Uji Antioksidan dengan Metode DPPH dan Uji Saponin terhadap Ekstrak Teripang Holothuria atra

Transkripsi

1 Uji Antioksidan dengan Metode DPPH dan Uji Saponin terhadap Ekstrak Teripang Holothuria atra Subhan Haikal Ehsan 1 Departemen Biologi, FMIPA UI, Kampus UI Depok subhan.haikal@yahoo.com, 2 yasman.si@ui.ac.id Abstrak Teripang telah diketahui banyak memiliki manfaat biologis, seperti antikanker, antifungal, antivirus, dan antioksidan. Penelitian dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan mendeteksi keberadaan senyawa saponin pada ekstrak kasar Holothuria atra (Echinodermata) dan fraksi-fraksinya. Senyawa radikal bebas DPPH digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan sedangkan pereaksi Liebermann Burchard digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawa saponin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kasar H. atra mengandung saponin dan memiliki aktivitas antioksidan yang lebih rendah dari pembandingnya, Acanthaster sp. (Echinodermata) dengan nilai IC 5 masing-masing sebesar 739,194 µg/ml dan 12,946 µg/ml. Fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air memiliki aktivitas antioksidan yang kurang kuat dengan nilai IC 5 secara berurutan 511,35 µg/ml, 373,776 µg/ml, dan 491,8 µg/ml. Uji saponin terdeteksi positif pada semua fraksi kecuali fraksi etil asetat.. Kata kunci: antioksidan, DPPH, ekstrak kasar, Holothuria atra, saponin. 1. PENDAHULUAN Penelitian tentang bahan alam dan senyawa bioaktif dari biota laut telah banyak dilakukan dan telah berkembang sejak tahun 197- an. Lebih dari 15. struktur senyawa bioaktif telah ditemukan terdapat pada biota laut. Senyawa bioaktif biota laut dapat diisolasi dari alga, spons, moluska, Echinodermata, Tunicata, Cnidaria, dan ikan (Dewi 29: 3)[1]. Salah satu biota laut yang telah diketahui memiliki senyawa bioaktif dan dapat dimanfaatkan adalah teripang (Yusron 1991:53)[2]. Teripang (Holothuroidea) sudah sejak lama banyak dimanfaatkan di wilayah Indo-Pasifik bukan hanya untuk dikonsumsi sebagai makanan, tetapi juga dapat dimanfaatkan sebagai obat tradisional khususnya di wilayah Asia Timur. Teripang dapat dimanfaatkan sebagai obat karena memiliki manfaat-manfaat biologis seperti antifungal, antivirus, antitumor, anticoagulant, antiangiogenic, neuritogenic, dan immunomodulatory activities (Husni et al. 29: 2)[3]. Hasil penelitian Suriyanto (21: 34)[4] menunjukkan bahwa empat jenis teripang Holothuria spp. dari Pulau Penjaliran Timur (Kep. Seribu, Jakarta) memiliki bioaktivitas yang tinggi atau toksik terhadap Artemia salina karena memiliki nilai LC 5 kurang dari 1 ppm. Selain memiliki fungsi sebagai obat, senyawa bioaktif teripang juga bermanfaat dari aspek ekologi, seperti antifouling dan antifeedant. Selvin & Lipton (24: 252)[5] menyimpulkan bahwa ekstrak Holothuria scabra dapat mencegah terjadinya penempelan kaki Patella vulgata pada cawan petri yang telah diisi dengan 1 ml ekstrak H. scabra dan sepertiga bagian lainnya dengan air laut. Tursina (211: 36)[6] juga telah meneliti potensi antifeedant ekstrak H.atra dan Bohadschia marmorata terhadap ikan karang dan menyimpulkan bahwa ekstrak teripang tersebut dapat berperan sebagai antifeedant terhadap ikan karang. Senyawa yang banyak diperkirakan berperan dalam manfaat-manfaat ekstrak teripang tersebut adalah triterpen glikosida. Triterpen glikosida adalah senyawa yang termasuk dalam kelompok saponin dan telah umum diketahui sebagai sea cucumber saponins. Senyawa-senyawa bioaktif penting lainnya yang terdapat pada teripang antara lain chondroitin sulfate, eicosapentaenoic acid, dan ganglioside (Kaneko et al. 23)[7]. Dari sekian banyak penelitian tentang manfaat teripang tersebut, masih sedikit laporan penelitian tentang aktivitas antioksidan pada ekstrak teripang. Baru-baru ini, Cucumaria frondosa, spesies teripang yang umum terdapat di pesisir Samudera Atlantik Utara, dan teripang Stichopus japonicus telah diteliti dan diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Senyawa fenolik diperkirakan adalah senyawa yang paling berperan dalam aktivitas antioksidan ekstrak teripang tersebut (Mamelona et al. 27: 7)[8] Indonesia sebagai negara beriklim tropis dengan perairan dangkal yang luas menyediakan habitat yang baik untuk perkembangan berbagai macam jenis teripang, salah satunya adalah teripang Holothuria atra yang banyak dan umum ditemukan di perairan Indonesia (Arnold & Birtles 1989: 227)[9]. Penelitian yang dilakukan oleh Suriyanto (21)[4] dan Tursina (211)[6] menggunakan H.

