Tempat dan Waktu Penelitian

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Survei penyebaran penyakit dan intensitasnya dilakukan sejak bulan Agustus 1989 hingga bulan Desember 1990, secara bertahap. Untuk penyebaran penyakit, pengamatan dilakukan pada semua areal pertanaman kedelai di Kalimantan Selatan berdasarkan ada tidaknya penyakit pustul. Untuk intensitas penyakit pengamatan dilakukan pada seluruh kabupaten yang ada di Kalimantan Selatan, 9 kabupaten, dan dari tiap kabupaten diambil satu lokasi contoh secara acak, kecuali untuk kabupaten yang hanya mempunyai satu lokasi yang mengusahakan tanaman kedelai. Pekerjaan di laboratorium dan percobaan pot dilaksanakan sejak bulan Agustus 1989 sampai bulan Juli 1990 di Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru, Kalimantan Selatan. Khusus untuk percobaan penularan penyakit melalui polong kedelai dilaksanakan sejak bulan Desember 1991 sampai bulan Februari 1992, di Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian IPB. Isolasi Patogen dan Uji Postulat Koch Sumber isolat berasal dari tanaman sakit yang berada di lingkungan Kampus Unlam Banjarbaru, Kalimantan Selatan. Medium YDCA (Yeast Extract-Dextrose-CaC03 Agar) digunakan untuk isolasi. Setiap liter YDCA mengandung 10 g ekstrak

2 23 ragi, 20 g dektrosa, 20 g CaC03, dan 15 g agar. Kalsium karbonat disterilisasi dalam otoklaf secara terpisah. Daun kedelai yang menunjukkan gejala awal pustul digunting dengan ukuran kira-kira 0.5 x 0.5 cm, dibuat beberapa potongan. Tiap potongan dicelup dalam larutan alkohol 70% selama 2 detik dan dilanjutkan dalam larutan HgC % selama 55 detik. Setelah itu potongan dibilas dalam akuades steril. Potongan dikeringkan dengan meletakkannya di atas kertas hisap steril. Kemudian potongan daun bergejala ini digunting lagi melalui bercak dan dimasukkan dalam larutan 0.85% NaCl dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml. Kemudian dengan menggunakan jarum ose diambil suspensinya dan digoreskan di atas medium YDCA yang telah disiapkan di dalam cawan petri, yang kemudian diinkubasikan selama 4 hari pada suhu kamar. Berdasarkan warna dan bentuk koloninya, masing-masing koloni bakteri yang tumbuh pada medium dimurnikan dengan cara menumbuhkannya pada medium GYCA (Glucose Yeast Extract Calcium Carbonate Agar) miring dan diinkubasikan selama 2 hari. Pada masing-masing biakan miring ditambahkan akuades steril dan diaduk dengan jarum ose serta digoyang-goyang sehingga tersuspensi merata. Untuk mendapatkan konsentrasi inokulum sebesar 2 10*cfu/ml, suspensi ditera dengan larutan McFarland hingga diperoleh skala no. 3. Sebagai tanaman uji digunakan kedelai varietas Galunggung yang rentan terhadap penyakit pustul, berumur 1 bulan. Sebelum dan sesudah inokulasi, tanaman

3 24 diletakkan dalam ruangan lembab dan mendapatkan setengah naungan. Inokulasi dilakukan dengan semprotan. Dari gejala khas yang terbentuk, dilakukan isolasi dan inokulasi ulang. Berdasarkan hasil dari dua tahapan isolasi dan inokulasi, isolat yang mampu menimbulkan gejala serupa di lapangan, kemudian diperbanyak pada medium YDCA dan disimpan dalam suhu 30 C, untuk keperluan selanjutnya. Daerah sebaran penyaki t Survei Penyebaran dan Intensitas Serangan Patogen Pustul Kedelai di Kalimantan Selatan Untuk mendapatkan data sebaran penyakit pustul, penga- matan dilakukan diseluruh lokasi yang ada tanaman kedelai- nya di Kalimantan Selatan, yang dilaksanakan sejak Nopember 1989 sampai Oktober Setiap tanaman yang bergejala mirip pustul diambil daunnya sebagai sampel dan dibawa ke laboratorium untuk diisolasi dan diidentifikasi. Metode yang digunakan sama dengan yang telah diuraikan sebelumnya. Intensitas penyakit Karena jumlah lokasi yang penduduknya melaksanakan usahatani kedelai tidak cukup banyak, maka survei diadakan pada seluruh kabupaten. Di tiap kabupaten diambil satu lokasi pertanaman kedelai secara acak. Pada tiap lokasi ditentukan petak-petak contoh berukuran 1 m x 1 m secara lintas sektoral. Tiap petak contoh yang berurutan berjarak

