EFEK PRESTORAGE LEUKOREDUCED FILTRATION (PLF) TERHADAP KADAR CD62P PADA KONSENTRAT TROMBOSIT

Transkripsi

1 EFEK PRESTORAGE LEUKOREDUCED FILTRATION (PLF) TERHADAP KADAR CD62P PADA KONSENTRAT TROMBOSIT Herawati, S 1., Sudewa-Djelantik,A.A.G 1., Sutirta Yasa, I.W.P 1., Suega, K 2. 1 Bagian Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana, Jalan. PB Sudirman Denpasar, 80114, telp , siannyherawati@yahoo.com 2 Bagian Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Jalan. PB Sudirman Denpasar, Abstrak PLF merupakan prosedur untuk mengurangi jumlah leukosit residu yang terdapat pada konsentrat trombosit sebelum dilakukan penyimpanan dengan menggunakan metode filtrasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek PLF pada konsentrat trombosit yang disimpan selama 1, 3 dan 5 hari terhadap kadar CD62P. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, menggunakan rancangan posttest only control group design, terhadap 34 konsentrat trombosit yang memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eklusi yang dikelompokkan menjadi kelompok perlakuan (mendapat perlakuan PLF) dan kelompok kontrol. Sampel penelitian diambil dari konsentrat trombosit yang dipreparasi dengan metode Platelet Rich Plasma (PRP) di Unit Donor Darah (UDD) PMI Provinsi Bali/RSUP Sanglah, kemudian dilakukan pemeriksaan kadar CD62P pada penyimpanan hari ke-1, 3 dan 5. Dilakukan uji T-independen untuk melihat perbedaan kadar CD62P pada kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Dari 17 konsentrat trombosit kelompok perlakuan dan 17 konsentrat trombosit kelompok kontrol didapatkan bahwa kadar CD62 kelompok perlakuan lebih rendah daripada kelompok kontrol baik pada penyimpanan hari ke-1, 3 dan 5 (p < 0,05). Sebagai kesimpulan PLF menurunkan kadar CD62P pada konsentrat trombosit donor yang disimpan selama 1, 3 dan 5 hari. Kata kunci: PLF, konsentrat trombosit, CD62P Abstract PLF is a procedure to reduce the number of residual leukocytes contained in platelet concentrates prior storage using a filtration method. The purpose of this study was to determine the effect of PLF on CD62P level in thrombocyte concentrates stored for 1, 3 and 5 days. This is an experimental study with posttest only control group design, enrolling 34 thrombocyte concentrates fulfilled inclusion and exclusion criteria and randomly assigned into PLF group and control group. Samples were taken from platelet concentrates prepared with Platelet Rich Plasma methods (PRP) at Indonesian Red Cross Bali Provinces/Sanglah Hospital, then examined the levels of CD62P in thrombocyte concentrate stored for 1, 3 and 5 days. Statistical analysis using independent T-test was performed to see the difference of CD62P level in PLF group and control group. From 17 thrombocyte concentrate in PLF group and 17 thrombocyte concentrate in control group, it was obtained that CD62P level in PLF group is lower than control group both on storage days 1, 3 and 5 (p< 0.05). It can be concluded that PLF decrease CD62P level in thrombocyte concentrates stored for 1, 3 and 5 days. Keywords: PLF, thrombocyte concentrate, CD62P 1. PENDAHULUAN Konsentrat trombosit adalah satu komponen darah yang penting peranannya dalam memperbaiki kondisi klinik pasien. Konsentrat trombosit sering diberikan pada penderita keganasan hematologi dan tumor padat lain. Agar konsentrat trombosit yang dihasilkan dapat memberikan efek terapeutik yang diinginkan, maka selama proses preparasi maupun selama penyimpanan, viabilitas konsentrat trombosit harus dapat dipertahankan dengan baik. Viabilitas konsentrat trombosit menunjukkan kemampuan trombosit yang telah ditransfusikan 1

