012), Hardi and Pebrianto (2012) fish infected with the A. hydrophilla show changes in the external organs appear more and faster than the infection of Pseudomonas sp. This indicates that A. hydrophila more pathogens than one. The existence of Pseudomonas sp. in fish body is expected to be a bio control for A. hydrophila, but still need to do research related to the antagonistic properties of ekstraselullar products compound of Pseudomonas sp. to obstruct the A. hydrophila cell.

92 81 In fresh water aquaculture practices bacterial infectious diseases result in losses worldwide and to prevent them antimicrobial compounds are used intensively. In the process of phytopharmaca, vaccines and antibiotic treatment can reduce the A. hydrophila but less affectivity. Alternatives way to the use of antibiotics are gaining importance in many countries (Nogami and Maeda, 1992; Sugita et al., 1998; Gatesoupe, 1999; Bala Reddy, 2001). Accordingly, the application of microbial communities in aquaculture for controlling pathogenic bacteria shows promise Use of proteins produced by bacteria to suppress the growth of pathogens has been done with good results. Selection of bacterial products to kill bacterial pathogens are considered safer and more effective because it does not cause problems of resistance in farmed fish. Results of research conducted by Vijayan et al. (2006), shows that the supernatant of Pseudomonas sp. PS-102 is antagonistic against vibrio bacteria by 73%, and safe for shrimp the size of the PL-9. Nour and El-Ghiet (2011) tested the in vitro antibacterial activity of P. fluorescens against A. hydrophila. Pseudomonas sp. (EP-01) and A. hydrophila (EA-01) were isolated from tilapia are collated from Loa Kulu Kutai Kartanegara in East Kalimantan. From the results of pathogenicity test, it is known that A. hydrophila is a bacteria that caused changes in external organs more dominant, and these bacteria cause early death compared with Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. cause of death in 72 hours, whereas A. hydrophila at 48 hours post-injection (Hardi and Pebrianto, 2012). The results of the observations by Hardi et al, (2014), Pseudomonas sp. (EP-01) produces 103 protein fraction with a molecular weight of about 15: kda. However, the amount and type of protein in the ECPs are very dependent on bacterial growth media and duration of incubation. Several types of Pseudomonas sp. is antagonistic to some pathogenic bacteria in fish and shrimp farming (Vijayan et al, 2006; Mohideen et al, 2010, Rattanachuay et al 2010). In this study will be discussed on the in vitro antibacterial of 103 ECPs protein fractions of Pseudomonas sp. against pathogens A. hydrophila. In this study of 103 trials antagonistic protein fraction in extracellular product, and whole cells of Pseudomonas sp. against bacteria A. hidrophilla with inhibition method. Material and Methods Isolation of Bacteria A. hydrophila (EA-01) dan Pseudomonas sp. (EP-01) bacteria, ware isolated from nila tilapia Loa Kulu Kutai Kartanegara, East Kalimantan. Both bacteria ware isolation by taking samples of nile tilapia who have change in exsternal anatomy pathology, purulens eyes, a wound). The bacteria ware grown in BHIB (Brain Heart Infusion Broth) and BHIA (Brain Heart Infusion Agar) media for 24 h at 30 o C. Preparation of extracellular products (ECP) components Two types of antigenic compound of Pseudomonas sp., e.g. whole cell product (Wh) and 103 protein of extracellular product (ECP) were prepared from Pseudomonas sp. which grown in BHI medium for 24 hours, o C. To get the whole cell of Pseudomonas sp., cultured cell of the bacteria was removed from the medium by centrifugation at g and 4 o C for 30 min. the pellet was washed and resuspended in phosphate buffer saline (PBS) and used for antagonistic test. Extracelullar product gets by centrifugation of bacteria culture at g and 4 o C for 30 min, the supernatant were filtered (0.22 μm). The cell-free supernatant (10 µl) from each culture was mixed with one gram SDS-PAGE sample loading buffer (192 m Mglycine+0.1% m MSDS Trishidroksi aminometan) and then boiled for 1 min. The samples and low-range protein molecular weight standards were then loaded into each well of an SDS PAGE gel (10%) using the method described by Laemmli (1970). The gel was run at 100 V for 120 min. Separated proteins in the gel were then stained with silver nitrate following the method described by Bradford (1976).