4 25 sekitar 25 m. Dengan demikian, jumlah petak contoh tiap lokasi tidak sama banyaknya karena tergantung pada luas dan bentuk areal pertanaman kedelai secara keseluruhan. Skor penyakit ditentukan berdasarkan penilaian global gejala penyakit pada tiap rumpun tanaman, yaitu sebagai berikut : Skor 1 = bebas, tidak ada daun yang terserang Skor 2 = terserang ringan, kurang dari 2/3 bagian tajuk bergejala Skor 3 = terserang berat, lebih dari 2/3 bagian tajuk berge jala Identifikasi Patogen Identifikasibakteri patogen dilakukan berdasarkan uji fisiologis dan biokimia menurut Lelliott dan Stead (1987), yang mengacu langsung pada pernbuktian bahwa isolat yang diuji adalah salah satu spesies Xanthomonas campestris. Diantara karakteristik yang diperlukan adalah uji reaksi Gram, uji katalase, uji oksidase, harnbatan pertumbuhan oleh TZC 1% dan 0.023, perturnbuhan kuning madu pada medium kentang, dan uji metabolisme oksidatif-fermentatif. Uji Reaksi Gram Pada permukaan sebuah gelas obyek diletakkan setetes larutan KOH 33, kemudian ditambahkan 1 lup biakan bakteri yang berumur 48 jam, serta diaduk merata selama 10 detik.

5 26 Kemudian lup diangkat perlahan dan diperhatikan timbulnya benang lendir yang lengket. Adanya benang lendir menunjukkan reaksi Gram negatif (Fahy dan Hayward, 1983). Uji katalase Ke atas koloni bakteri yang sedang tumbuh di permukaan medium NA ("nutrient agar") diteteskan 2 tetes larutan H202 3%. Bila dalam waktu singkat terbentuk gelembung udara berarti uji katalase positif. Uji oksidase Bila uji oksidase ini positif, maka berarti bakteri yang diuji mengandung ensim sitokhrom-c oksidase. Beberapa tetes reagen tetrametilfenilen diamin dihidrokhlorida 1% diteteskan pada kertas saring. Dengan menggunakan lup emas, bakteri diusapkan pada kertas saring yang telah diimpregnasi dengan reagen tersebut. Bila dalam 10 detik telah terjadi perubahan warna menjadi ungu, maka reaksi oksidase adalah positif. Bila perubahan terjadi dalam selang waktu antara detik, reaksi dinyatakan positif lambat. Bila perubahan terjadi setelah 60 detik, reaksi dinyatakan negatif.

6 Uji hambatan pertumbuhan oleh TZC Sebagai larutan dasar, ke dalam 100 ml akuades steril ditambahkan 1.0 g TZC (2,3,5 trifenil tetrazolium khlorida) sehingga didapatkan larutan TZC 1%. Untuk mendapatkan me- dium NA yang mengandung 0.1% TZC, maka ke dalam 9 ml NA yang sedang mencair (55O~) ditambahkan 1 ml larutan dasar TZC, dan segera dituangkan ke dalam cawan petri. Medium NA yang mengandung TZC 0.02% didapatkan dari campuran sebanyak 9.8 ml NA yang sedang mencair dan 0.2 ml larutan dasar TZC. Pada masing-masing medium NA yang mengandung 0.1% dan 0.02% TZC di cawan petri, ditanamkan bakteri yang diuji dengan ujung jarum. Selama 3 hari inkubasi, diperhatikan ada atau tidak pertumbuhan koloni yang berawal dari ukuran sebesar titik. Uji warna pertumbuhan bakteri pada medium sumbat kentang Dari sebuah kentang bersih dibuat bentukan sumbat dengan menggunakan "cork borer" berdiameter 1 cm, sepanjang 5 cm. Salah satu ujung diiris dengan kemiringan 4S0 dan ujung lainnya dibuat rata. Sumbat kentang dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan posisi bagian yang rata di dasar tabung. Kemudian tabung diisi akuades setinggi 2.5 cm, dan sediaan disterilkan dengan otoklaf pada suhu 115 C selama 10 menit. Sedikit bakteri diusapkan pada bagian irisan miring dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar. Yang