2 atra sebagai bahan penelitian dan dari kedua penelitian tersebut diketahui bahwa ekstrak H. atra bersifat toksik terhadap Artemia salina dan memiliki potensi antifeedant terhadap ikan karang. Belum adanya penelitian tentang aktivitas antioksidan ekstrak H. atra membuat penelitian ini perlu dilakukan untuk lebih mengetahui potensi manfaat senyawa bioaktif yang terdapat pada ekstrak H. atra. Teripang dari Suku Holothuriidae banyak terdapat di perairan Indonesia. Teripang yang tergolong ke dalam Suku Holothuriidae adalah Actinopyga, Bohadschia, Labidodemas, dan Holothuria (Arnold & Birtles 1989: 227)[9]. Penelitian mengenai senyawa metabolit sekunder teripang pernah dilakukan di Indonesia oleh Suriyanto (21)[4] dan Tursina (211)[6]. Suriyanto pada tahun 21 melakukan penelitian mengenai uji toksisitas ekstrak teripang dari Kepulauan Seribu terhadap larva Artemia salina menggunakan uji Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Hasil penelitian Suriyanto (21: 34)[4] menunjukkan bahwa ekstrak kasar teripang Holothuria atra di Kepulauan Seribu terbukti bersifat aktif (toksik) terhadap uji BSLT dengan nilai LC 5 sebesar 77, 63 µg/ml. Tursina (211: 36) telah meneliti potensi antifeedant ekstrak Holothuria atra terhadap ikan karang dan menyatakan bahwa ekstrak H. atra dapat berperan sebagai antifeedant terhadap ikan karang. Chairunnisa dan Hakam (211)[1] juga telah meneliti potensi ekstrak kasar H. atra sebagai senyawa pencegah kanker, dan menyimpulkan bahwa ekstrak H. atra pada dosis,33 1,32 g/kg bb memiliki aktivitas pencegahankanker dengan parameter penurunan jumlah mikronukleus pada 2 sel eritrosit polikromatik mencit (Chairunnisa 211: 35)[1]. Akan tetapi, penelitian tentang aktivitas antioksidan pada ekstrak H. atra dari Kep. Seribu, Jakarta belum pernah dilakukan. Oleh karena itu, penelitian tentang aktivitas antioksidan ekstrak H. atra perlu dilakukan untuk lebih mengetahui potensi manfaat senyawa bioaktif yang terdapat pada ekstrak H. atra. Selain itu, pemeriksaan fraksi-fraksi ekstrak kasar H. atra yang diperoleh dengan pelarut-pelarut tertentu perlu juga dilakukan untuk mengetahui fraksi manakah yang paling dominan dalam uji aktivitas antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan yang terdapat pada ekstrak Holothuria atra dan mengetahui fraksi ekstrak kasar H. atra manakah yang paling dominan dalam uji aktivitaas antioksidan. Hipotesis penelitian ini adalah terdapat aktivitas antioksidan pada ekstrak Holothuria atra dan terdapat fraksi ekstrak H. atra yang dominan dalam uji aktivitas antioksidan. 2. METODE PENELITIAN Pengambilan sampel teripang Holothuria atra dilakukan di rataan terumbu Pulau Pari, Kep. Seribu, Jakarta. Sampel diambil sebanyak 28 individu dengan kisaran ukuran cm, dikeluarkan organ bagian dalamnya, kemudian ditimbang dan diawetkan dengan metanol dalam botol sampel. Ekstraksi Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Sampel yang telah diambil ditiriskan kemudian dihaluskan dengan blender. Sampel yang telah halus kemudian direndam dengan metanol pada beaker glass 1 liter, dihomogenkan dengan sonikator, dan didiamkan semalaman. Filtrat yang terbentuk nantinya akan disaring. Proses ekstraksi tersebut diulang hingga filtrat tidak berwarna. Filtrat yang telah dikumpulkan, diuapkan dengan rotary evaporator dan dikeringkan dalam oven pada suhu 4 ºC. Uji kualitatif antioksidan Ekstrak kering dilarutkan dalam metanol lalu dipipet menggunakan