ASPEK MIKROBIOLOGIS DAGING AYAM BEKU YANG DILALULINTASKAN MELALUI PELABUHAN PENYEBERANGAN MERAK MELANI WAHYU ADININGSIH

Transkripsi

1 ASPEK MIKROBIOLOGIS DAGING AYAM BEKU YANG DILALULINTASKAN MELALUI PELABUHAN PENYEBERANGAN MERAK MELANI WAHYU ADININGSIH SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

2 2 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Aspek Mikrobiologis Daging Ayam Beku yang Dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2009 Melani Wahyu Adiningsih NIM B

3 3 ABSTRACT MELANI WAHYU ADININGSIH. Microbiological Aspect of Frozen Chicken Meat Transported through Merak Port. Under direction of TITIEK SUNARTATIE and USAMAH AFIFF Chicken meat was an ideal medium for many organisms especially bacterias, perishable food and potentially hazardous food. The research was conducted to determine microbiological quality of frozen chicken meat transported through Merak Port. Referring to the technical requirements of microbial contamination in frozen chicken meat issued by National Standardization Agency, the microbial contamination should below 1 x 10 4 cfu/g for total plate count, 5 x 10 1 mpn/g for Escherichia coli, 1 x 10 2 cfu/g for Staphylococcus aureus and should be negative for Salmonella. Fifty three samples of frozen chicken meat were collected during the survey. All samples were subjected to the following examinations: total plate count (TPC), enumerations of E. coli, S. aureus and the presence of Salmonella. The result of this investigations showed that most of the frozen chicken meat transported through Merak Port have average % greater than standard for TPC, % for E. coli, % for S. aureus and 2.775% for Salmonella sp. The result also showed that there was indirect correlation between driver education with E. coli dan S. aureus and vehicle cleanness with E. coli dan Salmonella. Key words : microbial contamination, frozen chicken meat, total plate count, E. coli, S. aureus, Salmonella

4 4 RINGKASAN MELANI WAHYU ADININGSIH. Aspek Mikrobiologis Daging Ayam Beku yang Dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak. Dibimbing oleh TITIEK SUNARTATIE dan USAMAH AFIFF Perkembangan perekonomian dewasa ini makin meningkat, sehingga permintaan bahan pangan yang bernilai gizi tinggi juga makin meningkat. Daging ayam merupakan salah satu bahan makanan yang cukup popular di masyarakat. Selain itu, daging ayam merupakan sumber protein hewani yang baik dan mempunyai banyak kelebihan. Frekuensi daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak sangat tinggi. Selama tahun 2007, jumlah daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak adalah sejumlah kg dengan frekuensi 459 kali. Bahan pangan asal hewan (daging, telur, susu) serta olahannya merupakan media yang sangat baik bagi pertumbuhan mikroba dan menjadikannya sebagai bahan pangan yang mudah rusak. Foodborne disease adalah penyakit yang disebabkan karena agen infeksi dan atau toksin yang masuk ke dalam tubuh melalui makanan. Foodborne disease disebabkan oleh berbagai macam mikroorganisme atau mikroba patogen yang mengkontaminasi makanan, seperti Salmonella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium botulinum, Camphylobacter sp. Dalam proses produksi daging ayam, dapat dipastikan setiap perusahaan menerapkan standar mutu sehingga diharapkan daging ayam yang dihasilkan bebas dari mikroba yang dapat mencemarinya. Tetapi selama proses produksi, yang meliputi pengolahan, pengemasan, transportasi, penyiapan, penyimpanan dan penyajian, daging ayam mungkin terpapar mikroba penyebab infeksi atau intoksikasi. Berdasarkan SNI No tahun 2001 tentang Batas Maksimum Cemaran Mikroba dan Batas Maksimum Residu dalam Bahan Makanan Asal Hewan, disebutkan bahwa jumlah total kuman (Total Plate Count) pada daging ayam beku adalah 1 x 10 4 cfu/g, jumlah bakteri E. coli 5 x 10 1 mpn/g, jumlah bakteri S. aureus 1 x 10 2 cfu/g dan bakteri Salmonella pada daging harus negatif. Semua komoditi pertanian dalam hal ini hewan dan produk hewan yang dilalulintaskan antar area di wilayah Negara Kesatuan Republik Indonesia harus memenuhi beberapa persyaratan yang terkait dengan salah satu tugas karantina di bidang keamanan hayati (pangan) asal hewan. Sehubungan dengan hal itu, penentuan tentang aspek mikrobiologis daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak baik dari segi kuantitatif maupun kualitatif perlu dibuktikan dengan uji laboratorium. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aspek mikrobiologis daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak secara kuantitatif (penghitungan jumlah total kuman, jumlah S. aureus dan jumlah E. coli) dan kualitatif (pengujian keberadaan Salmonella). Penelitian ini dilakukan dari bulan September-Oktober Tempat penelitian dilakukan di Bagian Mikrobiologi

5 5 Medik Departemen IPHK Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP). Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji kuantitatif dan kualitatif yang mengacu kepada Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration, AOAC International. Data yang dihasilkan dari penelitian ini dianalisis secara deskriptif dan dilakukan uji asosiasi x 2 (chi square) untuk mengetahui adanya asosiasi antara aspek mikrobiologis dengan data kondisi daging ayam beku, alat angkut dan profil pengemudi. Daging ayam beku yang diambil sebagai sampel asal dari Jakarta, Bekasi, Bogor dan Serang menunjukkan kemasan yang utuh, rapi dan bersih (100%). Semua sampel dikemas dengan plastik tertutup. Sampel daging ayam beku yang diambil mempunyai warna dan bau khas daging ayam (100%). Alat angkut yang digunakan berupa mobil boks berpendingin dengan suhu rata-rata C. Delapan puluh persen alat angkut yang digunakan dalam kondisi bersih. Pengemudi alat angkut daging ayam beku rata-rata berpendidikan SMP (46.67%), SD (26.67%) dan lulusan SMA (26.67%). Pengetahuan tentang higiene daging, pengemudi dari ke-4 daerah asal 73.33% menyatakan tidak tahu, sementara yang mengaku tahu sebanyak 26.67%. Sampel dari daerah Bogor memiliki rata-rata jumlah total kuman tertinggi, yaitu 1.00 x 10 8 ± 1.50 x 10 7 cfu/g dan jumlah total kuman terendah berasal dari daerah Jakarta yaitu sebesar 3.19 x 10 6 ± 2.13 x 10 6 cfu/g. Berdasarkan standar SNI , rata-rata jumlah total kuman(tpc) sampel daging ayam yang berasal dari Jakarta, Bekasi, Bogor dan Serang semuanya melebihi batas cemaran mikroba yang diperbolehkan ada dalam bahan makanan asal hewan yaitu sebesar 1 x 10 4 cfu/g. Hasil pengujian E. coli dalam daging ayam beku menunjukkan bahwa sampel dari daerah Serang memiliki rata-rata tingkat cemaran tertinggi yaitu sebesar 6.45 ± 2.25 Mpn/g. Sampel dari ke 4 daerah asal secara rata-rata memiliki tingkat cemaran E. coli di bawah batas SNI Hasil analisis terhadap cemaran S. aureus menunjukkan bahwa sampel dari daerah Jakarta memiliki rata-rata tingkat cemaran tertinggi, yaitu sebesar 1.00 x 10 8 ± 2.50 x 10 7 cfu/g dan yang terendah adalah sampel daging ayam beku yang berasal dari daerah Serang yaitu sebesar 9.64x10 2 ± 3.32x10 2 cfu/g. Namun secara rata-rata sampel dari setiap daerah melebihi batas SNI yaitu sebesar 1 x 10 2 cfu/g. Sementara pengujian terhadap keberadaan Salmonella menunjukkan bahwa hanya 2 sampel yang berasal dari daerah Serang yang tercemar Salmonella. Seratus persen sampel daging ayam beku yang berasal dari daerah Bogor memiliki jumlah total kuman (TPC) di atas standar SNI , kemudian berturut-turut diikuti dengan sampel daging ayam beku yang berasal dari daerah Serang (94.4%), Bekasi (63.6%) dan Jakarta (62.5%). Prevalensi sampel daging ayam beku asal daerah Jakarta, Bekasi, Bogor dan Serang dengan cemaran E. coli melebihi batas standar yang diperbolehkan berdasar SNI berturut-turut masing-masing sebesar 31.3%; 27.3% ; 12.5% dan 27.8%.