7 Uji hambatan pertumbuhan oleh TZC Sebagai larutan dasar, ke dalam 100 ml akuades steril ditambahkan 1.0 g TZC (2,3,5 trifenil tetrazolium khlorida) sehingga didapatkan larutan TZC 1%. Untuk mendapatkan medium NA yang mengandung 0.1% TZC, maka ke dalam 9 ml NA yang sedang mencair (55OC) ditambahkan 1 ml larutan dasar TZC, dan segera dituangkan ke dalam cawan petri. Medium NA yang mengandung TZC 0.02% didapatkan dari campuran sebanyak 9.8 ml NA yang sedang mencair dan 0.2 ml larutan dasar TZC. Pada masing-masing medium NA yang mengandung 0.1% dan 0.02% TZC di cawan petri, ditanamkan bakteri yang diuji dengan ujung jarum. Selama 3 hari inkubasi, diperhatikan ada atau tidak pertumbuhan koloni yang berawal dari ukuran sebesar titik. Uji warna pertumbuhan bakteri pada medium sumbat kentang Dari sebuah kentang bersih dibuat bentukan sumbat dengan menggunakan "cork borer" berdiameter 1 cm, sepanjang 5 cm. Salah satu ujung diiris dengan kemiringan 45O dan ujung lainnya dibuat rata. Sumbat kentang dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan posisi bagian yang rata di dasar tabung. Kemudian tabung diisi akuades setinggi 2.5 cm, dan sediaan disterilkan dengan otoklaf pada suhu 115 C selama 10 menit. Sedikit bakteri diusapkan pada bagian irisan miring dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar. Yang

8 dicatat adalah berkembangnya koloni bakteri dengan warna kuning madu. 28 Uji metabolisme oksidatif-fermentatif Disiapkan satu liter medium dasar yang mengandung 5.0 g NaC1, 2.0 g pepton, 0.3 g K2HP04, 3.0 g agar, 15 ml larutan bromothymol biru 0.2% (dalam air), dengan ph 7.1. Sebelum disterilkan, medium dibagi dalam tabung Erlenmeyer ukuran 250 ml, masing-masing 90 ml. Setelah disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit, tabung diletakkan dalam penangas air dengan suhu 50 C dan ke dalamnya ditambahkan 10 ml larutan glukosa 10% steril (disterilkan dengan filtrasi). Medium dibagi-bagi ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 6 ml. Bakteri diinokulasikan secara tusuk ("stab") masing-masing pada 2 tabung reaksi. Pada salah satu tabung, diatas medium diberi parafin cair. Inkubasi dilakukan selama 3 hari pada suhu kamar kemudian dilihat adanya perubahan warna dari biru menjadi kuning sebagai pertanda terjadinya asam. Bila asam terjadi pada tabung tanpa parafin berarti metabolisme oksidatif (aerobik) positif dan bila terjadi pada tabung dengan parafin maka metabolisme fermentatif (oksidasi anaerobik) positif. Identifikasi patovar hanya berdasarkan kekhasan inang. Namun untuk Xanthomonas campestris pv. glycines beberapa sifat fisiologisnya telah diketahui, dan dapat dicocokkan,

9 29 antara lain: sangat cepat menghidrolisis pati, dapat mencairkan gelatin, dan menghasilkan asam (bukan gas) dari sukrosa (Sinclair, 1982). Hidrolisis pati Ke dalam medium YNA ("Yeast Extract Nutrient Agar") ditambahkan 0.2% amilum yang mudah larut. Dalam 1 liter YNA mengandung 5.0 g ekstrak ragi, 5.0 g pepton, 5.0 g ekstrak daging, dan 15 g agar, serta ph 6.8. Bakteri ditempatkan pada medium, dalam cawan petri, dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 3 sampai 7 hari. Setelah itu kultur digenangi dengan larutan Lugol sehingga amilum berwarna biru kehitaman. Zona jernih di sekitar kultur bakteri menggambarkan terjadinya hidrolisis pati (Fahy & Hayward, 1983). Larutan Lugol dibuat dari 1.0 g I2, 2.0 g KI, dan 300 ml akuades (Kiraly et al., 1974). Pencairan gelatin Satu liter medium gelatin dibuat dari 3.0 g ekstrak daging, 5.0 g pepton, dan g gelatin. Medium dibagikan 10 ml per tabung reaksi dan disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Pada tiap tabung diinokulasikan bakteri yang diuji secara tusuk ("stab") dan diinkubasikan pada suhu 20 C selama 7-14 hari. Untuk pembacaan pencairan, tabung diletakkan pada suhu 4 C atau es yang sedang mencair.