93 82 Preparation of different cellular components There are four antigenic components from Pseudomonas sp., e.g. heat killed whole cell product (HK), whole cell product (WCP), intra cellular product (ICP) and extra cellular product (ECP). the bacteria was grown in sterile brain heart infusion broth (BHi media, Oxoid) at o C for 24 h. the bacteria density is cfu/ml, whereas an OD 10 Pure cultures preparation for HK WCP, WCP, ECP and ICP separately. The optical density (OD) of 24 h old cultures was taken for each bacterium and simultaneous plating was carried out in triplicate and the colony forming unit/ml was calculated. The optical density at 546 nm of P. fluorescens was which corresponded to of P. aeruginosa corresponded to 1.2x10 9 cfu/ml and an OD of P. putida, corresponded to 2.1x10 9 cfu/ml respectively. The protein estimation of all the protein fraction of Pseudomonas species was according to Bradford (1976). The minimum amount of protein content (70 Al) of the lowest protein concentration of Pseudomonas species was taken as standard and accordingly the other protein fractions of other Pseudomonas species were calculated and charged in nutrient agar plates Whole cell product (WCP) bacteria Pseudomonas sp. grown separately in brain heart infusion broth were harvested after 24 h incubation and centrifuged at 10,000 g for 10 min at 4 o C. The bacterial pellet was washed twice and resuspended in phosphate buffered saline (PBS) (ph 7.2) and used for the antagonistic study. Extra cellular product (ECP) The supernatants obtained after centrifuging 24 h old cultures of bacteria in brain heart infusion broth were filtered (0.22 Al). They were further concentrated with 20% PEG 6000, dialysed against PBS (ph 7.2) and used as ECP. Heat killed whole cell product Pseudomonas cultures grown in bulk were harvested by centrifugation at 10,000 g for 10 min at 4 o C. The bacterial pellet was washed twice and resuspended in phosphate buffered saline (ph 7.2). They were heat killed at 60 o C for 1 h in a water bath and finally stored at 20 o C. Intra cellular product (ICP) bacteria Pseudomonas sp. were grown separately in brain heart infusion broth and centrifuged at 10,000 g for 10 min at 4 o C. The bacterial pellet was washed twice and re-suspended in phosphate buffered saline (ph 7.2), to 2% of the initial volume. The cell pellets were then sonicated at 50 Hz for 5 min filtered through a syringe with a 0.45 Al filter and finally stored at 20 o C until further use. Antagonistic Test Twenty five µm of Wh and ECP were impregnated on mm diameter sterile discs and placed on BHIA medium plates previously swabbed with A. hydrophila isolation. The plates were incubated at 30 o C for 24 h and than the inhibition zone was measured and recorded. Discussion Pseudomonas sp. (EP-01) were grown in BHI broth medium and incubated for 24 h at 30 C resulted in 113 fractions with varying volumes in detail, the amount of each fraction results can be seen in the following Figure 1. Figure 1. The results of the purification of Pseudomonas sp. with sephadek G-100.

94 83 Fraction number 9, containing ppm/ml supernatant, only 11 fraction have more than 20 ppm, the rest only between ppm/ml supernatant. Overall, ECP produced by Pseudomonas sp. up to 43 ppm. Results fractionated using SDS Page showed that the molecular weight produced by Pseudomonas sp. on TSB liquid media with time incubation 24 h at 30 C ranged from kda and there are 15 bands protein detected (Hardi et al, 2014). Only a few number of protein fraction are known the weight moleculer e.g. number 19 and 30 as well as the fractions to 32 and 39. Each molecular weight shown in Table 1 below: Tabel 1. Extracellular Pseudomonas sp. relations between standard molecule weigh and relative migration (Rm) Sample Run Band Rf a b BM BM Kd and and Figure 2. Extracellular electrophoresis by SDS PAGE with silver stain Testing capabilities ECP antagonistic Pseudomonas sp. against A. hydrophila done using paper disc with an incubation period of 24 and 48 hours, the results indicate that there are 10 fractions ECP decrease the A. hydrophila growth, with inhibition zone more than 12 mm. they are fraction ECP number 10, 35, 37, 40, 57, 62, 71, 73, 84, and 101. Any 5 fractions have inhibition zone more than 14 mm and 4 fractions more than 15 mm. Only 2 number of ECP fractions have inhibition zone more than 16 mm. Some number of ECP fractions from Pseudomonas sp. likely as a candidate for A. hydrophila bio control. More detailed about inhibition zone diameters can be seen in Figure 3.

