III. METODELOGI PENELITIAN. Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai Oktober 2011, bertempat di

Transkripsi

1 22 III. METODELOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai Oktober 2011, bertempat di Laboratorium Instrumentasi Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung. Analisis HPLC dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gajah Mada Yogyakarta. B. Alat dan Bahan 1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, KNAUER HPLC FLD & RID (Complete Sys), sentrifugasi, waterbath, autoklaf merk Speed Clave Model S-90 N, Laminar air flow CRUMA model 9005-FL, spektrofotometer UV-vis merek Hitachi , oven, lemari pendingin, magnetic stirrer, penangas air, timbangan analitik, ph meter, Erlenmeyer, cawan petri, jarum ose, mikropipet.

2 23 2. Bahan-bahan yang digunakan Bahan yang digunakan adalah jerami padi yang telah dikeringkan dan dihaluskan, diperoleh dari Desa Gondang Rejo Kecamatan Pekalongan Kabupaten Lampung Timur Provinsi Lampung varietas Siherang. Bahan kimia yang dipakai meliputi medium YM (Yeast Malt), natrium klorida, reagen DNS, 0,02 M buffer sitrat fosfat ph 4, aseton, 0,02 M buffer fosfat ph 7, natrium hipoklorit, natrium hidroksida, metanol, etanol, asetonitril, bircwood xylan (Sigma Chemical Co.) dan enzim xilanase yang dihasilkan dari isolat Actinomycetes AcP-7. C. Prosedur Penelitian 1. Pembuatan Media YM (Yeast Malt) Medium YM terdiri dari 4 g ekstrak khamir, 10 g ekstrak malt, 15 g glukosa per 1 Liter media, diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC dan tekanan 2 atm, kemudian ditambahkan dengan 50 µg/l Nistatine dan 25 µg/l Streptomycine. 2. Pembuatan Pereaksi a. Pembuatan Buffer Fosfat 1) Larutan Stok A (NaH 2 PO 4 H 2 O 0,2 M) Sebanyak 27,8 g NaH 2 PO 4 H 2 O dilarutkan dengan air suling hingga volume 1000 ml. 2) Larutan Stok B (Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,2 M)

3 24 Sebanyak 35,6 g Na 2 HPO 4 2H 2 O dilarutkan dengan air suling hingga volume 1000 ml. b. Pembuatan Pereaksi DNS Larutan A : 3 g NaOH; 0,6 g fenol; 3 g DNS dalam 240 ml air suling. Larutan B : 0,25 g Na-sulfit; 2 g Na-K-tartarat dan 5 ml air suling. Sebanyak 3 ml larutan B ditambahkan pada 240 ml larutan A dan ditambahkan air suling hingga volume 300 ml. 3. Ekstraksi Xilan Sebanyak 100 gram sampel jerami padi dalam bentuk tepung dimasukkan ke dalam wadah plastik dan direndam dalam 1 liter NaOCl 1 % selama 5 jam pada suhu ruang. Setelah 5 jam, sampel dibilas dengan air dan disaring (penghilangan lignin). Sampel kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari atau pada suhu 50 o C selama 48 jam dan selanjutnya diekstraksi. Sampel yang sudah dikeringkan selanjutnya direndam dalam larutan NaOH 15 % selama 24 jam pada suhu 28 o C. Perendaman ini bertujuan untuk mengekstraksi xilan. Setelah 24 jam perendaman, dilakukan penyaringan untuk memperoleh filtrat. Filtrat yang dihasilkan ditampung untuk diukur ph-nya dan selanjutnya dinetralkan dengan HCl 6 N hingga ph 7. Ampas yang sudah tidak terpakai dibuang.

4 25 Setelah netralisasi, dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan cairan (supernatan) dengan padatan (endapan). Sentrifugasi berlangsung selama 30 menit dengan kecepatan putar 4000 rpm. Xilan terkandung dalam supernatan. Etanol ditambahkan ke dalam supernatan untuk memisahkan xilan yang larut di dalamnya. Perbandingan supernatan dengan etanol yang ditambahkan adalah 1:2 (Yoshida et al., 1994). Sebagai tahap akhir, dilakukan pemisahan antara xilan yang diperoleh dengan cairan campuran supernatan-etanol yang tidak ikut mengendap sebagai xilan. 4. Purifikasi Xilan Hemiselulosa A (endapan yang diperoleh dari ekstraksi xilan) dilarutkan dalam aquades (1:12,5 b/v), disentrifuga dengan kecepatan putaran 6000 rpm selama 30 menit. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam NaOH 4 %. Larutan alkali yang mengandung xilan tersebut kemudian disaring untuk memisahkan kotoran-kotoran yang terdapat di dalamnya. Filtrat yang diperoleh diasamkan dengan HCl 6 N hingga ph 4,5-5,0, kemudian dilakukan sentrifuga 4000 rpm selama 30 menit untuk memperoleh endapan (xilan murni) selanjutnya disaring. Xilan dapat didispersikan kembali dalam etanol. 5. Produksi Enzim Xilanase Tahap ini dilakukan untuk mendapatkan enzim xilanase dalam jumlah besar yang akan digunakan untuk hidrolisis xilan menjadi xilooligosakarida. Produksi enzim