pipa kapiler kemudian ditotolkan pada pelat KLT. Penotolan dilakukan berkali-kali pada titik yang sama hingga terbentuk zona penotolan berdiameter,5 cm untuk mendapatkan hasil yang optimum. Larutan DPPH disemprotkan ke pelat KLT secara merata kemudian didiamkan sejenak. Reaksi antara DPPH dan ekstrak pada pelat KLT diamati dan didokumentasikan. Hasil positif aktivitas antioksidan ditunjukkan dengan zona penotolan yang tidak terwarnai ungu oleh larutan DPPH atau terbentuk warna kuning pucat (hampir putih) dengan latar belakang ungu. Uji kuantitatif antioksidan Aktivitas antioksidan ekstrak H. atra diukur dengan mereaksikannya dengan senyawa radikal bebas DPPH (1,1 Difenil-2-Pikrilhidrazil) sesuai dengan metode Blois (1958)[11]. Konsentrasi larutan DPPH dalam metanol p.a pada saat pengujian adalah 5 µg/ml. Ekstrak kering teripang dilarutkan juga dengan metanol p.a dan dibuat seri konsentrasi uji sebesar 2,5; 6,25; 12,5; 25; dan 37,5 µg/ml. Seri larutan uji direaksikan dengan larutan DPPH pada tabung reaksi yang berbeda, dikocok hingga homogen, diinkubasi pada suhu 37ºC selama 3 menit dan diukur serapannya pada panjang gelombang 517 nm menggunakan spektrofotometer hingga didapatkan absorbansi DPPH sisa pada setiap konsentrasinya. Penghitungan % inhibisi dan nilai IC 5 Nilai IC 5 dihitung berdasarkan persentase inhibisi terhadap radikal DPPH dari masing-masing konsentrasi larutan sampel dengan rumus: %!"h!"!#! =!"#.!"#$%&!"#.!"#$%&!"#$%"&'!"#$%&! 1 %

3 Setelah didapatkan persentasi inhibisi (y) dari masing-masing konsentrasi (x), titik-titik (x,y) diplot pada bidang koordinat kemudian ditentukan persamaan y = mx + c dengan perhitungan secara regresi linear dimana m dan c adalah konstanta, x adalah konsentrasi sampel (µg/ml), dan y adalah. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition Concentration 5 (IC 5 ) yaitu konsentrasi sampel (x) yang dapat meredam 5% radikal DPPH (y=5). Jadi, nilai IC 5 sama dengan nilai x saat nilai y = 5. Persamaan regresi linear didapat dengan menggunakan program Microsoft Excel 27 setelah membuat kurva antara % inhibisi dan konsentrasi sampel. Identifikasi saponin Uji saponin pada penelitian ini dilakukan dengan metode uji busa. Uji busa dilakukan dengan menempatkan,5 gram ekstrak ke dalam tabung reaksi yang telah berisikan akuades 1 ml, dikocok dan ditambahkan satu tetes larutan asam klorida 2 N. Tabung reaksi tersebut didiamkan dan diperhatikan ada atau tidaknya busa stabil. Sampel mengandung saponin jika terbentuk busa stabil dengan ketinggian 1--3 cm selama 3 detik. Fraksinasi Ekstrak metanol Holothuria atra dilarutkan dalam air 4 ml dan dihomogenkan di dalam round flask kemudian dituang ke corong pisah. N-heksan 4 ml ditambahkan ke corong pisah kemudian dikocok hingga terbentuk emulsi kedua pelarut lalu didiamkan hingga terbentuk dua fraksi nyang dapat diketahui dari perbedaan warna keduanya yaitu fraksi air pada bagian bawah dan fraksi n-heksan pada bagian atas. Klep yang terdapat di bagian bawah corong pisah dibuka hingga semua air keluar dari corong pisah dan ditampung dalam round flask. Fraksi n-heksan yang masih berada di corong pisah dituang ke round flask lainnya. Fraksi air yang telah ditampung dalam round flask dituang ke corong pisah lau ditambahkan n-heksan yang baru. Pengocokan dan proses yang sama dengan sebelumnya dilakukan. Proses tersebut dilakukan hingga fraksi n-heksan yang terbentuk di corong pisah tidak berwarna. Fraksi n-heksan