10 30 Pembentukan asam dari sukrosa Disediakan medium C-Dye, yang ditambahkan dengan 0.5% sukrosa yang telah disterilkan dengan filtrasi. Satu liter medium C-Dye mengandung 0.5 gnh4h2p04, 0.5 g K2HP04, 0.2 g MgS04.7H20, 5.0 g NaC1, 1.0 g ekstrak ragi, 12.0 g agar, dan 0.7 ml larutan Bromokresol ungu 1.5% (dilarutkan dalam alkohol). Tingkat ph medium 6.8. Bakteri yang diuji ditanamkan secara tusuk dan diamati 2, 4, 7, 21, dan 28 hari setelah tanam. Warna kuning menunjukkan terbentuknya asam. Kehilangan Hasil Untuk mengetahui pengaruh penyakit terhadap hasil, maka disusun sebuah percobaan faktorial, yang terdiri atas dua faktor, yaitu faktor penyakit dan faktor varietas kede- lai. Faktor penyakit terdiri atas dua taraf, yaitu po (tidak diinokulasi bakteri patogen) dan pl (diinokulasi bakteri patogen). Berdasarkan pengalaman pada Kebun Bibit dan Benih Unlam, faktor varietas kedelai dibagi atas tiga taraf, yaitu w = Wilis (relatif le-bih tahan), 1 = Lokon (sedang), dan g = Galunggung (relatif lebih rentan). De- ngan demikian, kombinasi perlakuan menjadi 6 buah, yaitu: powl pol, pog, plw, pll, dan plg. Tiap kombinasi perlakuan diulang lima kali. Percobaan menggunakan pot plastik yang mempunyai diameter 28 cm, sebanyak 30 buah. Rancangan

11 30 Pembentukan asam dari sukrosa Disediakan medium C-Dye, yang ditambahkan dengan 0.5% sukrosa yang telah disterilkan dengan filtrasi. Satu liter medium C-Dye mengandung 0.5 gnh4h2p04, 0.5 g K2HP04, 0.2 g MgS04. 7H20, 5.0 g NaC1, 1.0 g ekstrak ragi, 12.0 g agar, dan 0.7 ml larutan Bromokresol ungu 1.5% (dilarutkan dalam alkohol). Tingkat ph medium 6.8. Bakteri yang diuji ditanamkan secara tusuk dan diamati 2, 4, 7, 21, dan 28 hari setelah tanam. Warna kuning menunjukkan terbentuknya asam. Kehilangan Hasil Untuk mengetahui pengaruh penyakit terhadap hasil, maka disusun sebuah percobaan faktorial, yang terdiri atas dua faktor, yaitu faktor penyakit dan faktor varietas kede- lai. Faktor penyakit terdiri atas dua taraf, yaitu po (tidak diinokulasi bakteri patogen) dan pl (diinokulasi bakteri patogen). Berdasarkan pengalaman pada Kebun Bibit dan Benih Unlam, faktor varietas kedelai dibagi atas tiga taraf, yaitu w = Wilis (relatif le-bih tahan), 1 = Lokon (sedang), dan g = Galunggung (relatif lebih rentan). De- ngan demikian, kombinasi perlakuan menjadi 6 buah, yaitu: pow, pol, pog, plw, pll, dan pig. Tiap kombinasi perlakuan diulang lima kali. Percobaan menggunakan pot plastik yang mempunyai diameter 28 cm, sebanyak 30 buah. Rancangan

12 lingkungan yang dipilih adalah Rancangan Acak Lengkap. Tiap pot diisi dengan 10 kg tanah yang telah disterilkan dengan uap panas selama 1 jam. Pot disusun secara acak di atas meja papan yang tingginya 1 m. Tiap pot berjarak 1 m, dan masing-masing pot dipupuk dengan 0.51 g Urea, 0.67 g TSP, dan 0.60 g KC1. Sebelum ditanam, benih terlebih da- hulu diberi inokulan bakteri Rhizobium dengan cara mencam- pur 1.0 g inokulan sedikit air dan dicampur merata dengan 0.1 kg benih. Inokulasi bakteri patogen dilakukan pada saat tanaman berumur 21 hari, dengan cara menyemprotkan suspensi bakteri pada permukaan bawah daun. Kepadatan inokulum adalah sekitar 10' sel hiduplml (ditera menggunakan dedar McFarland). Setelah disemprot, tanaman ditutup dengan kantong plastik selama 24 jam. Setelah kantong itu dibuka, pot diletakkan di tempat teduh selama 4 jam untuk penyesuaian, dan kemudi- an diletakkan pada meja papan menurut pengacakan semula. Selama percobaan berlangsung, tanaman disemprot secara berkala, satu kali dalam seminggu, dengan insektisida Decis 2.5 EC (bahan aktifnya deltamethrin) dengan dosis 0.5 ml/l air. Tanaman disiram 1-2 kali sehari. Pengamatan dilakukan terhadap hasil (berupa berat biji per pot) dan komponen hasil (berupa jumlah polong per po- hon, jumlah biji per polong, dan berat 100 biji). Untuk melengkapi gambaran keadaan penyakit, maka 15 hari sebelum panen dicatat intensitas penyakit bersangkutan. 31