6 6 Seratus persen sampel daging ayam beku yang berasal dari Serang memiliki cemaran S. aureus melebihi batas yang diperbolehkan berdasarkan SNI Kemudian diikuti sampel daging ayam beku yang berasal dari daerah Jakarta 87.55%, Bogor 62.5% dan Bekasi 54.5%. Sementara sampel daging ayam beku yang tercemar Salmonella hanya berasal dari daerah Serang yaitu sebesar 11.1%. Hubungan antara tingkat cemaran mikroba dengan kondisi daging ayam beku, alat angkut dan profil pengemudi menunjukkan adanya hubungan (p<0.05) antara pendidikan dengan tingkat cemaran E. coli, namun hubungan yang terjadi tidak terlalu besar (0.395). Selain itu dapat juga dilihat adanya hubungan (p<0.05) antara peubah pendidikan dengan jumlah cemaran S. aureus, namun hubungan yang terjadi juga tidak kuat yaitu sebesar Sementara pada peubah pengetahuan tentang higiene daging tidak ditemukan adanya hubungan dengan TPC, E. coli, S. aureus maupun dengan Salmonella, selain itu, terlihat adanya hubungan antara peubah kebersihan alat angkut dengan tingkat cemaran E. coli namun hubungan yang terjadi tidak terlalu besar ( ). Didapatkan juga hubungan (p<0.05) antara peubah kebersihan alat angkut dengan cemaran Salmonella, namun hubungan yang terjadi kurang kuat yaitu sebesar Kata kunci : kontaminasi mikroba, daging ayam beku, jumlah mikroorganisme, E. coli, S. aureus, Salmonella

7 Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk laporan apa pun tanpa izin IPB 7

8 8 ASPEK MIKROBIOLOGIS DAGING AYAM BEKU YANG DILALULINTASKAN MELALUI PELABUHAN PENYEBERANGAN MERAK MELANI WAHYU ADININGSIH Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

9 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : drh. Trioso Purnawarman, M.Si. 9

10 10 Judul Tesis Nama NIM : Aspek Mikrobiologis Daging Ayam Beku yang Dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak : Melani Wahyu Adiningsih : B Disetujui Komisi Pembimbing drh. Titiek Sunartatie, M.S. Ketua drh. Usamah Afiff, M.Sc Anggota Diketahui Ketua Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. drh. Denny Widaya Lukman, M.Si. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S. Tanggal Ujian : 23 Januari 2009 Tanggal Lulus :

11 11 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunianya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2008 ini adalah cemaran mikroba pada daging ayam, dengan judul Aspek Mikrobiologis Daging Ayam Beku yang Dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak. Penghargaan yang setingi-tingginya penulis ucapkan kepada Bapak Kepala Badan Karantina Pertanian beserta jajarannya yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menempuh pendidikan ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada ibu drh. Titiek Sunartatie, M.S. dan bapak drh. Usamah Afiff, M.Sc. selaku komisi pembimbing serta bapak Dr. Drh. Denny Widaya Lukman, M.Si. selaku ketua Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner. Selain itu, terima kasih juga penulis ucapkan kepada bapak drh. Bambang Haryanto, M.M. (Kepala SKH Kelas II Merak) dan bapak drh. Agus Sunanto, M.P. (Kepala BKP Cilegon) yang telah banyak memberikan fasilitas, kemudahan dan saran. Penghargaan penulis sampaikan kepada teman-teman di BKP Cilegon yang penuh pengertian dengan kesibukan penulis selama kuliah di IPB, serta rekan-rekan seperjuangan kelas khusus karantina hewan atas kebersamaan dan kekompakan selama ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak, Ibu dan Ibu Mertua atas segala doanya. Suamiku tercinta mas Aat, permata-permata hatiku Nauval, Nafis dan Shafin atas segala pengertian, kesabaran, doa dan kasih sayangnya. Semoga tesis ini bermanfaat. Bogor, Januari 2009 Melani Wahyu Adiningsih

12 12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Malang pada tanggal 15 Januari 1975 dari ayah Drs. Tiknoadi dan ibu Budi Rahayu. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh penulis pada Program Studi Kedokteran Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, lulus pada tahun Setelah lulus dari FKH UGM, penulis bekerja pada perusahaan swasta hingga tahun Tahun 2004 mengikuti suami, penulis pindah bekerja pada Dinas Pertanian dan Peternakan Provinsi Banten. Sejak tahun 2005, penulis bekerja sebagai Medik Veteriner pada Badan Karantina Pertanian dan ditempatkan di Merak-Cilegon. Tahun 2007, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan S2 pada program studi KMV di Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.

13 13 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... x DAFTAR GAMBAR... xi DAFTAR LAMPIRAN... xii PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Rumusan Masalah... 2 Tujuan Penelitian... 2 Manfaat Penelitian... 3 Hipotesis Penelitian... 3 TINJAUAN PUSTAKA... 4 Daging Ayam... 4 Komposisi Daging Ayam... 4 Aspek Mikrobiologis Daging Ayam... 5 Batas Cemaran... 6 Escherichia coli... 7 Staphylococcus aureus... 9 Salmonella BAHAN DAN METODA Tempat dan Waktu Penelitian Desain Penelitian Alat-Alat Penelitian Bahan-Bahan Penelitian Metode Pengujian Cara Kerja Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Daging Ayam, Alat Angkut dan Profil Pengemudi Pengujian Mikrobiologis Hubungan Tingkat Cemaran Mikroba dengan Kondisi Daging Ayam, Alat Angkut dan Profil Pengemudi SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 51

14 14 DAFTAR TABEL Halaman 1 Spesifikasi persyaratan mutu batas maksimum cemaran mikroba daging Hasil uji Salmonella sp. pada TSIA dan LIA Pembacaan total plate count (TPC)/angka lempeng total (ALT ) Hasil reaksi IMVIC, TSIA dan Urea Reaksi biokimia Salmonella spp Kriteria penentuan non-salmonella spp Kondisi daging ayam, alat angkut dan profil pengemudi Rata-rata jumlah total kuman (TPC), E. coli, S. aureus dan Salmonella dalam daging ayam beku berdasarkan daerah asal Prevalensi jumlah sampel yang mengandung cemaran mikroba melebihi batas SNI Hubungan tingkat cemaran mikroba terhadap pendidikan, pengetahuan dan kebersihan alat angkut... 43

15 15 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Escherichia coli. Pewarnaan Gram Staphylococcus aureus. Pewarnaan Gram Salmonella. Pewarnaan Gram Rataan jumlah total kuman (TPC), E. coli, S. aureus dan Salmonella per daerah asal Prevalensi jumlah sampel yang mengandung cemaran mikroba melebihi batas SNI

16 16 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Kuisioner aspek mikrobiologis daging ayam yang dilalulintaskan melalui pelabuhan penyeberangan Merak Analisa statistik deskriptif prevalensi total kuman (TPC), E. coli, S. aureus dan Salmonella per daerah asal Analisa statistik deskriptif rataan jumlah total kuman (TPC), E. coli, S. aureus dan Salmonella per daerah asal Crosstab pendidikan terhadap TPC Crosstab pendidikan terhadap E. coli Crosstab pendidikan terhadap Salmonella Crosstab pendidikan terhadap S. aureus Crosstab pengetahuan terhadap TPC Crosstab pengetahuan terhadap E. coli Crosstab pengetahuan terhadap Salmonella Crosstab pengetahuan terhadap S. aureus Crosstab kebersihan terhadap TPC Crosstab kebersihan terhadap E. coli Crosstab kebersihan terhadap Salmonella Crosstab kebersihan terhadap S. aureus... 73

17 17 PENDAHULUAN Latar Belakang Perkembangan perekonomian dewasa ini makin meningkat, sehingga permintaan bahan pangan yang bernilai gizi tinggi juga makin meningkat (Soedjana 1996). Daging ayam merupakan salah satu bahan makanan yang cukup popular di masyarakat. Daging unggas (ayam) merupakan sumber protein hewani yang baik dan mempunyai kelebihan-kelebihan antara lain: mengandung asam amino lebih komplit daripada daging sapi, termasuk daging putih dan disukai oleh banyak konsumen, harganya relatif lebih murah dibandingkan daging sapi sehingga lebih terjangkau masyarakat, dan lebih sedikit mengandung kolesterol (Palupi 1986). Frekuensi daging ayam yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak sangat tinggi, terutama dari Pulau Jawa ke Pulau Sumatera. Selama tahun 2007, jumlah daging ayam yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak adalah sejumlah kg dengan frekuensi 459 kali. Daging ayam tersebut berasal dari daerah Bekasi, Bogor, Cianjur, Cibitung, Jakarta dan Serang. Sementara daerah tujuannya adalah Jambi, Lampung, Medan, Padang, Palembang, Pekanbaru, Aceh, Bangka, Bengkulu dan kota-kota besar lainnya di Pulau Sumatera (Anonim 2007). Bahan pangan asal hewan (daging, telur, susu) serta olahannya merupakan media yang sangat baik bagi pertumbuhan mikroba dan menjadikannya bahan pangan yang mudah rusak. Cemaran mikroba dalam bahan pangan asal hewan serta olahannya merupakan masalah yang menjadi perhatian utama dari konsumen, baik di negara maju maupun di negara berkembang (Syukur 2006). Foodborne disease adalah penyakit yang disebabkan karena agen infeksi dan atau toksin yang masuk ke dalam tubuh melalui makanan (WHO 2009). Foodborne disease disebabkan oleh berbagai macam mikroorganisme atau mikroba patogen yang mengkontaminasi makanan, seperti Salmonella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium botulinum, Camphylobacter sp.

18 18 Dalam proses produksi daging ayam, dapat dipastikan setiap perusahaan menerapkan standar mutu sehingga diharapkan daging ayam yang dihasilkan bebas dari mikroba yang dapat mencemarinya. Tetapi selama proses produksi, yang meliputi pengolahan, pengemasan, transportasi, penyimpanan, penyiapan dan penyajian, daging ayam mungkin terpapar mikroba penyebab infeksi atau intoksikasi. Pencemaran mikroba selama proses pendistribusian dapat terjadi karena faktorfaktor seperti: tidak dihidupkannya pendingin udara pada angkutan pembawa ataupun suhu yang tidak sesuai, alat angkut yang kurang bersih, kemasan yang tidak tertutup rapat atau kotor, sehingga mengakibatkan daging ayam tersebut mudah tercemar mikroba patogen. Rumusan Masalah Berdasarkan SNI No tahun 2001 tentang Batas Maksimum Cemaran Mikroba dan Batas Maksimum Residu dalam Bahan Makanan Asal Hewan, disebutkan bahwa jumlah total kuman (Total Plate Count) pada daging ayam adalah 1 x 10 4 cfu/g, jumlah bakteri E. coli 5 x 10 1 mpn/g, jumlah bakteri S. aureus 1 x 10 2 cfu/g dan bakteri Salmonella pada daging harus negatif. Semua komoditi pertanian dalam hal ini hewan dan produk hewan yang dilalulintaskan antar area di wilayah Negara Kesatuan Republik Indonesia harus memenuhi beberapa persyaratan yang terkait dengan salah satu tugas karantina di bidang keamanan hayati (pangan) asal hewan. Sehubungan dengan itu, penentuan tentang aspek mikrobiologis daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak baik dari segi kuantitatif maupun kualitatif perlu dibuktikan dengan uji laboratorium. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aspek mikrobiologis daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak secara kuantitatif yang meliputi penghitungan jumlah total kuman (TPC), jumlah E. coli dan jumlah S. aureus serta secara kualitatif yaitu keberadaan Salmonella.

19 19 Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai bahan pertimbangan dalam menentukan kebijakan terhadap kegiatan lalu lintas daging ayam beku antar area. Hipotesis Penelitian Aspek mikrobiologis daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak dari segi kuantitatif yang meliputi penghitungan jumlah total kuman (TPC), jumlah E. coli dan jumlah S. aureus serta secara kualitatif yaitu keberadaan Salmonella masih dalam batas maksimum cemaran mikroba yang diizinkan atau direkomendasikan dalam bahan makanan asal hewan.

20 20 TINJAUAN PUSTAKA Daging Ayam Karkas broiler adalah ayam yang telah dipotong dan dibersihkan bulunya, tanpa kepala, leher, kaki dan jerohan (Siregar et al. 1982). Menurut Standar Nasional Indonesia (SNI), karkas ayam pedaging adalah bagian dari ayam pedaging hidup setelah dipotong, dicabuti bulunya, dikeluarkan jeroan dan lemak abdominalnya, dipotong kepala dan leher serta kedua kakinya (SNI 1995). Daging unggas dapat berasal dari ayam jantan dewasa (cock), ayam atau kalkun betina dewasa (hen), kalkun jantan dewasa (tom), ayam kastrasi (capon) dan anak ayam (chick). Berdasarkan penanganannya, karkas ayam dapat dibedakan menjadi karkas segar, karkas dingin segar dan karkas beku (Soeparno 1992). SNI (1995) menyatakan bahwa menurut cara pemotongannya, dapat dibedakan menjadi karkas utuh, potongan separuh (halves), potongan seperempat (quarters), potongan bagian-bagian badan (chicken part atau cut put), dan debond yaitu karkas ayam pedaging tanpa tulang atau tanpa kulit dan tulang. Sementara berdasarkan cara penanganannya, dibedakan menjadi karkas segar (karkas segar yang baru selesai diproses selama tidak lebih dari 6 jam dan tidak mengalami perlakuan lebih lanjut), karkas dingin segar (karkas segar yang segera didinginkan setelah selesai diproses sehingga suhu di dalam daging menjadi antara C) dan karkas beku (karkas yang telah mengalami proses pembekuan cepat atau lambat dengan suhu penyimpanan antara C sampai dengan C. Komposisi Daging Ayam Menurut Mountney (1983), daging ayam merupakan sumber protein yang baik, berkualitas tinggi, mudah dicerna dan mengandung asam amino esensial yang sangat dibutuhkan dalam makanan manusia, yang terdiri dari arginin, sistin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, tirosin dan valin. Komposisi daging ayam menurut Cambell dan Lasley (1975) yang dikutip Anggorodi (1979) terdiri dari 73.7% air, 20.6% protein, 4.7% lemak dan 1%

21 21 abu. Forrest et al. (1975) menyatakan bahwa kandungan mineral pada daging ayam adalah 4% yang terdiri dari sodium, potasium, magnesium, kalsium, besi, fosfat, sulfur, klorida dan yodium. Aspek Mikrobiologis Daging Ayam Bahan mentah asal unggas seringkali terkontaminasi oleh mikroba patogen penyebab foodborne diseases seperti Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Campylobacter fetus subsp. jejuni dan Yersinia enterocolitica. Beberapa laporan surveilans penyakit menyebutkan bahwa daging unggas berperan sebagai vehicles dalam outbreaks salmonellosis, staphylococcal food poisoning, C. perfringens enteritis dan gangguan pencernaan lainnya (ICMFS 1986). Menurut Quinn et al. (2002), foodborne diseases yang disebabkan oleh organisme dapat dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu infeksi makanan dan keracunan makanan. Infeksi makanan terjadi karena mengkonsumsi makanan yang mengandung organisme hidup yang mampu berkembang biak di dalam usus, dan menimbulkan penyakit. Organisme penting yang menimbulkan infeksi makanan meliputi C. perfringens, Vibrio parahaemolyticus, dan sejumlah Salmonella. Sebaliknya, keracunan makanan tidak disebabkan tertelannya organisme hidup, melainkan akibat masuknya toksin atau substansi beracun yang disekresikan ke dalam makanan. Organisme penghasil toksin tersebut mungkin mati setelah pembentukan toksin dalam makanan. Organisme yang menyebabkan keracunan makanan meliputi S. aureus, C. botulinum, dan Bacillus cereus. Awal kontaminasi pada daging berasal dari mikroorganisme yang memasuki peredaran darah pada saat penyembelihan dikarenakan alat-alat yang dipergunakan untuk pengeluaran darah tidak bersih/higienis sementara darah masih bersirkulasi selama beberapa saat setelah penyembelihan. Cara lain bagi mikroorganisme untuk masuk ke dalam karkas/daging ayam adalah proses perendaman yang diperlukan untuk menghilangkan (mencabut) bulu pada ayam. Pada kasus ini kontaminasi terjadi karena masuknya kontaminan dari air perendam ke sistem peredaran darah dan pernafasan (Dirjennak 1992).

22 22 Kontaminasi selanjutnya terjadi melalui permukaan daging selama proses mempersiapkan daging, yaitu proses pembelahan karkas, pendinginan, pembekuan, penyegaran daging beku, pemotongan karkas, pembuatan produk daging olahan, pengawetan, pengepakan, penyimpanan dan pemasarannya (Soeparno 1992). Proses pengeluaran jeroan memberikan banyak kesempatan bagi kontaminasi bakteri baik dari usus maupun feses yang dapat dipindahkan dari karkas ke karkas melalui pisau, peralatan lain (kapak), dan tangan pekerja. Kontaminan tidak hanya terdapat pada bagian luar karkas, tetapi juga pada permukaan rongga karkas (Dirjennak 1992). Batas Cemaran Standar Nasional Indonesia (SNI) No tahun 2001 menyebutkan tentang Spesifikasi Persyaratan Mutu Batas Maksimum Cemaran Mikroba pada Daging yang diperbolehkan ada dalam daging seperti yang terlihat dalam Tabel 1. Tabel 1 Spesifikasi persyaratan mutu batas maksimum cemaran mikroba pada daging Jenis Cemaran Mikroba Batas Maksimum Cemaran Mikroba (BMCM) (cfu/g) Daging Segar/Beku Daging Tanpa Tulang a. Jumlah Total Kuman (Total Plate Count) b. Coliform c. Escherichia coli d. Enterococci e. Staphylococcus aureus f. Clostridium sp. g. Salmonella sp. h. Camphylobacter sp. i. Listeria sp. Sumber: SNI x x x x x negatif x x x x x negatif 0 0 Escherichia coli

23 23 E. coli pertama kali diuraikan oleh seorang ilmuwan bernama Theodor Escherich pada tahun 1885 dengan nama Bacterium coli commune yang diisolasi dari feses seorang bayi (Todar 2008a). E. coli merupakan bakteri Gram negatif, dapat tumbuh dalam non-enriched media, bersifat oksidase positif, fakultatif anaerob, memfermentasi glukosa dan mengubah nitrat menjadi nitrit. Selain itu, E. coli kebanyakan motil dilengkapi dengan peritrichous flagella dan kadang fimbriae. E. coli memfermentasi laktosa dengan menghasilkan koloni berwarna merah muda pada agar Mac Conkey dan menghasilkan reaksi biokimia yang karakteristik pada tes IMViC (Quinn et al. 2002). Strain enteroinvasive E. coli (EIEC) memfermentasi laktosa dengan lambat atau tidak memfermentasi laktosa dan tidak motil. Gambar 1 Escherichia coli. Pewarnaan Gram. Sumber: Todar (2008a) Dalam bidang mikrobiologi pangan, dikenal istilah bakteri indikator sanitasi. Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadaannya dalam pangan menunjukkan bahwa pangan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia dan atau hewan, karena bakteri-bakteri tersebut lazim terdapat dan hidup pada usus manusia. Jadi adanya bakteri tersebut pada pangan menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan pangan tersebut pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia dan hewan. Sampai saat ini ada 3 jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi yaitu E. coli, kelompok Streptococcus (Enterococcus) fekal dan C. perfringens (Hariyadi 2005).

24 24 Menurut Brooks et al. (2005), E. coli merupakan mikroflora alami yang terdapat pada saluran pencernaan manusia dan hewan. Beberapa galur E. coli yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia adalah enteropathogenic E. coli (EPEC) enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), dan enteroaggregative E. coli (EAEC). EPEC merupakan penyebab penting diare pada bayi, khususnya di negara berkembang. EPEC melekat pada sel mukosa usus kecil. Faktor yang berhubungan dengan kromosom mendukung perlekatan yang erat. Terjadi kehilangan mikrovili (effacement), pembentukan filamentous actin atau struktur seperti cangkir dan biasanya EPEC masuk ke dalam mukosa usus. Akibat dari infeksi EPEC adalah diare yang cair, yang biasanya susah diatasi namun tidak kronis. Diare yang disebabkan oleh EPEC berhubungan dengan berbagai serotipe spesifik dari E. coli. ETEC merupakan penyebab diare pada wisatawan yang mengunjungi negara yang standar higienitas makanan dan air minum lebih rendah dari negara asalnya. Selain itu juga merupakan penyebab penting diare pada bayi di negara berkembang. Beberapa strain ETEC memproduksi eksotoksin yang sifatnya labil terhadap panas (LT, BM ) di bawah kontrol plasmid. Beberapa strain ETEC menghasilkan enterotoksin yang stabil terhadap panas (Sta, BM ) di bawah kontrol genetika dari beragam kelompok plasmid. EHEC memproduksi verotoksin. Nama toksin didasarkan pada efek sitotoksik pada sel vero, yang merupakan biakan sel ginjal monyet hijau di Afrika. EHEC banyak dihubungkan dengan hemorrhagic colitis, sebuah diare yang parah dengan sindroma uremic hemolytic, sebuah penyakit akibat kegagalan ginjal akut, microangiopathi hemolytic anemia dan thrombocopenia. E. coli 0157:H7 akhirakhir ini diketahui merupakan bakteri patogen penyebab foodborne disease. EIEC menyebabkan penyakit yang mirip dengan shigellosis. Penyakit yang terjadi umumnya pada anak di negara berkembang. EIEC menyebabkan penyakit dengan menyerang sel epitelial mukosa usus. Menurut Brooks et al. (2005), EAEC menyebabkan diare yang akut dan kronis dalam jangka waktu > 14 hari pada orang di negara berkembang. Organisme ini juga

25 25 dapat menyebabkan foodborne disease di negara industri. Patogenesis EAEC sebagai penyebab diare disebabkan karena EAEC melekat pada mukosa intestinal dan menghasilkan enterotoksin dan sitotoksin. Akibatnya adalah pengeluaran sejumlah besar mukus dan terjadinya diare. Staphylococcus aureus S. aureus ditemukan pertama kali di Aberdeen, Skotlandia pada tahun 1880 oleh seorang ahli bedah yang bernama Sir Alexander Ogston (Todar 2008c). S. aureus merupakan salah satu mikroflora normal pada unggas dan ternyata praktek pengolahan yang baik tidak sepenuhnya menjamin dapat mencegah kontaminasi oleh S. aureus. Meskipun demikian, Staphylococci tidak mampu bersaing dengan baik melawan mikroba pembusuk normal lainnya yang terdapat pada unggas dan tidak mungkin berkembangbiak pada karkas beku. Adanya S. aureus dalam daging ayam menunjukkan kontaminasi melalui alat/mesin pencabut bulu (ICMFS 1986). S. aureus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk kokus yang tersusun dalam kluster yang tidak teratur jika ditumbuhkan dalam media padat. Menurut Todar (2008c), S. aureus bersifat fakultatif anaerob dan berbentuk kluster seperti anggur, besar, bulat, koloni berwarna kuning keemasan, kadang menyebabkan hemolisis jika ditumbuhkan pada agar darah dan bersifat katalase positif. S. aureus terdapat pada rongga hidung, kulit, tenggorokan, dan saluran pencernaan manusia dan hewan. Bahan makanan yang disiapkan menggunakan tangan, seperti penyiapan sayuran mentah untuk salad, berpotensi terkontaminasi S. aureus. Jenis makanan lain yang sering terkontaminasi oleh S. aureus adalah daging dan produk daging, ayam, telur, salad (telur, tuna, ayam, kentang, dan makaroni), produk bakery, pastry, pai, sandwich, serta susu dan produk susu (Calnek et al. 1997).

26 26 Gambar 2 Staphylococcus aureus. Pewarnaan Gram. Sumber: Todar (2008c) Staphylococcal food poisoning (SFP) merupakan penyebab utama gastroenteritis di seluruh dunia. Penyebab utamanya adalah genus Staphylococcus terutama S. aureus yang menghasilkan staphylococcal enterotoxins (SEs) yang tahan panas dalam makanan yang terkontaminasi oleh S. aureus (Doyle et al. 2001). Menurut Shah (2003), S. aureus menghasilkan 2 tipe toksin yaitu enterotoksin (6 serotipe; A, B, C, D, E, dan G) serta toxic shock syndrome toxin (TSSI-1). Enterotoksin bertanggung jawab terhadap SFP, sementara TSST-1 bertanggung jawab terhadap toxic shock syndrome (TSS). Salmonella Genus Salmonella pertama kali diperkenalkan oleh Daniel Elmer Salmon seorang ahli patologi Amerika. Sementara yang menemukan bakteri yang menyebabkan hog cholera (Salmonella enterica var. Choleraesuis) ini sesungguhnya adalah Theobald Smith (Todar 2008b). Salmonella merupakan bakteri berbentuk batang langsing, tidak membentuk spora dan bersifat Gram negatif. Sampai sekarang dikenal lebih dari serotipe Salmonella yang semuanya bersifat patogen, dimana beberapa serotipe mempunyai induk semang spesifik. Salmonella thyposa dan S. paratyphi menyerang manusia dan menimbulkan tanda-tanda gangguan pencernaan serta demam tifus dan paratifus. S. dublin menyerang ternak sapi, S. abortus equi

27 27 menyerang kuda, S. Typhimurium terutama menyerang itik dan rodensia, sedangkan S. pullorum dan S. gallinarum menyerang ayam (Anonim 2004). Gambar 3 Salmonella. Pewarnaan Gram. Sumber: Todar (2008) Menurut Hariyadi (2005), Salmonella merupakan bakteri indikator keamanan pangan, artinya karena semua serotipe Salmonella yang diketahui di dunia ini bersifat patogen maka adanya bakteri ini dalam pangan dianggap membahayakan kesehatan. Selain bahan makanan, Salmonella memerlukan kondisi seperti suhu, ph dan kelembaban yang sesuai untuk hidup dan berkembang biak. Salmonella dapat tumbuh antara suhu 6,7 0 C 45 0 C, sedangkan suhu optimum untuk berkembang biak adalah 37 0 C (Frazier 1978). Menurut Christie dan Christie (1977) kuman Salmonella berhenti berkembang biak pada suhu 5 0 C, sedangkan pada suhu 55 0 C masih dapat hidup selama 1 jam dan pada suhu 60 0 C selama menit, kecuali S. senftenberg baru akan mati pada suhu 71,1 0 C. Frazier (1978) menyatakan bahwa Salmonella dalam daging ayam tidak berkembang biak pada suhu C C, sedangkan pada masakan salad daging babi dan dalam custard (campuran susu, telur dan gula yang dimasak) Salmonella masih dapat berkembang biak pada suhu di atas 10 0 C. Menurut Brooks et al. (2005), Salmonella menyebabkan 3 tipe penyakit utama pada manusia yaitu demam enterik (demam typhoid), bakteremia dengan luka fokal dan enterokolitis. Enterokolitis merupakan manifestasi infeksi Salmonella yang wajar. Di Amerika Serikat, S. Typhimurium dan S. Enteritidis terkenal sebagai penyebab enterokolitis, namun enterokolitis dapat disebabkan oleh sebagian dari

28 grup I serotipe Salmonella. Delapan sampai 48 jam sesudah menelan Salmonella, ada nausea (mual), sakit kepala, muntah dan diare. Habitat utama kuman Salmonella pada tubuh penderita adalah di dalam saluran pencernaan. Selain dari pada itu kuman Salmonella juga dapat ditemukan pada bagian tubuh lainnya dari penderita, seperti kelenjar limfe, limpa, hati, empedu, jantung, paru-paru, urat daging, sumsum tulang dan periosteum. Kuman Salmonella yang menyerang alat reproduksi pada hewan dapat menyebabkan abortus khususnya pada unggas akan menginfeksi ovarium dan ovanya (Hoeden 1973). Menurut Todar (2008b), habitat utama Salmonella adalah di dalam saluran pencernaan manusia dan hewan. Serovar Salmonella lebih sering ditemukan pada host tertentu tapi dapat pula ubiquitous (non-host adapted). Typhi dan Parathypi A merupakan serovar yang secara tegas menginfeksi manusia dan menyebabkan penyakit serius yang sering dihubungkan dengan serangan pada pembuluh darah. Pada kasus ini salmonellosis ditularkan melalui kontaminasi feses dalam air ataupun makanan. Kuman Salmonella yang menyerang unggas adalah S. pullorum, S. gallinarum dan S. Typhimurium. Infeksi Salmonella pada manusia bervariasi tergantung oleh serovar, strain, dosis infeksi, jenis makanan yang terkontaminasi dan status host. Beberapa serovar sangat patogen namun beberapa serovar tidak diketahui virulensinya. Dosis infeksi oral sekurang-kurangnya 10 5 sel S. Typhi untuk menimbulkan typhoid pada 50% penderita, sedangkan sedikitnya 10 9 sel S. Typhimurium dibutuhkan untuk dapat menimbulkan gejala infeksi (Todar 2008b). Sumber penularan dan penyebaran Salmonella terutama dari penderita baik hewan maupun manusia. Penderita salmonellosis akan menyebarkan kuman Salmonella lewat ekskresi berupa tinja yang selanjutnya akan menyebar dan mencemari lingkungan, alat pakan, benda-benda lain di sekitar unggas dan bahan makanan tersebut. Foodborne Salmonella toxic infections disebabkan oleh serovar Salmonella yang ubiquitous (seperti S. Typhimurium). Dua belas sampai dua puluh empat jam setelah ingesti makanan terkontaminasi (mengandung sejumlah Salmonella), gejala

29 29 akan muncul (diare, muntah dan demam) dan akan berakhir 2-5 hari. Salmonella dihubungkan dengan bermacam-macam makanan. Daging yang terkontaminasi (sapi, babi, kambing, ayam) dapat berasal dari salmonellosis pada hewan asalnya, tetapi seringkali dihasilkan dari kontaminasi pada daging dengan isi usus selama proses eviserasi, pencucian dan transportasi karkas (Todar 2008b).

30 30 BAHAN DAN METODA Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan dari bulan September-Oktober Tempat penelitian dilakukan di Bagian Mikrobiologi Medik Departemen IPHK Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP). Desain Penelitian Bahan penelitian berupa daging ayam beku yang dilalulintaskan melalui Pelabuhan Penyeberangan Merak pada Balai Karantina Pertanian Kelas II Cilegon- Banten. Untuk memperoleh informasi tentang kondisi daging ayam beku, alat angkut dan profil pengemudi dilakukan wawancara (kuesioner) dan pengamatan langsung pada saat pengambilan sampel (Lampiran 1). Data yang dikumpulkan dalam penelitian ini adalah pendidikan, pengetahuan tentang higiene daging, daerah asal daging, kemasan, warna daging, bau daging, kebersihan alat angkut dan suhu ruangan dalam alat angkut. Pendidikan pengemudi dikategorikan sebagai tamat SD, SMP dan SMA. Pengetahuan higiene daging dikategorikan sebagai tahu dan tidak tahu. Daerah asal daging dikategorikan berasal dari Bekasi, Jakarta, Bogor dan Serang. Warna daging dikategorikan sebagai warna yang menyimpang dan warna normal daging ayam. Bau daging dikategorikan sebagai bau yang menyimpang dan bau normal daging ayam. Kebersihan ruang pendingin dikategorikan bersih atau tidak. Suhu ruangan alat angkut dikategorikan suhu yang dipersyaratkan untuk menyimpan daging ayam beku atau tidak. Pengambilan sampel ditentukan dengan menggunakan metode random sederhana dan proporsional, sedangkan untuk menghitung besaran sampel menggunakan rumus:

31 31 n = 4 PQ L 2 Keterangan: n = besaran sampel yang digunakan P = asumsi prevalensi Q = (1 P) L = galat yang diinginkan (Thrusfield 2005) Dengan tingkat konfidensi 95% dan galat yang diinginkan 0,05 serta asumsi prevalensi untuk TPC 98.2%, E. coli 3.4%, Salmonella 3.4% dan S. aureus 2%, maka didapat: n = 4 x x (0.05) 2 = 28 sampel untuk pemeriksaan TPC n = 4 x x (0.05) 2 = 53 sampel untuk pengujian E. coli n = 4 x x (0.05) 2 = 53 sampel untuk pengujian Salmonella n = 4 x 0.02 x 0.98 (0.05) 2 = 31 sampel untuk pemeriksaan S. aureus Alat-Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu cawan petri, pipet serologi 1 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, tabung reaksi steril, inkubator 35 ±1 0 C, stomacher, penangas air, gunting stainless, gelas ukur 250 ml, pinset, plastik timbang steril, botol media, jarum inokulasi (ose), pembakar/bunsen, ph meter, timbangan, pengocok tabung (vortex mixer), autoclave, lemari steril (clean bench), lemari pendingin (refrigerator) dan freezer.

32 32 Bahan-Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan berupa Plate Count Agar (PCA), Buffered Peptone Water (BPW), Triphenil Tetrazolium Chloride (TTC) 1%, Lauryl Trypthose Broth (LTB), Escherichia coli Broth (EC Broth), Eosin Methylen Blue Agar (EMBA), Baird Parker Agar (BPA), Rappaport Vassiliadis Broth (RVB), Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA), Lactose Broth (LB), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Hektoen Enteric Agar (HEA), Lysine Iron Agar (LIA), Simmons Citrate Agar (SCA), Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Tetrathionate Broth (TTB), Urea Broth, Indikator Methyl Red, Sulphite Indol Motility (SIM) Medium, Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP) Broth, Reagents Kovacs, α-naphtol, KOH 40%, kreatinin, kapas, zat warna Gram, NaCl fisiologis dan Alkohol 70%. Metode Pengujian Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini adalah uji kuantitatif dan kualitatif yang mengacu kepada Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration, AOAC International (BAM 2006). Cara Kerja Penghitungan Angka Lempeng Total (ALT) Prinsip : Sampel daging ayam ditumbuhkan pada media agar, maka apabila sampel tersebut mengandung mikroorganisme akan tumbuh koloni yang dapat dihitung. Cara Kerja : 25 gram sampel ditimbang secara aseptik kemudian dimasukkan dalam plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan BPW dan di stomacher selama 1-2 menit dengan kecepatan 230 rpm. Sebanyak 1 ml suspensi dipindahkan dengan pipet steril ke dalam 9 ml larutan BPW untuk mendapatkan pengenceran Dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3, 10-4 dan seterusnya sesuai kebutuhan sampel.

33 33 Sebanyak 1 ml suspensi diambil dengan menggunakan pipet steril dari setiap pengenceran di atas, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Dilakukan duplo untuk setiap pengenceran. Ditambahkan ml PCA yang sudah didinginkan sampai suhu C dan telah ditambahkan 1% larutan TTC ke masing-masing cawan yang sudah berisi larutan sampel. Supaya larutan sampel dan media PCA tercampur seluruhnya dilakukan pemutaran cawan membentuk angka delapan. Dibiarkan sampai memadat. Diinkubasikan pada suhu 36 ± 1 0 C selama jam dengan meletakkan cawan petri pada posisi terbalik. Kemudian dihitung cawan-cawan yang mempunyai jumlah koloni Pengujian Escherichia coli Prinsip Bakteri Coliform termasuk bakteri Gram negatif, aerob sampai fakultatif anaerob, dapat memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas pada suhu 36 ±1 0 C selama 48 jam. Cara Kerja Uji Dugaan : Sebanyak 25 gram sampel ditimbang secara aseptik, kemudian dimasukkan dalam plastik steril. Ditambahkan 225 ml larutan BPW dan di stomacher selama 1-2 menit dengan kecepatan 230 rpm. Sebanyak 1 ml suspensi dipindahkan dengan pipet steril ke dalam 9 ml larutan BPW untuk mendapatkan pengenceran Dengan cara yang sama dibuat pengenceran Sebanyak 1 ml suspensi diambil dengan pipet steril dari setiap pengenceran 10-1 s/d Dimasukkan ke dalam tabung LTB yang berisi tabung Durham. Setiap pengenceran dimasukkan ke dalam 3 tabung LTB (triplo). Ke-9 tabung diinkubasikan selama 48 ± 2 jam.

34 34 Cara Kerja Uji Penegasan E. coli : Biakan positif pada uji pendugaan dipindahkan dengan menggunakan jarum inokulasi dari setiap tabung LTB ke dalam tabung EC Broth yang berisi tabung Durham. Kemudian EC Broth yang telah diinokulasi diinkubasikan suhu 45 0 C 48 ± 2 jam. Gas yang terbentuk diperhatikan selama 48 ± 2 jam. Dari tabung EC Broth yang positif, dibuat goresan pada agar L-EMB dengan menggunakan jarum inokulasi diameter 3 mm. Biakan pada agar L-EMB diinkubasikan pada suhu 36 ± 1 0 C selama jam. Koloni tersangka diperhatikan yaitu warna hitam/gelap pada bagian pusat koloni dengan/tanpa warna metalik kehijauan. Dengan menggunakan jarum inokulasi, koloni tersangka diambil dari masing-masing Agar L-EMB dan dipindahkan ke PCA (agar miring) yang digunakan untuk uji biokimia. Agar miring tersebut diinkubasikan pada suhu 36 ± 1 0 C selama jam. Dilakukan uji biokimia berupa uji IMVIC, TSIA dan Urea. Uji Biokimia Uji Indol a) Tabung SIM diinokulasikan dengan biakan dari tabung PCA dan diinkubasikan pada suhu 35 ± 1 º C selama 24 jam ± 2 jam. b) Uji Indol dengan ditambahkan 0,2-0,3 ml Reagen Kovacs. c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media. d) Hasil uji negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. Uji Voges-Proskauer (VP) a) Biakan dari tabung PCA diinokulasikan ke tabung yang berisi 10 ml media MR-VP dan inkubasi pada temperatur 35 ± 1 º C selama 48 jam ± 2 jam. b) Sebanyak 5 ml MR-VP dipindahkan ke tabung reaksi dan ditambahkan 0.6 ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40%, kemudian digoyang-goyang sampai tercampur dan didiamkan.

35 35 c) Hasil uji positif apabila ada warna merah muda eosin dalam waktu 2 jam. Uji Methyl Red (MR) a) Sebanyak 5 ml media MR-VP diinkubasikan kembali pada suhu 36 ± 1 º C selama 48 jam ± 2 jam. b) Ditambahkan 2 tetes indikator Methyl Red pada setiap tabung. c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya warna merah. d) Hasil uji negatif ditandai dengan adanya warna kuning. Uji Citrat (Simmons Citrate Agar) a) Tabung media Simmons Citrate Agar diinokulasikan dengan biakan dari tabung PCA dengan menggunakan jarum inokulasi. b) Diinkubasi pada temperatur 36 ± 1 º C selama 96 jam. c) Penggunaan inokulum terlalu banyak akan menyebabkan nutrien lain terbawa. d) Hasil uji positif ditandai dengan perubahan warna media menjadi biru. d) Hasil uji negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna media. Pengujian Salmonella Prinsip Pertumbuhan Salmonella pada media selektif dengan pra pengayaan (preenrichment), dan pengayaan (enrichment) dan dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi. Pra-pengayaan a) Sebanyak 25 g sampel ditimbang, kemudian dimasukkan dalam plastik steril dan ditambahkan 225 ml Lactose Broth (LB) kemudian di stomacher selama ± 2 menit dengan kecepatan 230 rpm. b) phnya dicek, bila < 6,6 sesuaikan sampai 6,8 ± 2 dengan menambahkan NaOH 1 N steril. c) Diinkubasikan pada temperatur 36±1 º C selama 24 jam.

36 36 Pengayaan a) Biakan pra-pengayaan diaduk perlahan kemudian diambil dan dipindahkan masing-masing 1 ml ke dalam 10 ml media TTB, sedangkan untuk media RV dipindahkan 0,1 ml ke dalam 10 ml media RV. b) Sampel dengan dugaan cemaran Salmonella spp. tinggi (high microbial load) : Media RV diinkubasikan pada temperatur 42 0 C ± 0.2 º C selama 24 jam ± 2 jam. Untuk media TTB diinkubasikan pada temperatur 43 º C ± 0.2 º C selama 24 jam ± 2 jam. c) Sampel dengan dugaan cemaran Salmonella spp. rendah (low microbial load): Media RV diinkubasikan pada temperatur 42 0 C ± 0.2 º C selama 24 jam ± 2 jam. Untuk media TTB diinkubasikan pada temperatur 35 0 C ± 2 º C selama 24 jam ± 2 jam. Isolasi dan Identifikasi a) Masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasikan diambil dengan menggunakan jarum ose dan diinokulasikan pada media HE, XLD dan BSA. Kemudian diinkubasikan pada temperatur 35 º C selama 24 jam ± 2 jam. Untuk BSA apabila belum jelas dapat dinkubasikan lagi selama 24 jam ± 2 jam. b) Koloni Salmonella diamati pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H 2 S). c) Pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam. d) Pada media BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam. e) Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga media tersebut. Masing-masing diinokulasikan ke TSIA dan LIA dengan cara menusukkan ke dasar media agar, selanjutnya digores pada bagian miring. c) Diinkubasikan pada temperatur 35 º C selama 24 jam ± 2 jam. Koloni spesifik Salmonella diamati dengan hasil reaksi seperti tercantum pada Tabel 2.

37 37 Tabel 2 Hasil Uji Salmonella pada TSIA dan LIA Media Bagian Miring (Slant) Bagian Dasar (Butt) H 2 S Gas TSIA Alkalin / K (merah) Asam / A (kuning) Positif (hitam) Negatif/ positif LIA Alkalin / K (ungu) Alkalin / K (ungu) Positif (hitam) Negatif/ Positif Uji Biokimia Uji Urease a) Koloni dari media TSIA yang menciri Salmonella diinokulasi dengan ose ke Urea Broth. b) Kemudian diinkubasikan pada temperatur 35 º C selama 24 jam ± 2 jam. c) Hasil uji spesifik Salmonella adalah negatif uji urease. Uji Indol a) Koloni dari media TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan 1 ose ke dalam media SIM dan diinkubasikan pada temperatur 35 º C selama 24 jam ± 2 jam. b) Ditambahkan 0,2 ml sampai dengan 0,3 ml Reagen Kovacs. c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya cincin merah di permukaan media. d) Hasil uji negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. e) Hasil uji spesifik Salmonella adalah negatif uji Indol. a. Uji Voges-Proskauer (VP) a) Dari media TSIA yang menciri Salmonella diambil biakan dengan ose lalu diinokulasi ke tabung yang berisi 10 ml media MR-VP dan diinkubasi pada temperatur 35 0 C selama 48 jam ± 2 jam. b) Dipindahkan 5 ml media MR-VP ke tabung reaksi dan ditambahkan 0.6 ml larutan α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40%, kemudian digoyang-goyang

38 38 sampai tercampur dan didiamkan. c) Untuk mempercepat reaksi ditambahkan kristal kreatin. Hasil dibaca setelah 4 jam. d) Hasil uji positif apabila terjadi perubahan warna pink sampai merah delima. e) Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif untuk uji VP (tidak terjadi perubahan warna pada media). Uji Methyl Red (MR) a) Sebanyak 5 ml media MR-VP yang telah diinokulasi dengan biakan dari media TSIA yang menciri Salmonella diinkubasikan kembali pada temperatur 35 0 C selama 48 jam ± 2 jam. b) Ditambahkan 5-6 tetes indikator Methyl Red pada tabung. c) Hasil uji positif ditandai dengan adanya difusi warna merah ke dalam media. d) Hasil uji negatif ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media. e) Umumnya Salmonella memberikan hasil positif untuk uji MR. Uji Citrate a) Koloni dari TSIA yang menciri Salmonella diinokulasikan ke dalam Simmons Citrate Agar dengan osé. b) Diinkubasikan pada temperatur 35 º C selama 96 jam ± 2 jam. c) Hasil uji positif ditandai adanya pertumbuhan koloni yang diikuti perubahan warna dari hijau menjadi biru. d) Hasil uji negatif ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni atau tumbuh sangat sedikit dan tidak terjadi perubahan warna. e) Umumnya Salmonella memberikan hasil positif pada uji citrate. Uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB) a) Satu ose dari TSIA yang menciri Salmonella diambil dan diinokulasi ke dalam LDB.