yang telah didapatkan kemudian diuapkan menggunakan evaporator selanjutnya dimasukkan ke oven hingga kering. Fraksi air yang diperoleh dituangkan ke corong pisah kemudian ditambahkan 4 ml etil asetat. Corong pisah dikocok lalu didiamkan hingga terbentuk dua fraksi yaitu fraksi air pada bagian bawah corong pisah dan fraksi etil asetat pada bagian atas. Klep dibuka hingga fraksi air keluar dari corong pisah kemudian ditampung dalam round flask dan fraksi etil asetat dituang ke round flask lain. Fraksi air yang telah ditampung dalam round flask dituang ke corong pisah lalu ditambahkan etil asetat yang baru kemudian dikocok sama seperti proses sebelumnya. Proses tersebut dilakukan hingga fraksi etil asetat yang terbentuk di corong pisah tidak berwarna. Fraksi etil asetat dan air yang telah didapatkan kemudian masing-masing diuapkan menggunakan evaporator dan selanjutnya dimasukkan ke oven hingga kering. Uji antioksidan dan uji saponin terhadap fraksi Uji antioksidan dan uji saponin terhadap fraksi n- heksan, etil asetat, dan air dilakukan untuk mengetahui fraksi teraktif yang mengandung saponin di antara ketiganya. Fraksi teraktif adalah fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi yang ditunjukkan dengan nilai IC 5 terkecil. Uji kualitatif dan kuantitatif antioksidan serta uji saponin dilakukan dengan prosedur yang sama dengan prosedur yang dilakukan pada ekstrak kasar teripang. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Bobot ekstrak kasar Holothuria atra yang didapat yakni 1,39% dari bobot basah sampel. Proses maserasi yang dilakukan pada penelitian belum sepenuhnya selesai. Ekstrak kasar yang digunakan adalah hasil maserasi sebanyak tiga kali. Maserasi tidak dilakukan hingga selesai karena keterbatasan waktu penelitian yang dimiliki penulis. Walaupun demikian, persentase bobot ekstrak kasar H. atra masih sesuai dengan penelitian yang dilakukan Elyakov (1973: 327)[12] yang menyatakan bahwa persentase ekstrak kasar H. atra berkisar antara,5--2,5 % dari berat basahnya. Acanthaster sp. dijadikan pembanding pada penelitian karena termasuk ke dalam filum yang sama dengan Holothuria atra, yaitu Echinodermata dan aktivitas antioksidannya telah diteliti sebelumnya oleh Rahim pada tahun 212. Ekstrak kasar Holothuria atra memiliki aktivitas antioksidan yang lebih rendah daripada pembandingnya. Artinya, Holothuria atra tidak lebih berpotensi dijadikan sumber antioksidan daripada Acanthaster sp.. Total bobot fraksi yang didapat adalah 12,5 gram dengan fraksi n-heksan sebagai fraksi dengan bobot terbanyak yakni 8,5 gram. Hasil uji aktivitas antioksidan secara kualitatif menunjukkan ketiga fraksi memiliki aktivitas antioksidan. Uji kuantitatif juga menunjukkan bahwa ketiga fraksi memiliki aktivitas antioksidan yang nilainya lebih besar dari nilai aktivitas antioksidan ekstrak kasar Holothuria atra. Nilai aktivitas antioksidan dari ekstrak kasar H. atra dan ketiga fraksinya dapat dikatakan kurang kuat karena menurut Blois (1958)[11], suatu senyawa adalah antioksidan yang kuat jika memiliki nilai IC 5 kurang dari 2 µg/ml. Hasil serupa juga didapatkan dari penelitian Althunibat dkk. pada tahun 29[13]. Althunibat dkk. meneliti tentang aktivitas antioksidan ekstrak tiga jenis teripang di Malaysia yaitu Holothuria scabra, H. leucospilota, dan Stichopus chloronotus. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa nilai IC 5 ekstrak kasar ketiga

4 jenis teripang tersebut berkisar antara 2 mg/ml sampai 1 mg/ml. Penelitian aktivitas antioksidan H. atra dari Laut Merah juga telah dilakukan oleh Esmat dkk. (212)[14]. Esmat dkk. menyatakan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak H. atra rendah terhadap radikal bebas DPPH dengan nilai 17,1 % pada konsentrasi 6 µg/ml namun tinggi terhadap radikal NO dengan nilai 93,42 % pada konsentrasi 6 µg/ml. Hasil tersebut menunjukkan bahwa nilai aktivitas antioksidan dapat berbeda tergantung dari metode yang dipakai. Uji saponin juga dilakukan untuk mengetahui apakah senyawa yang berperan sebagai antioksidan didominasi oleh senyawa saponin. Hal tersebut dilakukan karena senyawa metabolit sekunder yang umum dijumpai pada teripang adalah triterpen glikosida (Careaga dkk. 29: 6)[15] yang merupakan senyawa saponin, sehingga dapat diketahui apakah triterpen glikosida (saponin) atau justru golongan senyawa lain yang berperan dominan dalam aktivitas antioksidan. Hasil uji saponin menunjukkan bahwa ekstrak kasar, fraksi n-heksan, dan fraksi air positif mengandung saponin sedangkan fraksi etil asetat negatif. Saponin adalah senyawa polar yang secara teori pada proses fraksinasi akan terbawa ke dalam fraksi yang juga bersifat polar, yaitu fraksi air. Hasil uji saponin fraksi air menunjukkan bahwa hasil tersebut sesuai dengan teori. Penyimpangan terjadi pada uji saponin fraksi n-heksan yang memberikan hasil positif padahal n-heksan adalah senyawa non-polar. Pengocokan pada corong pisah terlalu lama dan pemisahan fraksi air dan n-heksan dinilai terlalu cepat sehingga diduga ada komponen fraksi air yang masih terjebak dalam fraksi n- heksan. Fraksi air yang positif saponin memiliki nilai aktivitas antioksidan dengan nilai IC 5 sebesar 491,8 µg/ml. Nilai tersebut lebih kecil dibandingkan dengan fraksi etil asetat yang negatif saponin, dengan nilai IC 5 sebesar 373,776 µg/ml. Hasil tersebut memberikan asumsi bahwa senyawa selain golongan saponin merupakan senyawa yang berperan dominan dalam aktivitas antioksidan. Senyawa selain saponin yang bersifat antioksidan dan juga larut di air (polar) atau pelarut semi polar (etil asetat) adalah fenol, flavonoid, dan alkaloid (Sayeed 27: 15)[16]. Nilai aktivitas antioksidan tertinggi di antara ketiga fraksi ditunjukkan oleh fraksi etil asetat dan fraksi air, sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa yang berperan dominan dalam aktivitas antioksidan ekstrak H. atra adalah golongan senyawa yang bersifat atau cenderung bersifat polar. Tabel 1. Uji antioksidan dan uji saponin ekstrak dan fraksi Holothuria atra Sampel Holothuria atra Uji kualitatif antioksidan Nilai IC 5 (µg/ml) Uji saponin Ekstrak kasar + 739,194 + Fraksi n ,35 + heksan Fraksi etil + 373,776 - asetat Fraksi air + 491,8 + Gambar 1. Persamaan regresi ekstrak kasar metanol Holothuria atra 1 5 ekstrak kasar y =.678x R² = Gambar 2. Persamaan regresi fraksi n-heksan Holothuria atra fraksi n- heksan y =.971x R² = Gambar 3. Persamaan regresi fraksi etil asetat Holothuria atra fraksi e;l asetat y =.1214x R² =

5 Gambar 4. Persamaan regresi fraksi etil air Holothuria atra KESIMPULAN Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak teripang Holothuria atra dan fraksi-fraksinya memiliki aktivitas antioksidan. Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi adalah fraksi etil asetat dengan nilai IC 5 sebesar 373,776 µg/ml. Hal tersebut mengindikasikan bahwa senyawa yang berperan paling dominan dalam aktivitas antioksidan ekstrak H. atra adalah senyawa yang bersifat polar atau cenderung bersifat polar. UCAPAN TERIMAKASIH Terima kasih kepada Bapak Dr.rer.nat Yasman, M. Sc. selaku pembimbing serta Ibu Dra. Setiorini, M. Kes. dan Ibu Nova AnitA, M. Biomed. atas saran dan masukan selama penelitian. DAFTAR ACUAN fraksi air y =.12x +.82 R² = [1] A.S. Dewi. 29. Biologically active secondary metabolites from tropical marine invertebrates. Thesis S3 Oseanography-The faculty of graduate studies The University Of British Columbia, Vancouver: xiv + 14 hlm. [2] E. Yusron. 24. Sumberdaya teripang di perairan Tanjung Pai Padaido Biak Numfor Papua. Makara. Sains. 8(3): [3] A. Husni, B. Um & D. Chung. 29. Isolation and identification of antioxidants and tyrosinase inhibitors from Stichopus japonicus. Food Science and Biotechnology (18): [4] Suriyanto. 21. Uji toksisitas ekstrak teripang (Holothuria spp.) dari Pulau Penjaliran Timur Taman Laut Nasional Kepulauan Seribu Jakarta menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Skripsi Sarjana S1 Departemen Biologi FMIPA Universitas Indonesia, Depok: xiii + 55 hlm. [5] J. Selvin & A.P. Lipton. 24. Antifouling activity of bioactive substances extracted from Holothuria scabra. Hydrobiologica. (513): [6] L.M. Tursina Uji antifeedant ekstrak kasar teripang Holothuria atra dan Bohadschia marmorata terhadap ikan karang di perairan Pulau Pramuka Kepulauan Seribu DKI Jakarta. Skripsi Sarjana S1 Departemen Biologi FMIPA Universitas Indonesia, Depok: xii + 48 hlm. [7] M. Kaneko, F. Kisa, K. Yamada, T. Miyamoto & R. Higuchi. 23. Structure of a new neuritogenic-active ganglioside from the sea cucumber Stichopus japonicus. European Journal of Organic Chemistry (1): [8] J. Mamelona, E.M. Pelletier, K. Girard- Lalancette, J. Legault, S. Karbourne & S. Kermasha. 27. Quantification of phenolic cntents and antioxidant capacity of Atlantic sea cucumber Cucumaria frondosa. Food Chem. 14: [9] P.W. Arnold, & R.W. Birtles Soft sediments marine invertebrates of Southeast Asia and Australia: a guide to identification. Australian Institutes of Marine Science, Australia: xvi hlm. [1] N. Chairunnisa Uji potensi ekstrak kasar teripang Holothuria atra Jaeger sebagai pencegah kanker melalui uji mikronukleus pada susmsum tulang mencit (Mus musculus) jantan galur DDY. Skripsi Sarjana S1 Departemen Biologi FMIPA Universitas Indonesia, Depok: xi + 51 hlm. [11] M.S. Blois Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Biochemistry 181: [12] G.B. Elyakov, V.A Stonik, E.V. Levina, V.P Slanke, T.A. Kuznetsova & V.S. Levin A comparative study of the glycoside fractions of Pacific sea cucumbers. Perg. Press. 44B: [13] O.Y. Althunibat, R. bin Hashim, M. Taher, J.M. Daud, M.A. Ikeda & B.I. Zali. 29. In vitro antioxidant and proliferative activities of three Malaysian sea cucumber species. European Journal of Scientific Research 37(3): [14] A.Y. Esmat, M.M. Said, A.A. Soliman, K.S.H. El-Masry & E.A. Badiea Bioactive compounds, antioxidant potential, and hepatoprotective activity of sea cucumber (Holothuria atra) against thioacetamide intoxication in rats. Nutrition. 3: 1--1 [15] V.P. Careaga, C. Bueno, C. Munianin, L. Alche & M.S. Maier. 29. Antiproliferative, cytotoxic and hemolytic activities of a triterpene glycoside from Psolus patagonicus

6 and its desulfated analog. Chemotherapy. (55): [16] A. Sayeed. 27. Introduction of plant constituents and their tests. New Delhi University, New Delhi: 4 hlm