13 Hubungan Patogen dengan Benih Kedelai Persentase benih terinfeksi dan lokasi bakteri Benih berasal dari tanaman kedelai yang terserang. Untuk maksud tersebut, disediakan lahan berukuran 2 m x 4 m. Pada lahan tersebut dibuat bedengan-bedengan kecil sejajar sisi terpendek, dengan jarak masing-masing 0.5 m. Pada tiap bedengan ditanami kedelai, satu benih satu lobang, dengan jarak 25 cm. Sebelum ditanami, lahan dipupuk dengan 81.8 g Urea, g TSP, dan 96 g KC1. Karena lahan yang digunakan adalah bekas tanaman kedelai juga, maka tidak diperlukan pemberian Rhizobiurn. Inokulasi dilakukan pada waktu tanaman berumur 3 minggu dengan kepadatan inokulum lo8 sel hidup/ml, dengan cara menyemprot pada permukaan bawah daun. Setelah panen, biji dipisahkan dari polong dan diletakkan dalam tampah serta diaduk merata. Dari sejumlah benih yang ada diambil secara acak sebanyak 100 biji untuk keperluan selanjutnya. Tiap benih, setelah dicelup dalam larutan NaOCl 1% 5 menit, dikeringkan menggunakan kertas hisap steril. Kemudian, benih dipisahkan atas kulit, sisa endosperma, hilum, kotiledon, dan sumbu embrio. Bagian-bagian tersebut dile- takkan di atas medium YDC dalam cawan petri. Satu cawan medium untuk dua benih. Bakteri yang tumbuh dan koloninya berwarna kuning, diperbanyak dan diuj i dengan cara "bio- assayw yakni langsung diinokulasikan pada daun kedelai

14 varietas Galunggung. Perkembangan gejala diamati tiap hari hingga timbul gejala yang khas. 33 Persentase tanaman sakit yang benihnya berasal dari tanaman terserang Benih diambil dari karung, hasil panen dari areal terserang, dengan alat pengambil contoh sebanyak 50 benih. Untuk itu disediakan 50 buah pot plastik yang berdiameter f 20 cm dan masing-masing diisi dengan 3 kg tanah steril. Pot disusun di atas meja papan yang tingginya 1 m, dengan jarak 1 m. Tanah dipupuk dengan 0.15 g Urea, 0.2 g TSP, dan 0.18 KC1 per pot. Kurang lebih 1 g Rhizobium diberi sedikit air dan diaduk dengan benih yang akan ditanam. Tiap pot ditanami satu benih kedelai. Pengamatan adanya gejala penyakit dilakukan sejak munculnya kotiledon sampai tanaman berbunga. Pot yang tanamannya terserang penyakit dikeluarkan dari meja papan. Infeksi melalui polong Untuk maksud ini disediakan 60 buah "polybagm, yang masing-masing diisi 5 kg tanah. Tiap pot dipupuk dengan 0.25 g Urea, 0.33 g TSP, dan 0.30 g KC1. Sekitar 0.2 g inokulan Rhizobium dicampur dengan sedikit air dan diaduk merata dengan sekitar 200 benih kedelai varietas Lokon. Tiap pot semula ditanami dengan tiga benih kedelai dan setelah berumur satu minggu disisakan dua tanaman. Inokulasi dengan suspensi bakteri pustul, dengan kepadatan sekitar

15 34 lo7 sel hidup/ml, dilakukan pada waktu polong berumur 7 dan 21 hari terhitung sejak bunga muncul. Perlakuan terdiri atas 3 perlakuan utama, masing-masing dengan satu kontrolnya, sehingga secara lengkap ada enam perlakuan: a) bagian sisi polong dioles dengan suspensi bakteri, b) bagian dorsal polong dioles dengan suspensi bakteri, c) bagian sisi polong diinokulasi secara Itpin prickgt, d) bagian sisi polong diinokulasi dengan air sterill e) bagian dorsal polong dioles dengan air steril, dan f) bagian sisi polong diinokulasi secara "pin pricktt namun dengan air steril. Pengolesan dilakukan dengan kapas dan cara pin prick dilakukan dengan jarum yang dekat ujungnya dibalut kapas. Pengamatan adanya gejala dilakukan pada saat polong berumur satu bulan. Perkembangan populasi bakteri pada benih dalam kurun waktu Prosedur yang digunakan berasal dari Lovrekovich dan Klement (dalam Kiraly et al., 1974). Seratus biji kedelai dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 50 ml larutan NaOCl 1% dan mempunyai klep pembuangan. Setelah dibiarkan selama 5 menit, biji dibilas dengan air steril selama 2 menit. Setelah direndam selama 2 jam dalam air steril biji tersebut dihancurkan menggunakan "blenderw selama 15 menit. Hancuran biji tersebut diencerkan dengan air steril, dan

16 hancuran disentrifus dengan kecepatan 1000 rpm selama 3 me- 35 nit. Supernatan diambil sebanyak 0.3 ml dan ditanamkan merata pada permukaan medium YDCA dalam cawan petri. Bakteri yang tumbuh dan berwarna kuning kemudian dimurnikan dan diuji dengan bakteriofag bakteri pustul. Pada pengujian reaksi terhadap bakteriofag, mula-mula disediakan medium SPA dalam tabung reaksi yang masing-masing berisi 7 ml medium, dan dibiarkan cair pada penangas air dengan suhu 42 C. Di samping itu, disediakan 2 ml suspensi bakteri pustul dengan kepadatan lo7-10' sel hidup/ml dalam tabung reaksi. Kedua sediaan dicampur dan dikocok, dan segera dimasukkan ke dalam cawan petri. Bakteriofag didapatkan dari hasil percobaan serasah. Di atas plak yang besar diteteskan air steril secukupnya dan diaduk dengan jarum ose. Jarum diangkat dan digoreskan pads sediaan campuran terdahulu. Inkubasi dilakukan pada suhu 20 c selama 24 jam. Kecocokan bakteriofag terlihat sebagai adanya zona jernih di sekitar goresan. Setelah adanya kecocokan antara bakteri dan fag penguji, maka jumlah koloni pada percobaan utama dihitung dengan alat cacah. ~emeriksaan pertama dilakukan saat satu bulan setelah panen. Pemeriksaan kedua dan seterusnya dilakukan berselang satu bulan, sampai benih kehilangan daya tumbuh.

17 36 Peranan Benih dalam Penularan Penyakit Benih terinfeksi didapatkan dari polong yang diinoku- lasi pada waktu polong berumur 21 hari. Tiap polong diino kulasi dengan cara menyuntikkan 0.01 ml suspensi bakteri dengan menggunakan ttspuittt berukuran 1 ml, dengan kerapatan 3 x lo7 sel hidup/ml, pada posisi dorsal polong. Setelah panen, benih yang dihasilkan diuji terlebih dahulu kepasti- annya mengandung bakteri patogen tersebut. Sepuluh butir benih diambil secara acak dan dicelupkan dalam larutan NaOCl 1% selama 5 menit, dibilas dengan air steril 2 kali dan kemudian dikering-anginkan pada kertas hisap steril. Sebelum benar-benar kering, benih dipisahkan antara kulit (masih bersama sisa endosperma) dan kotiledon. Kulit dan kotiledon yang telah dibelah menurut keping diletakkan di atas meja medium YDCA dalam cawan petri dan diinkubasikan dalam inkubator selama 3 hari. Bakteri yang tumbuh, khu- susnya yang koloninya berwarna kuning, cembung, dan mengki- lap, diperbanyak pada medium GYCA miring. Setelah berumur 3 hari, bakteri diinokulasikan pada daun kedelai dengan ca- ra semprot. Setelah 10 hari diamati timbulnya gejala khas pustul. Benih yang dipanen siap dipergunakan dalam proses selanjutnya sebagai benih terinfeksi. Benih sehat didapatkan dari tanaman yang dipelihara dalam pot berdiameter 28 cm yang berisi 10 kg tanah steril. Pot diletakkan di atas meja kayu yang tingginya 1 m dari

18 permukaan tanah untuk menghindari infeksi bakteri yang berasal dari tanah/percikan air. Polong dari tanaman sehat dipanen dan diambil benihnya. sehat. Benih ini merupakan benih Percobaan penularan melalui benih menggunakan bak kayu berukuran panjang dan lebarnya masing-masing 1 m dan ting- ginya 30 cm, yang diisi dengan tanah steril. Digunakan sembilan bak untuk perlakuan benih terinfeksi dan satu bak untuk kontrol. Tiap bak ditanami dengan satu benih terinfeksi, kecuali kontrol, pada titik pusat permukaan bak, 24 benih sehat mengelilingi tanaman pusat tersebut dengan jarak tanam 25 cm, seperti tertera pada Gambar 3. Bak diberi kaki setinggi 70 cm dan diletakkan tanpa atap agar Gambar 3. Tata letak penanaman benih terinfeksi dan benih sehat. o = benih sehat = benih terinfeksi

19 38 dapat tertimpa air hujan. Kalau tidak ada hujan, penyiraman menggunakan air ledeng dengan cara semprotan. Pengamatan dilakukan untuk: 1). melihat benih terinf eksi yang tumbuh men jadi tanaman sakit; 2). mengetahui penyebaran penyakit dari tanaman terinfeksi yang berada di tengah-tengah bak. Pengamatan perkembangan jumlah tanaman sakit dilakukan tiap minggu terhitung setelah tanaman tengah bergejala. Inang Kacang-kacangan Lain Tanaman yang diuji adalah kacang panjang (Vigna sinen- sis), kacang hi jau (Phaseolus radiatus), kacang tanah (Ara- chis hypogaea), kacang buncis putih (Phaseolus vulgaris), kacang jogo (Phaseolus vulgaris), kacang asu (Calopogonium mucunoides), dan Pueraria japonica. Tiap jenis tanaman ditumbuhkan dalam pot plastik berdiameter 28 cm yang diisi 10 kg campuran tanah dengan pupuk kandang (perbandingan 2 : 1), tiga pot per tanaman. Tanaman diinokulasi pada umur satu bulan setelah tanam. Dua puluh empat jam sebelum inokulasi, tanaman diletakkan dalam ruang lembab agar stomata terbuka. Kemudian, permukaan bawah daun disemprot dengan inokulum yang kepa- datannya 10'-lo6 sel hidup/ml, menggunakan semprotan obat nyamuk yang telah dimodifikasi. Sebelum inokulasi daun tanaman yang akan diinokulasi direndam selama 10 menit. Setelah inokulasi, tanaman dile-

20 39 takkan kembali di dalam ruang lembab selama 48 jam, kemudian diletakkan di tempat terbuka. Dari gejala yang tampak diadakan isolasi patogennya dan dilakukan uji postulat Koch. Apabila patogennya bakteri, maka dapat langsung diuji dengan cara menginokulasi daun kedelai. Kelangsungan Hidup Patogen dalam Tanah Pemberaan tanah Kelangsungan hidup bakteri pustul di dalam tanah dapat diketahui dari dua aspek, yaitu keadaan populasi bakteri itu sendiri dan dari kemampuan tanah tersebut berlaku sebagai sumber inokulum. Untuk keperluan itu, tanah bekas pertanaman kedelai yang terserang pustul dimasukkan ke dalam empat pot plastik berdiameter 28 cm, masing-masing sebanyak 10 kg. Tanah dalam pot diberakan masing-masing 1 bulan, 2 bulan, 3 bulan, dan 4 bulan. Setiap hari tanah disiram sampai batas kapasitas lapang. Dari pot, sesuai masa pemberaannya, diambil 150 g contoh tanah untuk uji bakteriofag (percobaan pertama), dan sisanya untuk pengujian kemampuan riil tanah sebagai sumber inokulum (percobaan kedua). Secara rinci kedua percobaan tersebut adalah sebagai berikut. Perkembangan populasi bakteri pustul dalam tanah Setelah masa pemberaan, dari tiap perlakuan diambil contoh tanah secara komposit sebanyak 150 g dan dimasukkan ke dalam tabung gelas steril serta ditambahkan akuades