95 84 Inhibition zone from number of fraction to A. hidrophila EA-01 strain is very varied, but generally each number of fractions has a grown inhibition. Any 48 fractions of 103 fractions or 46.6% had more inhibition zone of 10 mm and only 27 fractions or 26.2% inhibition zone has more than mm, or inhibition zone by whole cells of Pseudomonas sp. against A. hydrophila. This indicates that Pseudomonas sp. in the fish body is a limiting factor for the A. hydrophila infection in nila tilapia. Whole cells of Pseudomonas sp. able to inhibit the A. hydrophila growth by forming inhibitory zone of mm. At the time, culture together both bacteria in BHIB media shown that growth of A. hydrophila decreased, highest inhibition zone by number of ECP fractions are number 40 and 73 (17 mm). Heat whole cells and killed whole cell product some strains of Pseudomonas sp. can suppress the growth of several strains of bacteria pathogen A. hydrophila (Das et al., 2006). Potency to suppress the growth of bacteria A. hydrophila is due in ECP protein fractions of Pseudomonas sp. containing antibiotics, bacteriocyn, siderophor (Gram and Melchiorsen, 1996), lysozym and other proteases (Sugita et al., 1998). Whole cells of Pseudomonas sp. (W3) can produce alkaline protease in extracellular products that can suppress the growth of bacteria that cause disease luminous vibriosis in shrimp. The components used are the supernatant of the bacterial suspension with a dose 0 : 45 and 0 : 22 μl. That capability was due to Pseudomonas sp. W3 produce proteolytic enzyme and lysozyme (Nacetylmuramidase) and lytic enzyme. (Rattanachuay et al., 2010). The supernatant of Pseudomonas sp. (I- 2) contains antibacterial ingredients such as proteolytic, lipolytik and amylolitic enzyme that suppresses the Vibrio harveyi growth (Vijayan et al., 2006).

96 Figure 3. Zones of inhibition of ECP fraction and Whole cell of Pseudomonas sp. against A. hydrophila. 85

97 86 Figure 4. Zones of inhibition of Pseudomonas sp. component against to A. hydrophila. All the components of Pseudomonas sp. bacteria have a antibacterial activity to A. hydrophila pathogen begin the 6 hours but the best inhibition zone in 12 hours to decrease up to 36. The best component from bacteria to depress the pathogen bacteria are WCP, ICP and HK, which has inhibition zone more than 10 mm. While other components that produce inhibition zone 7-10 mm. This indicates that the bacterium Pseudomonas sp. has antibacterial activity against to A. hydrophila. in addition, almost all components of Pseudomonas sp. bacteria is able to inhibit the growth of pathogenic bacteria special A. hydrophila. Acknowledgments Ut wisi enim ad minim veniam, quis nostrud exerci eliton ullamcorper suscipit lobortis nisl ut aliquip ex en commodo consequat. Duis te feugifacilisi per suscipit lobortis nisl ut aliquip ex en commodo consequat.lorem ipsum dolor sit amet, consectetuer adipiscing References 1. Eissa Nour and E.N. Abou El-Ghiet Efficacy of Pseudomonas fluorescens as Biological Control Agent against Aeromonas hydrophila Infection in Oreochromis niloticus. World Journal of Fish and Marine Sciences 3 (6): Vijayan, K.K., I.S. Bright Singh, N.S. Jayaprakash, S.V. Alavandi, S. Somnath Pai, R. Preetha, J.J.S. Rajan, T.C. Santiago A brackishwater isolate of Pseudomonas PS-102, a potential antagonistic bacterium against patogenic vibrios in penaeid and non-penaeid rearing systems. Aquaculture 251 : M.M.Abdul Kader Mohideena, T.Selva Mohanb, K.R. Fathima Mashrooraa, K.Kiruthika Lakshmic and M.I.Zahir Hussain Pseudomonas fluorescens is an Effective Probiotic against Fish- Patogenic Vibrio sp. International Journal of Biological Technology (2010):1(2): Pattamarat Rattanachuay, Duangporn Kantachote, Manee Tantirungkij, Teruhiko Nitoda, Hiroshi Kanzaki Inhibition of shrimp patogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp. W3. Electronic Journal of Biotechnology, Vol.13 No Gram, L. and Melchiorsen, J., Interaction between fish spoilage bacteria Pseudomonas sp. and Shewanella putrefaciens in fish extracts and on fish tissue. J. Appl. Bacteriol. 80, Sugita, H., Hirose, Y., Matsuo, N., Deguchi, Y., Production of the antibakterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture 165, Das BK, Surya Kanta Samal, Biswa Ranjan Samantaray, Satyanarayana Sethi, Phalguni Pattnaik, Bibhudendu Kumar Mishra Antagonistic activity of cellular components of Pseudomonas species against Aeromonas hydrophila. Aquaculture 253: Gatesoupe, F.J., The effect of bacterial additives on the production rate and dietary value of rotifers as food for Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Aquaculture 83, Nogami, K., Maeda, M., Bacteria as biocontrol agents for rearing larvae of the crab Portunus trituberculatus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 49,