Lampiran A. Data Persentase Kesakitan Ikan. Ulangan Perlakuan I II III

Transkripsi

1 Lampiran A. Data Persentase Ikan Ulangan Perlakuan I II III % % Rata-Rata Po(Kontrol) ph, ,7 ph, ,00 ph 7, ,00 ph 7, ,00 ph 8, ,7 ph 8, , Keterangan: a. Waktu pengamatan dilakukan selama hari dan dicatat kesakitan ikan setiap hari. b. Jumlah ikan pada awal perlakuan sebanyak 10 ekor per akuarium

2 Lampiran B. Data Uji Normalitas, Non Parametrik Mann-Whitney Tests of Normality (b) Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk Sig. Perlakuan Statistic df Sig. Statistic df ph.0 0, ,75-4,2E- 1 ph,5 0, ph 7,0 0, ph 7,5 0, ph 8,0 0, ,75-4,2E- 1 ph 8,5 0, ,75-4,2E- 1 a. Liliefors significance Correction b. is contant when perlakuan = Po. It has been omitted Npar Tests Kruskal-Wallis Test Perlakuan N Mean Po 2 ph,0 1,8 ph,5 1,7 ph 7,0 1,7 ph 7,5 1,7 ph 8,0 12,17 ph 8, Test Statistics a,b Chi- Square 14,18141 df Asymp. Sig. 0,02774 a. Kruskal Wallis Test

3 Npar Test (Mann-Whitney Test) Po ph,0 Perlakuan N Mean Sum of 2,00 5,00 15 Test Statistic b Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,1212 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,0895 0,1 a Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of Po ph,5 2,00 5,00 15 Test Statistics b Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,088 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,0904 0,1 a

4 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of Po ph 7,0 2,00 5,00 15 Test Statistics(b) Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,088 Asymp. Sig. (2- tailed) 0,0904 Exact Sig. [2*(1- tailed 0,1 a Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of Po ph 7,5 2,00 5,00 15 Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,088 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,0904 0,1 a

5 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of Po ph 8,0 2,00 5,00 15 Test Statistics(b) Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,1212 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,0895 0,1 a Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of Po ph 8,5 2,00 5,00 15 Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,1212 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,0895 0,1 a c. Not corrected for ties d. Grouping Variable: Perlakuan

6 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,0 ph,5 4,17 2,8 12,50 8,50 Mann-Whitney U 2,5 Wilcoxon W 8,5 Z -0,94281 Asymp. Sig. (2-tailed) 0, ,4 a b. Grouping Variable: Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,0 ph 7,0 4,17 2,8 12,50 8,50 Mann-Whitney U 2,5 Wilcoxon W 8,5 Z -0,94281 Asymp. Sig. (2-tailed) 0, ,4 a

7 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,0 ph 7,5 4,17 2,8 12,50 8,50 Mann-Whitney U 2,5 Wilcoxon W 8,5 Z -0,94281 Asymp. Sig. (2- tailed) 0,45779 Exact Sig. [2*(1- tailed 0,4 a Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,0 ph 8,0 4, 2,7 1,00 8,00 Mann-Whitney U 2,5 Wilcoxon W 8,5 Z -0,94281 Asymp. Sig. (2-tailed) 0, ,400 a

8 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,0 ph 8,5 5,00 2,00 15,00,00 Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -2,022 Asymp. Sig. (2-tailed) 0, ,100 a Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,5 ph 7,0,50,50 10,50 10,50 Mann-Whitney U 4,500 Wilcoxon W 10,500 Z,000 Asymp. Sig. (2-tailed) 1,000 1,000 a

9 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,5 ph 7,5,50,50 10,50 10,50 Mann-Whitney U 4,500 Wilcoxon W 10,500 Z,000 Asymp. Sig. (2-tailed) 1,000 1,000 a Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,5 ph 8,0,8,17 11,50 9,50 Mann-Whitney U,5 Wilcoxon W 9,5 Z -0,4714 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,752 0,7

10 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph,5 ph 8,5 5,00 2,00 15,00,00 Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W Z -1,992 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,0402 0,1 Npar Test (Mann-Whitney Test) Perlakuan N Mean Sum of ph 7,0 ph 7,5,50,50 10,50 10,50 Test Statistics(b) Mann-Whitney U 4,500 Wilcoxon W 10,500 Z,000 Asymp. Sig. (2-tailed) 1,000 1,000 a

11 Npar Test (Mann-Whitney Test) s Perlakuan N Mean Sum of ph 7,0 ph 8,0,8,17 11,50 9,50 Mann-Whitney U,500 Wilcoxon W 9,500 Z -,471 Asymp. Sig. (2-tailed),7,700 a Npar Test (Mann-Whitney Test) s Perlakuan N Mean Sum of ph 7,0 ph 7,5 5,00 2,00 15,00,00 Mann-Whitney U,000 Wilcoxon W,000 Z -1,99 Asymp. Sig. (2-tailed),04,100 a c. Not corrected for ties d. Grouping Variable: Perlakuan

12 Npar Test (Mann-Whitney Test) s Perlakuan N Mean Sum of ph 7,5 ph 8,0,8,17 11,50 9,50 Mann-Whitney U,500 Wilcoxon W 9,500 Z -,471 Asymp. Sig. (2-tailed),7,700 a Npar Test (Mann-Whitney Test) s Perlakuan N Mean Sum of ph 7,5 ph 8,0 5,00 2,00 15,00,00 Mann-Whitney U,000 Wilcoxon W,000 Z -1,99 Asymp. Sig. (2-tailed),04,100 a

13 Npar Test (Mann-Whitney Test) s Perlakuan N Mean Sum of ph 8,0 ph 8,5 5,00 2,00 15,00,00 Mann-Whitney U,000 Wilcoxon W,000 Z -2,02 Asymp. Sig. (2-tailed),04,100 a

14 Lampiran C. Amplikasi Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction Amplikasi RNA dibagi menjadi dua reaksi protokol dalam mesin RT-PCR yaitu: a. Protokol suhu reaksi PCR tahap I: 42 C 0 menit; 94 C 2 menit, kemudian 94 C 0 detik; 2 C 0 detik; 72 C 0 detik, ulangi 20 siklus, kemudian tambahkan 72 C 0 detik; 20 C 0 detik pada akhir siklus. b. Profil suhu reaksi PCR tahap 2 (Nested PCR): 94 C 20 detik; 2 C 20 detik; 72 C 0 detik, ulangi 0 siklus, kemudian tambahkan 72 C 0 detik; 20 C 0 detik pada akhir siklus. Persiapan Reagent a. RT-PCR Reaction: 8 µl/reaksi RT-PCR Pre-Mixed Reagent : 7,0 µl IQzyme TM, 2 unit/µl : 0,5 µl Reverse Transcriptase (RT) Mix Enzim : 0,5 µl b. Nested PCR Reaction: 15 µl/reaksi Nested PCR Pre-Mixed Reagent :14 µl IQzyme TM, 2 unit/µl : 1 µl

15 Lampiran D. Pembuatan Isolat Virus Metode menurut Malole et al., (200) Ikan kerapu macan positif VNN Virus konsentrasi 10% Inokulan baku virus Diambil organ mata dan otaknya Digerus dengan mortal Ditambahkan NaCl fisiologis Disentrifugasi pada.000 rpm selama 15 menit pada suhu 5 C Diambil supernatan Disaring dengan miliphore 0,45 µm Hasil Ditambahkan antibiotik penicilin IU dan Streptomicin µl tiap mililiter suspensi Disimpan dalam deef freezer suhu -40ºC

16 Lampiran E. Alur kerja Uji FID 50 Metode Menurut Reed and Muench dalam Amrullah (2004) Ikan kerapu macan Diinfeksi virus VNN dengan konsentrasi masing-masing 10-2, 10 -, 10-4, 10-5, 10 -, 10-7 sebanyak 0,1 ml/ekor Diamati gejala klinis dan dicatat kematian Dihitung nilai FID 50 Hasil

17 Lampiran F. Pemeriksaan Hematologi Metode Menurut Benjamin (198) 1. Penentuan Hemoglobin Working Reagent Dimasukkan ke dalam 2 cuvet Dimasukkan sampel 10 µl ke dalam cuvet pertama Dimasukkan akuades 10 µl ke dalam cuvet kedua Dihomogenkan masing-masing campuran dan dibiarkan selama menit Diatur spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm Diatur standar Dinolkan spektrofotometer Dimasukkan sampel dan dibaca hasilnya Hasil 2. Pemeriksaan Hematokrit (PCV) Darah Hasil Dimasukkan ke dalam tabung hemotokrit sebanyak ¾ tabung dan ditutup ujungnya dengan lilin Disentrifugasi pada rpm selama 5 menit Dilakukan perhitungan nilai supranatan pada microhematocrite reader

18 . Pemeriksaan Eritrosit Darah Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue Dihisap larutan Hayem sampai tanda 101 tanpa menimbulkan gelembung udara Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan Dibuang cairan yang tidak ikut terkocok Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang terlebih dulu Diamati di bawah mikroskop Dihitung jumlah sel darah merah pada 5 kotak menengah di bagian tengah kamar hitung Dihitung jumlah eritrosit dengan Rumus: HPA= n x Hasil

19 4. Pemeriksaan Leukosit Darah Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue Dihisap larutan Turk sampai tanda 11 tanpa menimbulkan gelembung udara Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan Dibuang cairan yang tidak ikut terkocok Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang terlebih dulu Diamati di bawah mikroskop Dihitung jumlah sel darah putih pada 4 kotak besar pada bagian pinggir kamar hitung Dihitung jumlah leukosit dengan Rumus: HPA= n x 50 Hasil

20 Lampiran G. Pemeriksaan Histopatologi Metode Menurut Suntoro (198) Otak Blok parafin Dicuci dengan NaCl 0,9% Difiksasi (dimasukkan ke dalam fiksatif Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% selama 1 jam) Washing, (dengan menggunakan jaringan dimasukkan ke dalam alkohol 70, 80, 9% selama 1,5 jam Dehidrasi dilakukan dengan merendam otak alkohol absolut I,II,III selama 1 jam Clearing dilakukan dengan merendam otak dilakukan dengan xylol I,II,III se1ama 5 jam Infiltrasi dilakukan dengan merendam otak pada parafin I,II yang dilakukan di dalam oven dengan suhu 5ºC selama 2 jam. Embedding dilakukan dengan meletakkan otak pada kaset berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu, menuang parafin yang telah cair ke dalam kaset tersebut, dan diberi label.

21 Blok parafin Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah di holder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 4 µm. Pita Parafin Hasil Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan skapel, kemudian diletakkan pada gelas objek, dan dicelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan di atas waterbath beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada objek glass. Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan preparat ke dalam xylol I, II, III selama menit Dealkoholisasi, dilakukan dengan mencelupkan preparat ke dalam alkohol absolut I, II, III selama menit Pewarnaan sediaan otak diwarnai dengan menggunakan Hematoxilin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara gelas objek dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama menit lalu dicuci dengan dengan air mengalir Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diamati di bawah mikroskop

22 Lampiran H. Uji Reverse Trancriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) Otak Pelet Dimasukkan 20 mg sampel otak ke dalam tabung mikro 1,5 ml Dilarutkan dengan 500 µl RNA Extraction Solution Digerus sampai hancur, didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit Ditambahkan 100 µl CHCl, kemudian divortex 20 detik. Biarkan pada suhu kamar selama menit lalu disentrifugasi pada rpm selama 15 menit. Dipipet 200 µl dari fase atas (bagian jernih) ke dalam tabung mikro 0,5 µl yang berisi 200 µl 2-propanol Divortex sebentar, lalu disentrifugasi pada rpm selama 10 menit, lalu dibuang isopropanol tersebut Dicuci pelet dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian di spin down 9000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian dituang etanol dan dikeringkan pelet Dilarutkan dengan 200 µl ddh 2 O

23 Pelet Disiapkan reagent RT-PCR dan Nested PCR sesuai dengan sampel. Untuk setiap campuran reaksi perlu mempertimbangkan standar positif (10, 10 2 dan 10 1 ) dan 1 kontrol negatif (ddh 2 O atau ragi trna). Dipipet 8 µl reagen RT-PCR ke dalam tabung mikro dan diberi label Ditambahkan 2 µl ekstrak sampel RNA atau standar ke masing-masing campuran reaksi Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses tahap I (First PCR Reaction) Ditambahkan 15 µl reagen Nested PCR untuk setiap tabung setelah tahap I selesai Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses tahap II (Nested PCR Reaction) Ditambahkan 5 µl X loading dye untuk masing-masing tabung dan dihomogenkan Hasil

24 Gel agarose Hasil Ditimbang gel agarose sebanyak 2 g Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 ml TAE Dipanaskan di dalam microwave sampai berubah bening Didinginkan pada temperatur ruang sampai temperatur 50 C Dituang dalam kotak gel dengan ketinggian 0,-0,5 cm dan ketebalan 0,8 cm Dimasukkan sisir plastik (comb) ke dalam gel agarose Diangkat comb pada saat gel sudah memadat Ditambahkan buffer elektroforesis ke dalam kotak gel sampai garis pembatas Dimasukkan 5 µl marker ke sumur pertama, diikuti kontrol negatif dan sampel sebanyak 8 µl satu per satu Dilakukan proses elektroforesis pada tegangan volt sampai warna biru mencapai ¾ bagian gel Dikeluarkan gel dari kotak gel Direndam gel ke dalam campuran 10 µl Ethidium Bromida dan 100 ml akuabides selama 10 menit Diangkat gel dan dicuci dengan akuades steril Diletak pada transilluminator UV gelombang untuk membaca hasil akhir

25 Lampiran I. Dokumentasi Penelitian Sterilisasi Kolam penampungan akuarium Sentrifugasi PCR Vorteks Microwave Elektroforesis UV-Transmillator Spektrofotometer Sentrifugasi Hematokrit Reader