2 untuk dapat bersirkulasi tanpa mengalami penghancuran dini dalam tubuh resipien. Viabilitas konsentrat trombosit ditentukan oleh faktor konsentrat trombosit itu sendiri dan faktor resipien yang menerima konsentrat trombosit. Faktor konsentrat trombosit adalah ph, suhu penyimpanan, volume plasma pada konsentrat trombosit, lama penyimpanan, agitasi selama penyimpanan, akumulasi asam laktat pada konsentrat trombosit, antikoagulan yang digunakan pada pengambilan WB, kantong darah yang digunakan dan metode preparasi konsentrat trombosit yang akan diteliti. Sedangkan faktor dari resipien diantaranya yaitu umur resipien, jenis kelamin, splenektomi, adanya perdarahan, demam, infeksi, Disseminated Intravascular Coagulation (DIC), adanya lymphocytotoxic antibody, resipien yang menerima terapi heparin atau amfoterisin dan peningkatan frekuensi transfusi trombosit (Enright et al., 2003; Slichter,2007). Trombosit yang terdapat dalam konsentrat trombosit mengalami berbagai perubahan selama pengumpulan, pemrosesan, dan penyimpanan konsentrat trombosit, yang menimbulkan perubahan struktur dan fungsi trombosit dan dapat menurunkan efektivitas transfusi konsentrat trombosit. Perubahan tersebut dikenal sebagai platelet storage lesion. Kerusakan trombosit selama penyimpanan ini menyebabkan hilangnya integritas fungsi trombosit, perubahan pada proses agregasi dan reaksi pelepasan granula trombosit, perubahan sitoskeleton dari trombosit, paparan phosphatidyl serine pada bagian luar permukaan membran trombosit dan mikrovesikulasi (Bergmeier et al., 2003; Ahmed et al., 2010). Penelitian-penelitian untuk mengatasi perubahan struktur dan fungsi trombosit yang terjadi selama penyimpanan telah banyak dilakukan, yang bertujuan untuk mempertahankan viabilitas trombosit in vitro dan in vivo. Salah satu usaha untuk mempertahankan viabilitas trombosit tersebut adalah dengan melakukan preparasi konsentrat trombosit dengan Prestorage Leukoreduced Filtration (PLF). PLF bertujuan untuk mengurangi leukosit residu yang terdapat pada konsentrat trombosit. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa leukosit residu terutama monosit merupakan sumber utama sitokin proinflamasi pada konsentrat trombosit dan adanya sitokin proinflamasi seperti Interleukin-1 beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8) dan Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) berperan dalam reaksi transfusi. Kerusakan trombosit selama preparasi dan penyimpanan juga diperkirakan disebabkan karena trombosit dapat melepaskan platelet-specific cytokine (Shaiegan et al., 2006; Walther-Wenke dan Schmidt, 2011). Kualitas trombosit dapat dilihat dari proporsi trombosit yang teraktivasi dan kerusakan trombosit ini dapat diketahui dengan melihat adanya aktivasi trombosit pada konsentrat trombosit. Jumlah trombosit yang teraktivasi dapat diketahui dan diukur dari beberapa parameter, salah satunya dengan mengukur kadar CD62P pada konsentrat trombosit. Kadar CD62P dinyatakan berkorelasi terbalik dengan peningkatan jumlah dan fungsi trombosit. Paparan CD62 pada permukaan trombosit selama penyimpanan konsentrat trombosit memicu terjadinya pembersihan trombosit melalui CD62, sehingga dikatakan bahwa CD62P dapat berperan sebagai marker aktivasi trombosit (Shaiegan et al.,2006; Levin et al., 2008; Ahmed et al.,2010; Walther-Wenke dan Schmidt,2011). Untuk menghasilkan