21 steril sebanyak 100 ml dan diaduk merata. Larutan disen- trifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Su- pernatannya diambil untuk dideteksi bakterinya menggunakan IgPoured Plate MethodM. Supernatan disiapkan dalam tiga ukuran, yaitu 0.1 ml, 1 ml, dan 2 ml dalam tabung reaksi. Disamping itu, disediakan masing-masing sebanyak 2 ml suspensi bakteri pustul dari biakan murni dalam media ber- umur 3 hari dengan kepadatan lo7-lo8 sel hidup/ml. Medium SPA (llsucrose Peptone Agar") yang mengandung 20 gr agar11 medium, disediakan sebanyak 7 ml per tabung. Medium ini diletakkan di dalam penangas air yang telah diatur suhunya pada 45 C, sehingga medium tetap dalam keadaan cair, namun tidak mematikan bakteri maupun bakteriofag dalam proses se- lanjutnya. Ketiga sediaan dicampur; diawali dengan mencam- pur suspensi bakteri dan ekstrak tanah, dan kemudian segera dimasukkan ke dalam tabung mengandung SPA cair. Campuran tersebut dengan segera dimasukkan ke dalam cawan petri, dan diratakan. Inkubasi dilakukan pada suhu 28 C selama 24 jam. Jumlah plak dihitung dengan alat cacah. Bila popu- lasi patogen dalam tanah sangat rendah maka dengan teknik tersebut tidak dapat menghasilkan plak bakteriofag pada medium agar. Agar bakterinya dapat dihitung larutan contoh tanah diperkaya terlebih dahulu dengan cara ke dalam 150 g contoh ta-nah di dalam tabung gelas steril ditambahkan kul- tur bakteri yang berumur 48 jam ke dalam medium "Nutrient Brothu yang mengandung gliserin 2%. 40

22 4 1 Potensi Lahan yang Diberakan sebagai Sumber Inokulum Tiap pot yang telah diambil contoh tanahnya pada percobaan pertama, masing-masing ditanami dengan 10 benih varietas Galunggung. Pengamatan gejala penyakit pustul bakteri dilakukan pada waktu tanaman berumur 14 hari sampai 21 hari setelah tanam. Pencatatan data hanya secara kualitatif yaitu berkisar pada ada tidaknya gejala penyakit tersebut. Sebagai perlakuan cek, disediakan 10 kg tanah steril dalam pot serupa dan ditanami dengan 10 contoh benih yang digunakan pada percobaan utama. Rotasi tanaman Disediakan delapan pot plastik berdiameter 28 cm, masing-masing diisi 10 kg tanah dari bekas areal terserang pustul bakteri. Masing-masing pot ditanami kacang tanah, kacang hijau, kacang panjang, terong, padi gogo, padi sa- wah, kacang kedelai, dan bera. Setelah tanaman itu dipa- nen, tanah bekasnya kembali ditanami kedelai varietas Ga- lunggung, sebanyak 10 benih per pot. Pengamatan timbulnya gejala bakteri pustul dilakukan tiap hari. bergejala segera dicabut dan dibuang. Tanaman yang Kelangsungan Hidup Patogen dalam Serasah Serasah daun tanaman kedelai sakit sebanyak 35 g berat segar diletakkan di atas nampan plastik yang berukuran

23 panjang 30 cm, lebar 20 cm dan tinggi 5 cm, telah diberi lapisan tanah setebal 1 cm. Nampan dibenamkan pada keda- laman 15 cm dari permukaan tanah. Separoh jumlah nampan diletakkan sedemikian rupa sehingga permukaan serasah tepat di permukaan tanah. Skema cara meletakkan nampan tersebut tercantum pada Gambar 4. permukaan tanah Gambar 4. Skema penampang peletakan nampan yang berisi serasah; s = serasah, b = nampan, t = tanah, kp = kasa plastik. Permukaan nampan yang berisi serasah ditutup dengan kasa plastik agar serasah tidak terserak, terutama bagi yang dipemukaan tanah. Lahan tempat meletakkan nampan adalah lahan alang-alang, yang belum pernah ditanami kede- lai. Pengamatan populasi bakterilpatogen dalam serasah dilakukan satu kali dalam sebulan menggunakan metode bakteriofag (Jones et al., 1986). Tiap pengamatan memerlukan satu baki serasah untuk tiap perlakuan. Selama empat bulan (empat kali) pengamatan untuk tiap perlakuan diperlukan empat baki serasah. Seluruh serasah yang ada dalam tiap

24 baki perlakuan dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer 250 ml yang berisi 200 ml larutan CaC03 0.1% kemudian digoyang 43 dengan tangan selama 20 menit. Larutan yang terjadi siap untuk diperiksa. Pengamatan dilakukan satu kali dalam se- bulan dengan menggunakan metode bakteriofag (Jones et al., 1986).