Uji Kualitatif Etanol yang Diproduksi Secara Enzimatis Menggunakan Z. Mobilis Permeabel

Transkripsi

1 Prosiding Skripsi Semester Genap 2010/2011 SK SK Uji Kualitatif Etanol yang Diproduksi Secara Enzimatis Menggunakan Z. Mobilis Permeabel Dian Pinata *, Refdinal Nawfa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Abstrak Pada penelitian ini telah dilakukan permeabilisasi terhadap sel Zymomonas mobilis dan produksi etanol secara enzimatis dengan menggunakan sel Z. mobilis permeabel yang didapatkan. Permeabilisasi dilakukan dengan menggunakan perbandingan etanol:toluen = 4:1 dan konsentrasi glukosa yang digunakan dalam proses produksi etanol sebesar 10%. Sel Z.mobilis permeabel dapat menghasilkan etanol yang ditandai dengan terjadinya pengurangan substrat glukosa, yang diperoleh dari kerja enzim pembentuk etanol yang terdapat pada sel permeabel. Selain itu juga ditandai dengan adanya perubahan warna kalium dikromat, dari warna jingga menjadi berwarna hijau kebiruan, setelah penambahan supernatan yang diduga mengandung etanol. Kata kunci : Etanol, Z. Mobilis, enzim, permeabilisasi Abstract Permeabillization of Zymomonas mobilis cell and ethanol production using permeabilized Z. mobilis have been studied in this research. This research using ratio ethanol: toluen = 4:1 in the cell permeabillization process and the substrate concentration for ethanol production was 10 %. Permeabilized Z.. mobilis cell can produced ethanol, indicated by the decreased of glucose concentration, received from the work of enzymes from permeabilized cell. And also indicated by the changed of potassium dichromate s color, after added with supernatant suggested contain with ethanol. Keywords : Ethanol, Z.. mobilis, enzyme, permeabillization, 1. Pendahuluan Energi merupakan salah satu permasalahan utama dunia pada abad ke-21. Sampai saat ini bahan bakar minyak masih menjadi konsumsi utama negara-negara dunia. Amerika Serikat sebagai konsumen terbesar minyak bumi dunia dengan tingkat konsumsi 25 juta barrel/hari, tetapi hanya memproduksi 7,5 juta barrel/hari. Oleh karena itu ketersediaan minyak bumi adalah hal yang sangat vital untuk menjaga keberlangsungan industrinya. * Corresponding author Phone : , depe@chem.its.ac.id 1 Alamat sekarang : Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya. Untuk mengatasi kurangnya pasokan minyak bumi, penggunaan bahan bakar alternatif harus segera dilakukan terutama yang berbentuk cair, karena masyarakat sudah sangat familiar dengan bahan bakar cair. Salah satu bahan bakar alternatif tersebut adalah Bioetanol. Etanol adalah cairan tak berwarna yang mudah menguap dengan aroma yang khas. Terbakar tanpa asap dengan lidah api berwarna biru yang kadangkadang tidak dapat terlihat pada cahaya biasa. Sifat-sifat fisika etanol utamanya dipengaruhi oleh keberadaan gugus dan pendeknya rantai karbon etanol. Gugus dapat berpartisipasi ke dalam ikatan hidrogen, sehingga membuatnya cair dan lebih sulit menguap dari pada senyawa organik lainnya dengan massa molekul yang sama ( Rahman,A., 1994). Perkembangan industri yang semakin meningkat dalam dekade terakhir ini akan tidak menutupi kemungkinan kebutuhan etanol akan semakin meningkat. Oleh karena itu perlu dipikirkan sejak dini cara agar produksi etanol dapat dilakukan secara berkelanjutan dengan hasil yang maksimal. Keterbatasan tersebut memunculkan ide isolasi dan purifikasi, kemudian imobilisasi enzim.. Immobilisasi enzim digunakan untuk: meningkatkan proses maupun untuk menghasilkan sesuatu yang baru (Peter, 1997). Permeabilisasi merupakan suatu proses mengubah permeabilitas membran dari semipermeabel menjadi permeabel. Pada poses ini substansi sel seperti glukosa, nukleotida, dan mikromolekul lainnya keluar dari sel sementara untuk makromolekul seperti enzim masih tertinggal di dalam sel (Kazuhiko dan Kozo, 1995). Enzim inilah yang nantinya akan digunakan dan dioptimasikan penggunaannya dalam proses produksi

2 etanol.. Permeabilisasi sel dapat digunakan untuk memproduksi sistem biotransformasi alternatif yang murah untuk memurnikan sistem enzim. Secara kimia pelarut organik dapat digunakan untuk melarutkan cell envelope yang akan menyebabkan permeabilisasi. Dimana pelarut ini tidak akan memindahkan seluruh dinding sel, hanya beberapa enzim yang akan dilepaskan, bergantung pada keselektifitasannya. Metode lainnya adalah penggunakan deterjen untuk penghancuran dinding sel. Deterjen yang sering digunakan adalah sodium dodecyl sulphate (SDS), cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), Tween and Triton X100. Penggunaan deterjen akan mengakibatkan disorganisasi membran sel. Deterjen akan melarutkan sebagian membran sel dan mengekstraksi enzim ikatan membran. Keuntungan metode ini adalah memproduksi larutan kaya enzim dengan sejumlah kecil protein non katalitik dan metode pemurnian yang sederhana (Edebo, 1969). Permeabilisasi pada jamur pertama kali dikembangkan pada ragi dengan menggunakan pelarut organik. Larutan campuran etanol toluen digunakan sebagai agen permeabilisasi pada penelitian enzimatik dalam S.cerevisiae untuk menguji aktivitas enzim dalam sel memproduksi alkohol. Beberapa peneliti menggunaan campuran pelarut organik dan deterjen untuk permeabilisasi S. cerevisiae yang digunakan sebagai biokatalis industri. Permeabilisasi dengan campuran etanol toluen memiliki kecocokan pada pengujian enzim dari jamur (Chelico, Linda, dan George, Khachatourians, 2003). Pada penelitian ini akan dilakukan variasi temperatur dan ph terhadap pembuatan etanol secara enzimatis. Sehingga akan diketahui pengaruh temperatur dan ph terhadap produksi etanol secara enzimatis dengan menggunakan Zymomonas mobilis. Kadar etanol ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri, setelah sebelumnya etanol direaksikan dengan asam dikromat. 2. Metode Penelitian 2.1 Alat dan Bahan Peralatan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer dan cawan petri untuk penumbuhan bakteri pada media cair dan padat, laminary air flow sebagai ruang steril untuk pembuatan media dan pemindah biakan, autoclave untuk sterilisasi basah pada tekanan 1 atm dan suhu 121 o C, inkubator dan rotary shaker yang digunakan untuk inkubasi biakan, sentrifuge untuk pemisahan supernatan dengan biomassa bakteri, spektrofotometer UV-VIS untuk mengukur absorbansi larutan, frezze dryer, neraca analitik untuk menimbang berat kering biomassa dan bahan, serta peralatan gelas dan peralatan tambahan lain yang lazim digunakan dalam penelitian Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri Z.mobilis,. Media padat dengan menggunakan nutrien agar (NA) 20 g/l sebagai media regenerasi dan penumbuhan bakteri Media komplek untuk stater uji fermentasi awal terdiri dari glukosa 8 %, yeast ekstrak 0,1 %, KH 2 PO 4 0,2 %,(NH4) 2 SO 4 0,4 %,dan MgSO 4 7H 2 O 0,1 %. ( Vullo dan Wachsman, 2005). Untuk melakukan peningkatan permeabilitas sel dilakukan dengan menggunakan bahan: EDTA, etanol, toluen, sodium didioksi sulfat (SDS). Untuk pembuatan etanol secara enzimatis menggunakan campuran Glukosa, MgCl 2, ATPNa 2, dan NAD. DNS digunakan untuk penentuan kandungan sisa substrat (glukosa) dengan metoda kolorimetri. 2.2Prosedur Kerja Regenerasi Bakteri Z.mobillis Biakan murni Z.mobillis diremajakan pada agar miring yang telah disterilisasi pada suhu 121 O C dan tekanan 1 atm selama 15 menit, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 o C selama 48 jam. Z.mobilis pada media ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media yang baru sebelum digunakan Penentuan Kurva Pertumbuhan Z.mobilis Inokulum dari media agar miring dipindahkan kedalam 50 ml media komplek sebanyak satu jarum ose. Kemudian diinkubasi pada suhu 30 o C selama 24 jam dengan menggunakan pengocok pada kecepatan 100 rpm. Setelah itu medium dipindahkan kedalam 500 ml media komplek yang baru. Selanjutnya difermentasikan lagi selama 24 jam dengan melakukan penyamplingan setiap 2 jam. Berdasarkan hasil penyamplingan ditentukan gambar kurva pertumbuhannya. Terhadap hasil fermentasi dilakukan pemisahan antara biomassa dengan supernatannya dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan rpm. Selanjutnya terhadap supernatan dilakukan penentuan sisa substrat (glukosa) dengan metoda kolorimetri menggunakan DNS. Selanjutnya dilakukan pemisahan etanol dengan menggunakan kloroform dan ditentukan kandungan etanolnya dengan menggunakan kalium bikromat secara kolorimetri. Dilihat hubungan sisa substrat (gukosa) dan kadar etanol yang dihasilkan yang diperoleh dari hasil penyamplingan untuk mengetahui waktu maksimum untuk menghasilkan etanol yang tinggi. Setelah diperoleh waktu maksimum untuk menghasilkan etanol, selanjutnya dilakukan kembali fermentasi untuk mendapatkan biomassa yang lebih banyak dengan lama waktu fermentasi yang telah diperoleh sebelumnya. Biomassa yang diperoleh digunakan sebagai sumber enzim dengan perlakuan peningkatan permeabilitas sel Penentuan Gula Reduksi Secara Kolorimetri Sebanyak 3 ml larutan sampel ditambahkan dengan 3 ml reagen DNS di dalam tabung reaksi. Kemudian dipanaskan selama 10 menit, dalam keadaan tabung tertutup rapat oleh alumunium foil. Ditambahkan 1 tetes garam Rochelle untuk mempertegas warna yang dihasilkan. Diambil 1 ml larutan dan diencerkan menjadi 10 ml. Selanjutnya diukur absorbansinya pada 530 nm. Kurva standar gula reduksi dibuat dengan menggunakan kadar glukosa 2 %, 4%, 6%, 8%, dan 10%, dengan cara yang sama seperti yang telah dijelaskan sebelumnya Fermentasi Pada Media Kompleks Untuk Produksi Biomassa Inokulum dari media agar miring dipindahkan kedalam 50 ml media komplek sebanyak satu jarum ose.

3 Kemudian diinkubasi pada suhu 30 o C dengan waktu yang diperoleh dari kurva pertumbuhan bakteri. Setelah itu medium dipindahkan kedalam 500 ml media komplek yang baru. Selanjutnya difermentasikan lagi dengan waktu yang sama. Terhadap hasil fermentasi dilakukan pemisahan antara biomassa dengan supernatannya dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan rpm. Biomassa yang dihasilkan kemudian dikeringkan menggunakan frezze dryer dan ditimbang berat keringnya Permeabilisasi Sel Z.mobillis Sel Z.mobillis yang diperoleh dari hasil sebelumnya diambil sebanyak 0,1 gram dan dipermeabilisasi dengan cara menambahkan 2 mm EDTA lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30 C kemudian ditambahkan campuran 0,075% SDS dan etanol : toluen dengan variasi perbandingan konsentrasi 1:4. Kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 30 C. Sel Z.mobillis yang telah dipermeabilisasi dipisahkan dari supernatannya dengan disentrifuge pada kecepatan 3000 rpm, suhu 30 C selama 5 menit Produksi Etanol Menggunakan Z. mobilis Permeabel. Sel Z. mobillis yang telah dipermeabilisasi, sebanyak 1,0 gram diinkubasi dengan 10 ml larutan campuran 15 mm MgCl 2, 2 mm ATPNa 2, 1 mm NAD,dan 10% glukosa pada suhu ruangan selama 15 menit. Kemudian sel dipisahkan dari supernatannya dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan 3000 rpm. Sebagian supernatan digunakan untuk mengetahui sisa kandungan substrat glukosa sebagai indikator terbentuknya etanol dan sebagian yang lain untuk uji etanol secara kualitatif Uji Etanol Secara Kualitatif Uji Etanol secara kualitatif dilakukan dengan mengambil 1 ml supernatan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 ml larutan kalium dikromat. Larutan kalium dikromat dalam suasana asam dibuat dengan cara 56 ml H 2 SO 4 6 N diencerkan hingga 100 ml. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 0,2942 gram padatan K 2 Cr 2 O 7 dan diencerkan sampai 200 ml, larutan ini berwarna jingga (Mustanir, 1991). Diamati perubahan warna yang terjadi setelah penambahan kalium dikromat. Media pertumbuhan merupakan tempat untuk menumbuhkan mikroorganisme. Mikroorganisme memerlukan nutrisi untuk memenuhi kebutuhan energinya, bahan pembangun sel, serta untuk sintesa protoplasma dan bagian-bagian sel lain. Setiap mikroorganisme memiliki sifat fisiologi tertentu sehingga memerlukan nutrisi yang tertentu pula. Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media padat yang digunakan pada penelitian ini adalah nutrien agar. Nutrien agar terdiri atas agar, pepton, dan beef ekstrak. Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diaduk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada ph yang asam. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. Beef extract. Beef extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi. 3.2 Hasil Kurva Pertumbuhan Bakteri Pertumbuhan Z.mobilis dimonitor sebagai fungsi waktu sehingga didapatkan kurva pertumbuhan Z.mobilis pada gambar Hasil dan Diskusi 3.1 Regenerasi Z.mobilis Penelitian ini menggunakan mikroorganisme berupa bakteri Z. Mobilis sebagai mikroorganisme penghasil etanol. Z.mobilis merupakan baketeri gram negatif yang dapat bekerja dalam suasana anaerobik dan adanya gula primer yaitu glukosa. Z.mobilis merupakan bakteri anaerob fakultatif. Bakteri anaerobik adalah organisme yang tumbuh tanpa oksigen molekular. Anaerobik fakultatif adalah bakteri yang masih bisa hidup ditempat yang mengandung oksigen. Prosedur kerja aseptis dilakukan dengan prinsip seminimal mungkin tidak terjadi kontaminasi dan tercampurnya bahan yang tidak diinginkan. Metode regenerasi dan penyimpanan bakteri haruslah tepat agar galur dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama, bebas dari mikroorganisme lain (murni) dan tidak menurunkan aktivitasnya. Gambar 3.1 Kurva Pertumbuhan Z. mobilis Kurva pertumbuhan di atas menunjukkan bahwa Z. mobilis hampir tidak melakukan adaptasi atau tidak memiliki fase lag. Hal ini dapat disebabkan karena media starter untuk awal media pertumbuhan sama dengan media fermentasinya. Akibatnya usia sel relatif homogen, sehingga waktu adaptasinya dapat dikatakan amatlah singkat bahkan tidak memerlukan adaptasi. Tetapi jika nutrien yang tersedia dan kondisi lingkungan yang baru sangat berbeda dengan sebelumnya, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesis enzimenzim yang dibutuhkan untuk metabolisme. Selain itu jumlah inokulum juga mempengaruhi hal ini, dimana

4 jumlah sel yang semakin tinggi akan mempercepat proses adaptasi. Pertumbuhan Z. mobilis langsung memasuki fase log yang puncaknya berada pada waktu 22 jam. Pada fase ini sel bakteri membelah dengan cepat, dimana pertambahan jumlahnya mengikuti kurva logaritmik. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya seperti ph dan kandungan nutrien, suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini sel membutuhkan energi lebih banyak dibandingkan dengan fase lainnya, selain itu sel paling sensitif terhadap keadaan lingkungan. Bila kita ingin mengadakan biakan yang cepat tumbuh, maka bakteri pada fase ini baik sekali untuk dijadikan inokulum. Sehingga pada waktu 22 jam inilah pemanenan bakteri dilakukan, karena jumlah sel yang hidup pada fase tersebut merupakan jumlah sel yang hidup optimal dan memiliki aktivitas yang sangat aktif dalam mengkonversi substrat glukosa menjadi produk etanol. Hal ini juga diperkuat dengan adanya data sisa gula reduksi sel bebas Z.mobilis, yang juga dihitung bersamaan dengan pembuatan kurva pertumbuhan bakteri. Kadar etanol dan sisa gula reduksi sel bebas Z.mobilis dapat dilihat pada grafik berikut: Media yang digunakan pada proses fermentasi ini merupakan media kompleks yang disebut juga undefined media atau nonsynthetic media. Media ini selain mengandung media minimal yang terdiri dari KH 2 PO 4, (NH 4 ) 2 SO 4 dan MgSO 4. 7H 2 O, juga mengandung bahan-bahan kompleks seperti ekstrak yeast, ekstrak beef, dan pepton. Semua bahan-bahan tersebut tidak diketahui secara pasti komposisi kimianya. Pada penelitian ini bahan kompleks yang ditambahkan ke dalam media adalah ekstrak yeast. Sehingga media ini dapat disebut juga sebagai media ekstrak yeast. Fermentasi hanya dilakukan selama 22 jam, sesuai dengan waktu dimana jumlah selnya optimum dan memiliki aktifitas yang sangat aktif dalam memproduksi etanol. Fermentasi ini dilakukan dengan menggunakan metode batch dan dilakukan secara anaerob. Z.mobilis mampu melakukan fermentasi pada keadaan anaerob dibuktikan dengan mengendapnya hampir seluruh bakteri pada dasar tabung fermentasi. Setelah dipisahkan antara biomassa dan supernatannya, biomassa dikeringkan dengan menggunakan frezee dryer dan ditentukan berat keringnya. Biomassa keringnya ditunjukan seperti pada gambar berikut: Gambar 3.2 Grafik Sisa Gula Reduksi Sel Bebas Z.mobilis Grafik menunjukan bahwa pada jam ke 22 sisa gula reduksinya makin sedikit, diasumsikan semakin banyak gula yang digunakan untuk produksi etanol. Berdasarkan kesetimbangan ATP, stoikiometri produksi etanol dengan menggunakan substrat glukosa dapat dituliskan sebagai berikut: C 6 H 12 O 6 + ADP + Pi 2 C 2 H 5 OH +2CO 2 +ATP Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa secara teoritis yield etanol adalah 0,51 gram etanol per gram glukosa (El-Mansi, 2007). Di atas 22 jam bakteri telah memasuki fase stasioner. Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah habis. Karena kekurangan zat nutrisi, maka kemungkinan sel tersebut mempunyai komposisi berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritma. Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrem seperti panas, dingin, radiasi dan bahan kimia. Selanjutnya bakteri akan menghadapi fase kematian, dimana sebagian populasi bakteri mulai mengalami kematian karena sebab, yakni: (1) nutrien di dalam medium sudah habis, (2) energi cadangan di dalam sel habis. Jumlah sel yang mati semakin lama akan semakin banyak, dan kecepatan kematian dipengaruhi kondisi nutrien, lingkungan dan jenis bakteri. 3.3 Fermentasi Pada Media Kompleks Untuk Produksi Biomassa Gambar 3.3. Biomassa kering Berat biomassa kering yang diperoleh sebesar 4 gram. 3.4 Permeabilisasi Sel Z. Mobilis Permeabilisasi merupakan suatu proses mengubah permeabilitas membran dari semipermeabel menjadi permeabel. Pada poses ini substansi sel seperti glukosa, nukleotida, dan mikromolekul lainnya keluar dari sel sementara untuk makromolekul seperti enzim masih tertinggal di dalam sel. Salah satu keuntungan dari peningkatan permeabilitas sel adalah lingkungan dapat dikontrol dengan mengubah media eksternal, sehingga kondisi optimal dapat ditentukan (Kazuhiko dan Kozo, 1995). Permeabilisasi dilakukan dengan menggunakan toluen-etanol yang merupakan pelarut organik. Pelarut organik ini berperan dalam membuat kanal-kanal pada membrane sel, sebagai jalur keluar masuk nutrisi dan enzim. Toluen dan etanol akan memperlemah struktur sel yang ditandai dengan banyaknya protein yang dilepaskan dari dalam sel. Penambahan kedua pelarut pertama-tama akan menghancurkan membran protein yang ada pada sel. Aksi tersebut akan memeperlemah membran sel sehingga akan mengijinkan protein sitoplasmik keluar dalam jumlah yang besar dari dalam sel. Hal tersebut dapat menghancurkan dinding sel. Selain kedua pelarut tersebut pelarut lainnya yang biasa digunakan adalah toluene, eter, feniletil alcohol DMSO, benzene, methanol dan kloroform. Bahan kimia lain yang digunakan dalam proses permeabilisasi ini adalah EDTA (bahan pengkelat) yang digunakan luas untuk merubah permeabilitas mikroorganisma gram negative, dalam percobaan ini adalah Z. mobilis. Keefektifannya adalah berkat kemampuannya dalam mengikat ion

5 divalen Ca dan Mg. Kation tersebut menstabilisasikan struktur membranluar dengan cara mengikatkan polisakarida yang satu dengan yang laimmya. Penghilangan kation tersebut oleh EDTA akan meningkatkan permeabilitas dari dinding luar sel. SDS berfungsi sebagai detergen dimana penggunaan deterjen akan mengakibatkan kerusakan membran sel dan melarutkan lipida-lipida yang ada. Deterjen akan melarutkan sebagian membran sel dan mengekstraksi enzim ikatan membran. Keseluruhan kerja tersebut akan membuat membran sel menjadi terpermeabilisasi dan sel akan mengeluarkan mikronutrien yang dimilikinya seperti NADH, ATP, FAD, garam-garaman dan protein. Keluarnya mikronutrien ini ditandai dengan warna sel yang semakin pucat sementara filtrat akan berwarna lebih keruh (kekuningan). Pada percobaan ini penulis menggunakan perbandingan etanol:toluen = 4:1, yang merupakan perbandingan toluen dan etanol yang terbaik untuk proses permeabilisasi, berdasarkan percobaan yang telah dilakukan oleh Kozo (1995). Gambar 4.4 menunjukan hasil permeabilisasi Z. mobilis. Keluarnya mikronutrien ini ditandai dengan warna sel yang tadinya berwarna kekuningan berubah menjadi semakin pucat (putih) sementara filtrat yang mula-mula berwarna jernih akan berubah warna menjadi lebih keruh (kekuningan). Hal ini menunjukan bahwa terdapat senyawa kimia dari dalam sel Z. Mobilis yang terekstrak ke dalam pelarut. Adanya kandungan protein yang dilepaskan oleh sel Z. Mobilis dapat dihitung dengan menggunakan spektrofotometer, yaitu dengan mengukur absorbansi filtrat pada panjang gelombang 270 nm, yang merupakan panjang gelombang dari serapan asam amino tirosin dan triptopan (Okuma,1990). Dimana serapan dari supernatan adalah sebesar 0,295, menandakan adanya protein yang terekstrak ke pelarut. (a) (b) (c) Gambar 4.4 (a) Sel Z.mobilis yang diinkubasi dalam pelarut pada proses permeabilisasi, (b) Supernatan hasil permeabilisasi, (c) Sel Z.mobilis Permeabel 3.5 Produksi Etanol Menggunakan Z. Mobilis Permeabel Produksi etanol menggunakan Z. mobilis permeabel dilakukan dengan cara menambahkan terlebih dahulu mikronutrien-mikronutrien yang telah keluar dari sel pada proses permeabilisasi. Mikronutrien ini diantaranya adalah MgCl 2, ATPNa 2, NAD,dan glukosa 10%. Tanpa adanya mikronutrien ini produksi etanol tidak dapat terjadi. Disini MgCl 2 berperan sebagai kofakrtor dalam proses produksi etanol. Koenzim ATPNa 2 berfungsi untuk menghantarkan gugus fosfat, sementara NAD berfungsi adalam transfer hidrogen. Glukosa merupakan substrat yang secara metabolik akan diubah susunan kimianya oleh enzim untuk menghasilkan etanol Pada produksi etanol dengan menggunakan Z. mobilis permeabel, etanol yang dihasilkan bukan lagi merupakan hasil metabolit sekunder dari sel Z. mobilis. Hal itu disebabkan karena selnya telah mati dalam proses permeabilisasi. Etanol yang dihasilkan oleh Z. mobilis permeabel dihasilkan oleh enzim yang telah teramobilisasi oleh selnya sendiri. Hal itulah yang menyebabkan hasil produksi etanol dengan menggunakan Z. mobilis permeabel lebih banyak dibandingkan dengan yang dihasilkan oleh Z. mobilis yang tidak permeabel. Produksi etanolnya sendiri masih mengikuti jalur Entner Doudoroff. Berdasarkan jalur ini mula- mula glukosa dioksidasi oleh ATP menjadi glukosa-6- fosfat oleh dengan menggunakan bantuan enzim heksokinase, sementara ATPnya sendiri tereduksi menjadi ADP. Selanjutnya terjadi oksidasi gugus aldehid dari glukosa 6-fosfat menjadi 6-fosfoglukonat dan NADPH2, reaksi ini melibatkan enzim glukosa-6- fosfat dihidrogenase. Setelah itu akan terjadi dehidrasi dari 6-fosfat glukonat menjadi 2-keto-3-deoksi-6- fosfoglukonat (KDPG). Reaksi ini terjadi dengan menggunakan enzim 6- fosfoglukonat dehidratase. Kemudian terjadi pemecahan KDPG oleh enzim KDPG aldolase menghasilkan piruvat dan gliseraldehid 3-fosfat. Piruvat inilah yang nantinya akan menghasilkan asetaldehid dan selanjutnya menghasilkan etanol. Sel Z. mobilis diinkubasi dalam mikronutrien mikronutrien selama 15 menit dalam suhu ruangan, sel kemudian dipisahkan dari supernatannya dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan 3000 rpm. Supernatan kemudian diuji sisa kandungan substrat glukosanya. Hasil pengujian menunjukan bahwa terdapat sisa kandungan glukosa sebesar 8,659 g/l. Hal tersebut menunjukan bahwa terdapat glukosa yang berkurang jumlahnya, diasumsikan bahwa glukosa tersebut digunakan untuk produksi etanol. Etanol yang dihasilkan berdasarkan perhitungan adalah sebesar 0,69 gram. Untuk mengetahui keberadaan etanol, supernatan selanjutnya digunakan untuk uji etanol secara kualitatif. 3.6 Uji Kualitatif Kadar Etanol Adanya etanol dalam suatu larutan diuji secara oksidasi dengan menggunakan larutan K 2 Cr 2 O 7. Prinsip yang digunakan adalah reaksi redoks antara etanol dengan kalium dikromat dalam suasana asam. Reaksi yang terjadi adalah: 3 C 2 H 5 OH + 2K 2 Cr 2 O 7 + 8H 2 SO 4 3 CH 3 COOH + 2Cr 2 (SO 4 ) H 2 O + 2K 2 SO 4 Reaksi ini ditandai berubahnya warna kalium dikromat yang mula- mula berwarna jingga menjadi hijau kebiruan (Jungreis, 1926). Gambar 4.5 menunjukan perubahan warna dari kalium dikromat sebelum dan sesudah penambahan etanol. Gambar 4.5 (a) Kalium dikromat dan (b) Kalium dikromat dengan penambahan etanol

6 Gambar 4.5 menunjukan bahwa ion Cr (VI) yang mula- mula berwarna jingga telah tereduksi oleh etanol menjadi ion Cr (III) yang berwarna hijaukebiruan. Hal ini juga diperkuat dengan melihat absorbansi kedua larutan pada panjang gelombang 480 nm yang merupakan panjang gelombang serapan ion Cr (VI). Absorbansi ion Cr (VI) mula- mula adalah sebesar 0,180, kemudian setelah direaksikan dengan etanol absorbansinya turun menjadi 0,070. Data absorbansi ini mengindikasikan bahwa sebagian ion Cr (VI) telah tereduksi menjadi ion Cr (II). Masih terdeteksinya ion Cr (VI) menunjukan bahwa kalium dikromat yang digunakan merupakan kalium dikromat 4. Kesimpulan Kesimpulan yang diperoleh berdasarkan hasil penelitian adalah sel Z.mobilis permeabel dapat menghasilkan etanol yang ditandai dengan terjadinya pengurangan substrat glukosa, yang diperoleh dari kerja enzim pembentuk etanol yang terdapat pada sel permeable Ucapan Terima Kasih 1. Drs. Refdinal Nawfa, M.S selaku dosen pembimbing atas dukungan, bimbingan dan motivasi yang diberikan 2. Dra. Yulfi Zetra, M.Si., selaku koordinator tugas akhir 3. Kedua Orang Tua atas dukungan dan doanya 4. Semua pihak yang mendukung yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu hingga terselesainya penelitian ini Daftar Pustaka B. Sikyta, (1983), Methods in Industrial Microbiology, Ellis Horwood Ltd, Toronto Beck, James S, (1980), Biomembrans. Fundamentals in relation to human biology, Hemisphere Publishing Coorporation, Washington Becker, Wayne M, (1986), The World of The Cell,The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc.Menlo Park, California Cahyanto, (2008), Tinjauan Spektrofotometer, Erlangga, Chelico, Linda, dan George, Khachatourians, (2003), Permeabilization of Beauveria bassiana Blastospores for in Situ Enzymatic Assay, J. Mycology, Vol. 95, N0. 5, The Mycologycal Society of America, pp: Conway, (1939), Micro-diffusion Analysis and Volumetric Error, Crosby Lockwood, London, p C.R. Engler, (1985), Comprehensive biotechnology, Ellis Horwood, Toronto chapter 20, pages Day, R. A. Jr and A. L. Underwood, (1998), Kimia Analisa Kuantitatif, Edisi revisi, terjemahan R. Soendoro, dkk. Erlangga, Dwidjoseputro, (1995), Dasar-dasar Mikrobiologi, Erlangga, Hadi Anim, ( 2009), Spektrofotometri, Erlangga, Hadioetomo, Ratna Siri, (1993), Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, PT Gramedia Pustaka Utama, Irawan, (2008), Teknik Pewarnaan Mikroba, UI Press, J. Darbyshire, (1977), Large scale enzyme extraction and recovery, volume 5 of Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology,. John Wiley and Sons, Toronto, chapter 3, pages Kazuhiko T and Kozo O, ( 1995), Recontruction of Ethanol Fermentation In Permiabilized Cells of The Yeast Sacaromices cereviseae, Jurnal Of Fermentation and Bioengineering, Vol. 79, No.1 Keenan R, (1992), Kimia untuk Universitas, Erlangga, L. Edebo, (1969), Disintegration of Cells, Fermentation Advances. Academic Press, pages Martin, D.W., D.A. Mayes., and V.W. Rodwell, (1983), Harper s Review of Biochemistry. Lange Singapore: Medical Publication Matthew Ng, (2001), Cell Permeabilization Using Supercritical Carbon Dioxide, the University of Waterloo, Ontario Michael Purba, (2004), Kimia SMA Kelas XI, Erlangga, P. Gunasekaran and K.C. Raj, (1999), Ethanol fermentation technology - Zymomonas mobilis, Current Science, 77(1):56 68 Peter Chen, (1997), Microorganisms & Biotechnology, John Murray Ltd., London Primrose, S.B, (1987), Modern Biotechnology, Blackwell Scientific Publications. Oxford Riyadi W, (2008), Perbedaan Spektrometri dan Spektrofotometri, Erlangga, Salisbury, Frank B. dan Ross, Cleon W, (1995), Fisiologi Tumbuhan, Jilid I. Terjemahan, ITB, Bandung Schlegel,H.G. dan Schmidt, K, (1994), Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Swings, J. and De Ley, J, ( 1977), Bacteriol. Rev., 41, Timotius, K.H, (1982), Mikrobiologi Dasar; Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S., and Gary Higton, (2001). Industrial Microbiology: An Introduction.: Blackwell scie Waluyo,Lud.Drs.M.Kes, (2004), Mikrobiologi Umum., Universitas Muhammadiyah Press, Malang