konsentrat trombosit dengan kualitas dan viabilitas yang baik selama penyimpanan, perlu diketahui efek dari PLF secara in vitro terhadap kadar CD62P pada konsentrat trombosit yang disimpan selama 1, 3 dan 5 hari. 2. BAHAN DAN METODE Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, dengan menggunakan rancangan posttest only control group design, untuk mengetahui efek perlakuan PLF pada konsentrat trombosit yang disimpan selama 5 hari terhadap penurunan kadar CD62P. Pengambilan sampel dilakukan di Unit Donor Darah (UDD) PMI Provinsi Bali. Pemeriksaan CD62P dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Brawijaya Malang. Populasi target penelitian adalah konsentrat trombosit yang diproses dari Whole Blood (WB) donor sukarela di Bali. Populasi terjangkau adalah konsentrat trombosit yang diproses dari WB donor sukarela yang datang ke Unit Donor Darah (UDD) PMI Provinsi Bali. Sampel 2

3 penelitian adalah konsentrat trombosit yang diproses dari WB donor sukarela yang memenuhi kriteria penerimaan dan penolakan sampel. Kriteria penerimaan sampel yaitu: (1) Konsentrat trombosit diperoleh dari WB yang ditampung dalam kantong darah (triple blood bag) dengan antikoagulan CPDA. (2) Preparasi konsentrat trombosit dengan metode PRP. (3) Pemeriksaan uji saring Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, dan sifilis negatif. Kriteria penolakan sampel yaitu: (1) Terdapat hemolisis pada konsentrat trombosit (2) Konsentrat trombosit diperoleh dari donor yang mengkonsumsi obat yang mempengaruhi fungsi trombosit (aspirin, antikoagulan oral, NSAID) sebelum donor darah. Besar sampel mengacu pada hasil penghitungan dengan menggunakan rumus besar sampel menurut rumus Pocock (2008) seperti di bawah ini: n = 2 σ 2 (µ 2 - µ 1 ) 2 x f (α,β) Keterangan : n = jumlah sampel σ = simpangan baku α = kesalahan tipe 1 (α = 0,05) β = kesalahan tipe II (β = 0,1) µ 1 = rerata nilai pada kelompok kontrol µ 2 = rerata nilai pada kelompok perlakuan (µ 2 - µ 1 ) selisih besaran: merupakan efek antara kelompok perlakuan dan kontrol dapat ditentukan dengan asumsi (clinical judgement), pilot study atau dari data penelitian serupa. Nilai α ditetapkan sebesar 0,05 dan β sebesar 0,1 sehingga nilai f (α,β) adalah 10,5. Dari penelitian Ahmed,et al, 2010, diperoleh rerata jumlah CD62P pada konsentrat trombosit standar adalah 58,8 dengan simpangan baku 9,3 dan rerata kadar CD62P pada kelompok perlakuan 48,4. Dengan menggunakan rumus di atas maka diperoleh N = 16,79 dibulatkan 17. Sehingga besar sampel konsentrat trombosit masing-masing kelompok adalah 17 konsentrat trombosit. Pada penelitian ini memakai bahan penelitian berupa semua sampel darah yang diambil dari konsentrat trombosit yang diperoleh dengan metode PRP. Pemeriksaan CD62P dilakukan dalam 30 jam setelah pengambilan, dengan metode fluorescent flowcytometry dengan alat FACS Calibur. Pada kelompok kontrol, penampungan WB dilakukan secara aseptik sebanyak 350 ml ke dalam kantong darah (triple blood bag) dengan antikoagulan CPDA. Kemudian dilakukan pemrosesan untuk mendapatkan konsentrat trombosit dengan metode PRP. Untuk kelompok perlakuan, dilakukan penampungan WB secara aseptik sebanyak 350 ml ke dalam kantong darah (triple blood bag) dengan antikoagulan CPDA. Kemudian dilakukan pemrosesan untuk mendapatkan konsentrat trombosit dengan metode PRP. Kemudian dilakukan filtrasi menggunakan filter Acrodose TM PLus System (Haemonetics). Unit konsentrat trombosit yang dihasilkan disimpan pada suhu 20 24ºC diatas flatbed shaker. Sampel darah unit konsentrat trombosit dilakukan pemeriksaan CD62P pada hari ke-1, hari ke-3 dan hari ke-5 penyimpanan. Analisis data berupa uji statistik deskriptif untuk menggambarkan karakteristik kelompok perlakuan dan kontrol dan distribusi frekuensi berbagai variabel meliputi jumlah trombosit, jumlah leukosit residu dan kadar CD62P, uji normalitas data perlakuan dengan metode Shapiro-Wilk dan uji komparasi perlakuan dengan kontrol, untuk mengetahui 3