5 26 xilanase dilakukan dengan mengikuti prosedur fermentasi fase padat dengan menggunakan kondisi optimum pada penetapan waktu optimum hidrolisis jerami padi. Enzim xilanase diproduksi pada media YM cair dengan komposisi : 4,0 g ekstrak khamir, 10 g ekstrak malt, 15 g glukosa, dan 0,5% xilan birchwood diinkubasi pada suhu ruang selama 15 hari. Sebanyak 7 ose isolat Actinomycetes dimasukkan ke dalam media inokulum. Selanjutnya 100 ml inokulum ditambahkan pada 100 g jerami padi ukuran 1-2 cm. Pemanenan dilakukan pada waktu optimum selama 15 hari dengan menambahkan 1000 ml 0,2 M buffer fosfat ph 7 kemudian diaduk dan disaring dengan menggunakan kertas saring. Filtrat yang diperoleh digunakan sebagai ekstrak kasar enzim xilanase yang akan diukur aktivitasnya. 6. Pengukuran Aktivitas Enzim Xilanase Aktivitas xilanase diujikan dengan substrat birchwood xilan menggunakan reagen DNS (Miller, 1959). Sebanyak 1000 μl substrat 0,5% xilan birchwood ditambahkan 900 μl 0,02 M bufer fosfat ph 7. Kemudian larutan ini ditambahkan 100 μl ekstrak kasar xilanase dihomogenisasi lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit lalu ditambahkan 200 μl pereaksi DNS dan segera dipanaskan pada 100 o C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Sebagai kontrol sebanyak 1000 μl substrat 0,5% xilan birchwood ditambahkan 900 μl 0,02 M bufer fosfat ph 7. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit lalu ditambahkan 100 μl ekstrak kasar xilanase dan 200 μl pereaksi DNS kemudian segera dipanaskan pada 100 o C selama 15 menit dan didinginkan

6 27 pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi masing-masing larutan dilakukan pada λ 540 nm. Satu unit aktivitas xilanase didefinisikan sebagai jumlah μmol xilosa yang dihasilkan permenit untuk setiap ml enzim pada kondisi optimumnya. 7. Pengendapan Xilanase Menggunakan Aseton Ekstrak kasar xilanase dimurnikan dengan diendapkan menggunakan aseton secara bertahap pada konsentrasi 60, 70, 80 dan 90%. Sebanyak 10 ml ekstrak kasar xilanase ditambahkan aseton dingin (disimpan pada suhu C) sedikit demi sedikit sampai tercapai konsentrasi yang diinginkan sambil diaduk perlahan menggunakan pengaduk magnetik (Scopes, 1987). Campuran tersebut disimpan dalam lemari pendingin selama 2 jam, kemudian disentrifuga pada kecepatan 4500 rpm pada suhu 4 0 C selama 15 menit. Endapan protein yang terbentuk diambil dan dilarutkan dalam 0,02 M bufer fosfat ph 7 dengan volume seminimal mungkin (1 ml). Aktivitas yang tinggi menunjukkan persentase konsentrasi aseton yang optimum. 8. Hidrolisis Xilan Sampel xilan yang digunakan sebanyak 5 buah sampel dengan perbandingan 1:3 antara xilan dengan enzim xilanase diinkubasi dalam pada suhu kamar dengan variansi waktu 0 jam, 6 jam, 12 jam, 18 jam, dan 24 jam. Peningkatan jumlah xilooligosakarida yang terbentuk menunjukkan substrat xilooligosakarida telah terhidrolisis dengan waktu inkubasi yang optimum (Safitri, 2007).

7 28 9. Analisis Produk Akhir Xilooligosakarida dengan KCKT 1 ml sampel xilooligosakarida hasil dari hidrolisis xilan kemudian dimasukkan ke dalam tabung vial. Analisis HPLC dilakukan menggunakan kolom karbohidrat (Waters), detektor indeks bias, pelarut metanol, kecepatan alir 1 ml/menit, volume injek 10 µl dan suhu kolom 40 o C. Standar yang digunakan adalah xilosa berkualifikasi pro-analisa.