Lampiran 1. Alur Kerja Pengambilan Sampel. Sampel Saprolegnia diambil dari telur yang terdapat pembentukan kapas pada permukaannya

Transkripsi

1 Lampiran 1. Alur Kerja Pengambilan Sampel Persiapan Alat dan bahan Sampel Saprolegnia diambil dari telur yang terdapat pembentukan kapas pada permukaannya Sampel air diambil dari kolam yang memiliki sejarah tidak pernah terinfeksi Saprolegnia Telur terinfeksi diambil dengan menggunakan pinset Masukkan telur terinfeksi ke dalam botol steril yang sudah di isi dengan air dari bak pembenihan tersebut Masukkan botol steril di kedalaman air cm diatas permukaan air, kemudian botol ditutup Simpan botol dalam kotak pendingin dan segera dikirim ke laboratorium Simpan botol dalam kotak pendingin dan segera dikirim ke laboratorium

2 Lampiran 2. Komposisi Medium Medium MGMC padat - K 2 HPO 4 0,7 g - KH 2 PO 4 0,3 g - MgSO 4.7H 2 O 0,5 g - FeSO 4.7H 2 O 0,01 g - ZnSO 4 0,001 g - MnCl 2 0,001 g - Koloidal kitin 12,5% (b/v) 72,7 ml - Agar 20 g - ph 6,8 Medium MGMC cair - K 2 HPO 4 0,7 g - KH 2 PO 4 0,3 g - MgSO 4.7H 2 O 0,5 g - FeSO 4.7H 2 O 0,01 g - ZnSO 4 0,001 g - MnCl 2 0,001 g - Koloidal kitin 12,5% (b/v) 72,7 ml - ph 6,8 Cara Pembuatan Semua bahan dicampur dan ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi satu liter. Diatur ph sampai 6,8 dengan menambahkan NaOH 0,1N atau HCl 0,1 N. Setelah dicapai ph yang diinginkan, medium disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 2 bar selama 15 menit.

3 Lampiran 3. Alur Kerja Uji Penghambatan Saprolegnia sp in vitro Biakan Saprolegnia sp. Diinokulasikan pada bagian tengah media MGMC Biakan bakteri kitinolitik Sebanyak 10 µl (setara dengan 10 8 sel / ml) diinokulasikan pada kertas cakram yang diletakkan pada media MGMC dengan jarak 3,5 cm dari tempat biakan inokulum Saprolegnia sp. Diinkubasi pada suhu 30 C dan dilakukan pengamatan setiap hari selama 7 hari Hasil pengamatan

4 Lampiran 4. Alur kerja pengukuran N-asetilglukosamin Hifa Saprolegnia inokulum Saprolegnia diinokulasi dalam media GYB kemudian diinkubasi selama 72 jam diautoklaf dan dikeringkan dalam oven hingga mendapatkan berat konstan ditimbang sebanyak 0,1 gram kemudian diinokulasikan pada media cair garam tanpa kitin Bakteri kitinolitik potensial inokulum bakteri kitinolitik sebanyak 0,1 ml (setara dengan 10 8 ) diinokulasikan pada media garam cair tanpa kitin diinkubasi pada shaker water bath dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30ºC selama 24 jam Pengukuran N - asetilglukosamin sebanyak 0,5 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 0,1 ml larutan A (Na 2 B 4 O 7 0,8M) lalu dipanaskan setelah dingin ditambahkan larutan B (1%pdimetilaminobenzaldehida dalam asam asetat glasial + 1,25% HCl 10N yang dibuat saat digunakan) divortek dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit Diukur absorbansi warna dan konsentrasi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 538 nm Konsentrasi N -asetilglukosamin

5 Lampiran 5. Preparasi Saprolegnia sp untuk uji in vivo Inokulum Saprolegnia sp. Koloni Saprolegnia sp. umur 48 jam dipotong dengan menggunakan Cork borer No.2 (dengan diameter 5,5 mm) Miselium Saprolegnia sp. Diinokulasi dalam 20 ml Glucose yeast extract agar (GY agar) diinkubasi 25 C selama jam dipotong dan dibilas dengan akuades steril tiga kali diinokulasi pada 20 ml akuades steril Diinkubasi pada suhu 30ºC selama 24 jam Zoospora Saprolegnia sp. keberadaan zoospora diamati di bawah mikroskop dihitung jumlah zoospora yang diperlukan untuk infeksi (1 x 104) dengan menggunakan haemocytometer Zoospora siap untuk uji in vivo

6 Lampiran 6. Alur kerja patogenitas Saprolegnia sp. 25 telur gurami sehat Ditempatkan pada wadah kaca yang berisi 400 ml air steril Kelompok perlakuan diinokulasikan dengan zoospora 1 x 10 4 dan kontrol tidak Pengamatan dilakukan selama 7 hari hingga telur menjadi larva Pengamatan yang dilakukan adalah tingkat infeksi, daya tetas dan tingkat kematian (mortalitas) Hasil

7 Lampiran 7. Alur Kerja Preparasi Isolat Bakteri Isolat Bakteri Kitinolitik dibiakkan pada media miring MGMC selama 24 jam sebanyak 0,4 ml kultur bakteri kitinolitik (setara dengan 10 5 sel/ml) ditambahkan kedalam 400 ml air di wadah kaca Inokulum bakteri siap digunakan untuk uji in vivo

8 Lampiran 8. Alur kerja patogenitas Isolat Bakteri 25 telur gurami sehat Ditempatkan pada wadah kaca yang berisi 400 ml air steril Kelompok perlakuan diinokulasikan sebanyak 0,4 ml kultur bakteri kitinolitik (setara dengan 10 5 sel/ml) ditambahkan kedalam 400 ml air di wadah kaca sedangkan kontrol tidak Uji Perlekatan sebanyak 3 telur dari setiap wadah kaca diambil kemudian ditempatkan dalam petri steril digerus dan dibiakkan pada media MGMC dengan metode sebar kemudian inkubasi pada suhu 30 C selama 24 jam Diamati pembentukan zona bening yang dibentuk oleh bakteri sebanyak 2 telur dari setiap wadah kaca diambil kemudian difiksasi dengan FBS Uji Patogenitas Pengamatan dilakukan selama 7 hari hingga telur menjadi larva Pengamatan yang dilakukan daya tetas dan tingkat kematian (mortalitas) Hasil

9 Lampiran 9. Alur kerja Perlekatan Isolat Bakteri 25 telur gurami sehat Ditempatkan pada wadah kaca yang berisi 400 ml air steril Kelompok kontrol positif diinokulasikan sebanyak 0,4 ml kultur zoopora (setara dengan 10 4 sel/ml) Kelompok kontrol negatif tidak diinokulasikan baik zoospora maupun kultur bakteri Kelompok perlakuan diinokulasikan sebanyak 0,4 ml kultur bakteri kitinolitik (setara dengan 10 5 sel/ml).setelah 24 jam diinokulasikan sebanyak 0,4 ml kultur zoopora (setara dengan 10 4 sel/ml) Pengamatan dilakukan selama 7 hari hingga telur menjadi larva Pengamatan yang dilakukan daya tetas dan tingkat kematian (mortalitas) Hasil

10 Lampiran 10. Cakupan Kegiatan Penelitian Pengambilan Sampel Bakteri air Saprolegnia air pada Isolasi Isolasi Identifikasi Identifikasi Biakan Asai antagonisme Preparasi bakteri kitinolitik Preparasi produksi zospora Uji patogenitas bakteri kitinolitik Rancangan percobaan Pengujian secara in Vivo Uji kemampuan bakteri melekat pada sel telur Rancangan Percobaan : Kontrol positif : dilakukan infeksi Saprolegnia Kontrol negatif : tanpa pemberian bakteri kitinolitik maupun Saprolegnia Perlakuan 1 : Bakteri kitinolitik A, diinfeksi Saprolegnia Perlakuan 2 : Bakteri kitinolitik B, diinfeksi Saprolegnia Perlakuan 3 : Bakteri kitinolitik C, diinfeksi Saprolegnia Analisis kuantitatif terhadap pengamatan Infection rate, hatching rate dan mortality rate

11 Lampiran 11. Isolat Biakan Murni Bakteri Kitinolitik dan Beberapa Hasil Uji Biokimia Biakan Murni Bakteri Kitinolitik Uji Sitrat Uji TSIA Uji Gelatin Uji Pati

12 Lampiran 12. Hasil Pengukuran Kadar N-Asetilglukosamin pada Uji Antagonisme Isolat Bakteri Kitinolitik terhadap Saprolegnia sp. Isolat Absorbansi GlcNAc (µg/ml) Kontrol (24 jam) 0 0 Kontrol (48 jam) 0 0 PB PB PB 17 0,034 0,008

13 Lampiran 13. Hasil Pengamatan dan Gambar Abnormalitas Larva Kode Ekor tidak ada Bentuk tubuh seperti siput Abnormalitas Larva Ikan Tulang belakang bengkok Siamese Twin Abnormalit as kuning telur Lainnya PB 3A PB PB PB PB PB PB PB PB PB Kontrol Abnormalitas tulang belakang (A) Normal (B)

14