4 perbedaan kadar CD62P pada hari ke-1, 95% (CI = 95%) dengan nilai p lebih kecil atau sama dengan 0,05 sebagai batas kemaknaan. 3 dan 5 menggunakan uji T. Analisis statistik menggunakan nilai kepercayaan 3. HASIL PENELITIAN Dari penelitian ini diperoleh data dari 17 unit konsentrat trombosit kelompok perlakuan dan 17 unit konsentrat trombosit kelompok kontrol yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Karakteristik dasar dan laboratorik dari sampel konsentrat trombosit tercantum pada Tabel 1. Tabel 1. Karakteristik Dasar dan Laboratorik Sampel Konsentrat Trombosit Parameterr Yang Dievaluasi Perlakuan Rerata jumlah trombosit/unitt 2,58 x Rerata jumlah leukosit/unit 0,666 x 10 6 Rerata volume/unit 44,06 ml Skor Swirling +2 Rerata ph konsentrat trombosit 7,38 Kontrol 2,47 x ,999 x , 29 ml +2 7, Kadar CD62P Konsentrat trombosit Data rerata kadar CD62P konsentratt trombosit disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Perbedaan Rerata Kadar CD62P pada Penyimpanan Hari ke-1, 3, 5 untuk Kelompok Kontrol (tanpa PLF) dan Perlakuan (dengan PLF) Ekspresi CD62P (%) Beda rerata Nilai p Penyimpanan Kontrol (tanpa PLF) Perlakuan (dengan PLF) CD62P Hari ke-1 Hari ke-3 Hari ke-5 * signifikan p<0,05 19,78± 15,36 26,15± 11,68 26,87± 16,88 6,98±5,71 13,80±8,45 11,87±10,63 12,80 12,35 14,99 0,003* 0,001* 0,004* Gambar 1. Perbedaan rerata kadar CD62P kelompok Perlakuan (dengann PLF) dan Kontrol (tanpa PLF) pada penyimpanan hari ke-1, 3 dan 5 4

5 4. PEMBAHASAN Rerata (± SD) kadar CD62P pada kelompok perlakuan pada penelitian ini secara statistik lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol baik pada penyimpanan hari pertama (6,98±5,71 % vs 19,78±15,36 %, p = 0,003), penyimpanan hari ketiga (13,80±8,45 % vs 26,15±11,68 %, p = 0,001), maupun penyimpanan hari kelima (11,87±10,63 % vs 26,87±16,88 %, p = 0,004). Platelet yang mengekspresikan CD62P lebih rendah pada konsentrat trombosit dengan PLF karena terfiltrasi langsung oleh filter atau platelet yang mengekspresikan CD62P melekat pada sialyl Lewis X dari netrofil dan monosit yang kemudian tertahan pada filter (Krailadsiri dan Seghatchian, 2000). Penelitian Ali (2011) menyatakan bahwa terdapat peningkatan ekspresi CD62P yang progresif pada konsentrat trombosit metode PRP selama penyimpanan selama 5 hari, dan terjadi proses aktivasi trombosit lebih tinggi pada konsentrat trombosit metode PRP dibandingkan metode BC (Ali, 2011). Pada penelitian ini juga dilihat perbedaan kadar CD62P selama penyimpanan pada kelompok kontrol dan perlakuan. Didapatkan bahwa pada kelompok perlakuan ada perbedaan bermakna kadar CD62P pada penyimpanan hari pertama dengan hari ketiga namun tidak ada perbedaan bermakna pada penyimpanan hari pertama dengan kelima maupun hari ketiga dengan hari kelima. Kadar CD62P semakin meningkat hingga penyimpanan hari ke-3, namun kemudian menurun pada hari ke-5. Hal ini berkaitan dengan proses aktivasi trombosit yang masih bersifat reversibel pada hari pertama akibat proses preparasi konsentrat trombosit, kemudian selama penyimpanan terjadi aktivasi trombosit, sehingga kadar CD62P pada permukaan trombosit tinggi. Selama penyimpanan sampai hari ketiga, terjadi aktivasi trombosit yang berkelanjutan dan setelah hari ketiga hingga hari kelima, kadar CD62P relatif menurun kemungkinan karena sebagian besar trombosit telah teraktivasi pada penyimpanan hari ketiga. Trombosit teraktivasi kemudian akan kehilangan CD62P pada permukaannya namun akan menuju pada bentuk larut CD62P pada plasma. Beberapa penelitian menyarankan pengukuran kadar soluble P-selectin sebagai petanda aktivasi trombosit untuk mendeteksi trombosit yang telah mengalami degranulasi, meskipun peningkatan konsentrasi pada plasma dapat pula akibat pelepasan CD62P dari kerusakan sel endotel. Heim, dkk (2008) dan Inverardi, dkk (2002) juga menyatakan adanya penurunan Corrected Count Increment (CCI) dihubungkan dengan penyimpanan konsentrat trombosit yang berumur lebih dari 48 jam (Inverardi, dkk, 2002; Heim, dkk, 2008). 5. KESIMPULAN Kadar CD62P penyimpanan hari pertama, ketiga dan kelima pada konsentrat trombosit dengan PLF lebih rendah daripada konsentrat trombosit kontrol (tanpa PLF). 6. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada Promotor Prof.Dr.dr. AAG Sudewa Djelantik, Sp.PK(K), kopromotor I, Dr.dr. I Wayan Putu Sutirta Yasa, MSi, kopromotor II, Dr.dr. Ketut Suega, Sp.PD-KHOM, Rektor Universitas Udayana, Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Kepala Bagian dan seluruh staf Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Udayana dan Direktur UDD PMI Provinsi Bali. 7. DAFTAR PUSTAKA Ahmed,A.S., Leheta,O., Younes,S. (2010). In vitro assessment of platelet storage lesion in leucoreduced random donor platelet concentrates. Blood Transfusion, 8, pp

6 Ali, S.F. (2011). Platelet activation in stored platelet concentrates: comparison of two methods preparation. J. Blood Disord.Transfus, 2(2), pp Bergmeier,W., Burger,P.C., Piffath,C.L., Hoffmeister,K.M., Hartwig,J.H., Nieswandt,B., Wagner,D.D Metalloproteinase inhibitors improve the recovery and hemostatic function of in vitro-aged or injured mouse platelets. Blood;102: Enright,H., Davis,K., Gernsheimer,T., McCullough,J.J., Woodson,R., Slichter,S.J. (2003). Factors Influencing Moderate to Severe Reactions to PLT Transfusions: Experience of the TRAP Multicenter Clinical Trial. Transfusion, 43, pp Heim,D., Passweg,J., Gregor,M., Buser,A., Theocharides,A., Arber,C., Meyer-Monard,S., Halter,J., Tichelli,A., Gratwohl,A. (2008). Patient and product factors affecting platelet transfusion results. Transfusion, 48, pp Inverardi,D., Bocchio,C., Rossi,L., Mazzucco,L., De,PL., Borzini,P. (2002). Clinical, immunologic and technical factors affecting recovery of platelet count after platelet transfusion. Haematologica, 87, pp Krailadsiri,P., Seghatchian,J. (2000). Are all leucodepleted platelet concentrates equivalent? Vox Sang, 78, pp Levin,E., Culibrk,B., Gyongyossy-Issa,M.I.C., Weiss,S., Scammell,K., LeFresne,W., Jenkins,C., Devine,D.V Implementation of buffy coat platelet component production: comparison to platelet-rich plasma platelet production. Transfusion;48: Shaiegan,M., Pourfatollah,A.A., Namiri,M., Babaee,G. (2006). Generation of IL-8 and TNF- Alpha in Platelet Concentrates During Storage. Arch Iranian Med, 9(1), pp Slichter,S.J. (2007). Evidence-Based Platelet Transfusion Guidelines. Transfusion Medicine. American Society of Hematology, pp Walter-Wenke,G., Schmidt,M Impact of bacterial contamination on blood supply. Transfus Med Hemother;38: