BAB V. KESIMPULAN, SARAN, & RINGKASAN. V.1. Kesimpulan. Pemberian tepung labu kuning terhadap ekspresi gen IRS-1 pada tikus

Transkripsi

1 BAB V. KESIMPULAN, SARAN, & RINGKASAN V.1. Kesimpulan Pemberian tepung labu kuning terhadap ekspresi gen IRS-1 pada tikus yang diinduksi diet tinggi lemak dan fruktosa dapat menunjukkan bahwa : 1. Pemberian tepung labu kuning dapat meningkatkan ekspresi gen IRS-1 di jaringan adiposa putih dan otot skelet namun tidak berbeda secara bermakna. 2. Tingkat ekspresi gen IRS-1 di jaringan adiposa memiliki nilai lebih besar daripada di otot skelet setelah pemberian tepung labu kuning namun tidak berbeda secara bermakna. V.2. Saran 1. Dilakukan penelitian selanjutnya dengan melihat korelasi antara aktivasi IRS-1 dan ekespresi gen IRS-1 di jaringan adiposa dan otot skelet dengan tikus diabetes melitus tipe Perlu diteliti mengenai aktivitas antioksidan endogen yang terlibat pada jalur IRS-1. V.3. Ringkasan V.3.1. Latar Belakang Beberapa tahun terakhir ini, tingkat kejadian gangguan metabolisme meningkat secara signifikan. Hal ini kemungkinan besar karena perubahan gaya hidup masyarakat ke arah hidup santai (sedentary lifestyle), kurang aktivitas fisik 59

2 60 (olahraga), serta perubahan pola konsumsi makan yang cenderung mengikuti pola makan barat dengan kandungan lemak tinggi tetapi rendah serat. Kelebihan asupan makanan berupa lemak dan gula berperan penting terjadinya gangguan metabolisme. Secara khusus, asupan tinggi lemak jenuh dan gula sederhana dianggap sebagai faktor risiko yang mengawali sindrom metabolik (Aude et al., 2004), termasuk kondisi aterogenik dislipidemia, resistensi insulin (Grundy et al., 2002). Coate et al. (2010) menyatakan bahwa konsumsi diet tinggi lemak dan fruktosa yang berlangsung lama akan menginduksi keadaan proinflamasi dan menyebabkan kelainan pada jalur sinyal insulin. Resistensi insulin dianggap sebagai mekanisme kunci terjadinya obesitas, diabetes, dan penyakit jantung (Bray, 2004). Pada kondisi resistensi insulin terjadi gangguan sinyal transduksi insulin yang melibatkan dua jalur utama yaitu phosphatidilinositol 3 kinase (PI3K) dan p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Kerja insulin dalam merangsang ambilan glukosa di otot skelet dan jaringan adiposa dimediasi oleh jalur sinyal insulin yang tergantung PI3K, yang melibatkan insulin receptor substrat-1 (IRS-1) (Kim et al., 2006). PI3K berperan dalam translokasi GLUT4 dari cadangan intraseluler ke membran plasma, sehingga jika PI3K tidak aktif maka GLUT4 tidak dapat dipindahkan ke membran plasma. Hal ini menyebabkan transpor glukosa dari darah ke jaringan terganggu, yang menggambarkan patogenesis resistensi insulin (Shulman, 2000). Hiperglikemia juga diketahui memegang peranan penting dalam terjadinya resistensi insulin. Hiperglikemia dapat menyebabkan peningkatan stress oksidatif yang dapat memicu terjadinya resistensi insulin melalui jalur peningkatan

3 61 produksi reactive oxygen species (ROS) (Evans et al., 2003). Selain kemampuannya secara langsung menimbulkan kerusakan makromolekul, ROS juga dapat berfungsi sebagai molekul sinyal untuk mengaktifkan sejumlah jalur sinyal yang sensitif terhadap stres yang menyebabkan kerusakan sel. Pada keadaan in vitro, stres oksidatif dan ROS menyebabkan aktivasi beberapa kaskade serin kinase (Kyriakis & Avruch, 1996). Penurunan protein IRS-1 menyebabkan terjadi penurunan kapasitas sinyal dalam sistem. Oleh karena itu feedback negatif molekul IRS yang terlalu aktif dapat menyebabkan resistensi insulin intraseluler (White, 2002). Pencegahan dan penanganan stres oksidatif yang timbul karena produksi ROS dapat dilakukan melalui konsumsi bahan makanan yang mengandung antioksidan. Bahan makanan yang terdapat pada sayuran atau buah-buahan telah banyak diketahui, diantara buah-buahan tersebut labu kuning merupakan salah satu sumber antioksidan. Labu kuning merupakan tanaman jenis buah-buahan yang banyak ditemukan di Indonesia. Beberapa varietas labu kuning seperti C. moschata, C. maxima dan C. pepo, telah diketahui memiliki kadar karotenoid yang tinggi, terutama α dan β-karoten, β-criptoxanthina, lutein dan zeaxanthin (Rodriguez-Kimura et al., 2008). Karotenoid dapat bertindak secara langsung atau melalui produksi retinoid, melalui mekanisme yang mungkin melibatkan sifat antioksidan atau anti-free radical, tetapi juga melalui modulasi ekspresi gen, dan dengan demikian dapat menurunkan proses inflamasi dalam jaringan adiposa (Osth et al., 2014). Pada penelitian Asgary et al. (2011) diketahui bahwa pemberian tepung labu kuning pada tikus diabetik selama 4 minggu secara

4 62 signifikan menurunkan kadar insulin dan glukosa darah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Tourniaire et al. (2009) menyatakan bahwa pada pasien sindrom metabolik cenderung mengalami penurunan status karotenoid. Karoten juga diketahui sebagai peredam singlet oxygen ( 1 O 2 ) dan scavenger untuk reactive oxygen spesies (ROS) yang potensial. Konsumsi antioksidan seperti karotenoid, polifenol, dan tocopherol dapat mencegah stress oksidatif dan komplikasi yang ditimbulkan Berdasarkan uraian di atas peneliti berasumsi karotenoid dari tepung labu kuning yang dapat menurunkan stres oksidatif, secara tidak langsung mengurangi kondisi hiperglikemia dan resistensi insulin, yang pada akhirnya akan mencegah terjadinya komplikasi awal terjadinya sindroma metabolik. Oleh karena itu, analisis pengaruh potensi antioksidan (karotenoid) pada tepung labu kuning (C. moschata) terhadap ekspresi gen IRS-1 perlu dilakukan. Pemeriksaan tersebut dapat dilakukan pada jaringan adiposa putih dan otot skelet pada tikus yang diinduksi dengan diet tinggi lemak dan fruktosa. V.3.2. Landasan Teori Coate et al. (2010) menyatakan bahwa konsumsi diet tinggi lemak dan fruktosa yang berlangsung lama akan menginduksi keadaan proinflamasi dan menyebabkan kelainan pada jalur sinyal insulin. Ditambahkan pula oleh Bremer (2012) pada penelitiannya yang menyatakan bahwa asupan diet tinggi lemak dan fruktosa (DTLF) menyebabkan terjadinya resistensi insulin. Pada kondisi resistensi insulin terjadi gangguan sinyal transduksi insulin yang melibatkan dua

5 63 jalur utama yaitu Phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) dan p38 Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK). Kerja metabolik insulin untuk merangsang uptake glukosa di otot skelet dan jaringan adipose dimediasi oleh stimulasi jalur sinyal yang tergantung PI3-kinase, termasuk dalam jalur ini adalah insulin receptor substrat-1 (IRS-1) (Kim et al., 2006). PI3K berperan dalam translokasi GLUT4 dari cadangan intraseluler ke membran plasma, sehingga jika PI3K tidak aktif maka GLUT4 tidak dapat dipindahkan ke membran plasma. Transpor glukosa dari darah ke jaringan akan terganggu, proses ini menggambarkan patogenesis resistensi insulin (Shulman, 2000). Peningkatan asam lemak dalam sirkulasi menyebabkan resistensi insulin melalui sistem sinyal insulin (Dresner et al., 1999). Peningkatan konsentrasi asam lemak bebas plasma secara khusus berhubungan dengan banyaknya status resistensi insulin pada obesitas dan diabetes melitus tipe 2 (Frayne, 1993). Peningkatan asam lemak bebas dapat menyebabkan stres oksidatif karena meningkatnya mitokondria uncoupling (Wojtczak & Schonfeld, 1993; Carlsson et al., 1999), dan oksidasi (Yamagishi et al., 2001; Rao & Reddy, 2001) sehingga terjadi peningkatan produksi ROS. Stres oksidatif akan menyebabkan aktivasi jalur sinyal sensitif-stres yang selanjutnya akan memperburuk sekresi dan aktivitas insulin, yang akhirnya menyebabkan terjadinya diabetes melitus tipe 2. Stres oksidatif yang dihasilkan dari peningkatan produksi ROS berperan penting dalam patogenesis komplikasi akhir diabetes (Brownlee, 2001). Terdapat data yang menunjukkan bahwa pembentukan ROS merupakan konsekuensi langsung dari hiperglikemia (Brownlee., 2001). Pada keadaan in vitro, stres oksidatif dan

6 64 ROS menyebabkan aktivasi beberapa kaskade serin kinase (Kyriakis & Avruch, 1996). Penurunan protein IRS-1 menyebabkan terjadinya penurunan kapasitas sinyal dalam sistem. Oleh karena itu feedback negatif molekul IRS yang terlalu aktif dapat menyebabkan resistensi insulin intraseluler (White, 2002). Tourniaire et al. (2009) menyebutkan bahwa konsumsi antioksidan seperti karotenoid, polifenol, dan tocopherol dapat mencegah stress oksidatif dan komplikasi yang ditimbulkan. Karotenoid memiliki kapasitas untuk menangkap radikal peroksil dan mengikat singlet oksigen. Aktivitas mengikat dari karotenoid umumnya tergantung pada jumlah ikatan ganda terkonjugasi dari molekul dan dipengaruhi kurang lebih oleh gugus akhir karotenoid (siklik atau asiklik) atau subtituen alami pada gugus siklik akhir pada karotenoid (Krinsky, 1998). Karotenoid juga dapat bertindak secara langsung atau melalui produksi retinoid, melalui mekanisme yang mungkin melibatkan sifat antioksidan atau anti-free radical, tetapi juga melalui modulasi ekspresi gen, dan dengan demikian dapat menurunkan proses inflamasi dalam jaringan adiposa (Osth et al., 2014). V.3.3. Cara Penelitian Penelitian ini menggunakan metode kuasi eksperimental dengan rancangan postest only group design. Subyek yang digunakan adalah tikus putih jantan (Rattus Novergicus) galur Sprague Dawley usia 8 minggu dengan berat rata-rata antara gram. Perhitungan jumlah hewan coba yang digunakan, menggunakan rumus Federer (n-1) x (t-1) 15. Sampel penelitian adalah plasma darah, jaringan adiposa putih dan otot skelet hewan coba dengan besar sampel

7 65 minimal adalah 5 ekor untuk setiap kelompok perlakuan, sehingga jumlah sampel pada penelitian ini adalah 25 ekor tikus yang terbagi dalam lima kelompok. Tikus Sprague Dawley 25 ekor diadaptasi awal selama satu minggu, kemudian sebanyak 20 ekor tikus dipilih secara acak untuk induksi diet tinggi lemak dan fruktosa secara ad libitum. Setelah 25 hari induksi diet tinggi lemak dan fruktosa diperiksa kadar glukosa darah puasa (GDP), tikus dengan kadar GDP 126 mg/dl dibagi dalam 4 kelompok, yaitu kelompok tikus hiperglikemia, kelompok tikus hiperglikemia yang diberikan tepung labu kuning dengan dosis 0,16g/200gBB, kelompok tikus hiperglikemia yang diberikan tepung labu kuning dengan dosis 0,32g/200gBB dan kelompok tikus hiperglikemia yang diberikan tepung labu kuning 0,64g/200gBB. Tikus diberikan pakan standar semipurified diets for rats sebanyak 20g/tikus/hari dan minum diberikan secara ad libitum. Pembuatan tepung labu kuning menggunakan metode freeze drying. Pada metode ini dimana air yang terkandung dalam labu kuning akan diuapkan dan dibekukan sehingga diperoleh hasil akhir berupa tepung labu kuning yang kering. Setelah perlakuan selama 4 minggu, darah seluruh kelompok diambil dari sinus retroorbitalis menggunakan tabung hematokrit untuk pemeriksaan kadar GDP. Kemudian, tikus didekapitasi dengann teknik dislokasi servikal untuk pengambilan jaringan adiposa putih dan otot skelet yang akan digunakan untuk melihat ekspresi gen IRS-1. Sampel jaringan adiposa putih dan otot skelet dimasukkan ke dalam wadah khusus penampung jaringan (cryotube) dan disimpan dalam termos berisi nitrogen cair. Sampel jaringan dihomogenisasi

8 66 untuk pemeriksaan segera atau disimpan ke dalam lemari pendingin yang bersuhu -80 C. Kadar GDP dianalisis dari sampel plasma dengan metode GOD PAP (Glucose oxidase-p-amino phenazone) menggunakan kit Dyasis dan absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 500 nm menggunakan spektrofotometer. Ekspresi gen IRS-1 dianalisis dengan RT-PCR yang terdiri dari tiga tahapan analisis yaitu (1) isolasi RNA yang terdiri dari homogenasi sampel menggunakan Reagen TriZol. Kemudian, fase separasi untuk memperoleh lapisan aqueous phase yang mengandung RNA, dilanjutkan dengan presipitasi RNA dan pencucian RNA untuk memperoleh pellet RNA, kemudian dilanjutkan dengan tahap resuspensi RNA dan pengukuran konsentrasi RNA menggunakan Spektrofotometer. Tahap (2) sintesis cdna melalui reverse transcription menggunakan iscript TM cdna Synthesis kit dan tahap (3) analisis RT-PCR menggunakan SsoFast Evagreen supermix dan alat RT-PCR CFX96 Biorad dengan program amplifikasi 40 siklus yaitu: 1) denaturasi awal pada suhu 95 C selama 5 menit; 2) denaturasi pada suhu 95ºC selama 1 menit; 3) annealing pada suhu 60,7ºC selama 1 menit; 4) elongasi pada suhu 72ºC selama 1 menit; dan 5) Melt-curve analysis pada 65 C-95 C selama 2-5 detik untuk setiap tahapnya. Sinyal flourosence diukur selama amplifikasi dan hasil yang diperoleh berupa nilai cycle of threshold (C T ) pada setiap sampel yang diperiksa. Data real time-pcr pada penelitian ini menggunakan kuantifikasi relatif yang menggambarkan perbandingan antara ekspresi gen target (IRS-1) dengan gen internal kontrol (beta aktin). Untuk

9 67 menentukan perbedaan relatif tingkat ekpresi gen IRS-1 pada tiap kelompok menggunakan beta aktin sebagai control gene yang digunakan sebagai kurva standar. Kurva standar ditentukan dengan menggunakan dilusi beta aktin pada beberapa konsentrasi yaitu 0,125 µg/µl; 0,250 µg/µl ; 0,5 µg/µl ; 1 µg/µl ; 2 µg/µl. Persamaan kurva standar jaringan adiposa putih dan otot skelet dapat digunakan bila didapat R 0,900, kemudian masukkan dalam persamaan garis Y=aX+b, dimana a adalah nilai slope; b adalah nilai intercept; dan X adalah jumlah amplikon (Cq). Ekspresi IRS-1 dihitung berdasarkan jumlah amplikon (Cq) gen target masing-masing jaringan dibandingkan dengan rata-rata beta aktin setelah dimasukkan dalam persamaan kurva standar (Cq sampel:rata-rata Cq beta aktin) dan dinyatakan dalam ekspresi IRS-1 relatif terhadap beta aktin. Hasil yang diperoleh merupakan kelipatan peningkatan atau penurunan ekspresi gen target (IRS-1) dalam sampel yang diberikan tepung labu kuning relatif terhadap sampel kontrol. Data disajikan secara deskriptif dalam bentuk naratif, tabular dan grafikal. Normalitas sebaran data diperiksa menggunakan uji Shapiro-Wilk dan data sebaran normal ditampilkan sebagai rerata ± standar deviasi. Uji statistik parametrik yang digunakan adalah one-way ANOVA kemudian dilanjutkan dengan uji post hoc Tukey HSD jika terdapat perbedaan bermakna. Analisis perbandingan ekspresi gen IRS-1 di jaringan adiposa putih dan otot sekelet pada kelompok dengan hasil terbaik dibandingkan menggunakan uji t-test unpaired bila terdistribusi normal, bila tidak normal menggunakan uji Mann Whitney.

10 68 V.3.4. Hasil Hewan coba yang digunakan sebagai subjek pada penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Sprague Dawley (Rattus novergicus) yang diperoleh dari Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) Jakarta. Sebanyak 25 ekor dibagi ke dalam 5 kelompok, yaitu kelompok tikus normal (K1), kelompok tikus hiperglikemia (K2), kelompok hiperglikemia + tepung labu kuning dosis 0,16g/200gBB/hari (K3), kelompok hiperglikemia + tepung labu kuning dosis 0,32g/200gBB/hari (K4), dan kelompok hiperglikemia + tepung labu kuning dosis 0,64g/200gBB/hari (K5). Tikus dipilih sebagai hewan coba karena lebih mudah dikontrol dari segi asupan pakan sehingga dapat memperkecil terjadinya bias saat penelitian. Pemilihan jenis kelamin jantan karena tidak terpengaruh secara hormonal seperti tikus betina. Tikus yang digunakan pada penelitian ini berumur 8 minggu dengan berat badan antara gram. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua kelompok tikus mengalami peningkatan berat badan dari 264,40 ± 23,32 gram menjadi 314,20 ± 45,97 gram. Tikus hiperglikemia yaitu 258,80 ± 24,24 gram menjadi 293,60 ± 25,69 gram, kelompok tikus hiperglikemia yang diberi dosis tepung labu kuning 0,16g/200g BB yaitu 267,00 ± 23,30 gram menjadi 340,00 ± 32,98 gram, kelompok tikus hiperglikemia yang diberi dosis tepung labu kuning 0,32g/200g BB yaitu 256,20 ± 27,97 gram menjadi 297,00 ± 31,77 gram, dan kelompok tikus hiperglikemia yang diberi dosis tepung labu kuning 0,64g/200g BB yaitu 280,80 ± 19,31 gram menjadi 312,60 ± 45,29 gram.

11 69 Berat badan tikus dari hasil pengukuran setiap minggu selama empat minggu intervensi tepung labu kuning masing-masing kelompok mengalami peningkatan berat badan yang signifikan. Peningkatan berat badan tikus dapat disebabkan oleh faktor pertumbuhan dan asupan pakan selama penelitian. Tikus yang diinduksi diet tinggi lemak dan fruktosa umumnya akan mengalami kenaikan berat badan dibandingkan dengan tikus normal. Tranchida et al. (2012) melaporkan bahwa tikus yang diinduksi diet tinggi fruktosa dan lemak jenuh selama 30 minggu mengalami kenaikan berat badan relatif sebesar 11% terhadap kelompok kontrol. Peningkatan berat badan diduga karena diet tinggi fruktosa dan lemak ini dapat memicu sintesis gen-gen lipogenik yang menginduksi terjadinya lipogenesis yang akan meningkatkan produksi trigliserida dan kolesterol sehingga terjadi peningkatan lemak viseral dan berat badan. Pada penelitian ini, tikus yang diinduksi diet tinggi lemak dan tinggi fruktosa mengalami peningkatan kadar glukosa darah puasa rata-rata mg/dl. Pada pemeriksaan glukosa darah puasa diketahui bahwa kelompok yang diinduksi diet tinggi lemak dan tinggi fruktosa (K2=hiperglikemia; K3=0,16g; K4=0,32g; K5=0,64g) memiliki kadar glukosa darah jauh lebih tinggi jika dibandingkan dengan tikus sehat (K1=Sehat). Hal ini sejalan dengan penelitian Tranchida et al. (2012) dimana kadar insulin plasma dan glukosa puasa juga signifikan lebih tinggi pada kelompok diet tinggi fruktosa dan lemak jenuh selama durasi diet. Pemberian induksi diet tinggi lemak dan fruktosa selama 25 hari kemudian dilanjutkan dengan intervensi tepung labu kuning yang diberikan selama empat minggu, memberikan pengaruh terhadap glukosa darah. Rerata delta

12 70 glukosa darah puasa antara kelompok intervensi (K3, K4, & K5) dengan kelompok hiperglikemia berbeda bermakna. Hal ini sejalan dengan yang dilaporkan Sedigheh et al. (2011) bahwa pemberian tepung labu kuning menurunkan kadar glukosa secara signifikan. Tikus diabetes dibandingkan yang terdapat pada tikus kelompok kontrol tanpa perlakuan. Perubahan tingkat ekspresi gen IRS-1 tiap kelompok yang diukur setelah 28 hari pemberian tepung labu kuning. Ekspresi gen IRS-1 di adiposa dan otot skelet memiliki distribusi yang normal secara statistik (p>0,05) diuji menggunakan Saphiro-Wilk. Perbedaan tingkat ekspresi gen IRS-1 antar kelompok perlakuan terhadap kelompok hiperglikemia tidak memiliki perbedaan yang bermakna (p<0,05) baik di jaringan adiposa maupun otot skelet setelah diuji dengan one way ANOVA. Hal ini pun terjadi ketika di uji dengan uji t tidak berpasangan untuk menunjukkan perbedaan tingkat ekspresi gen IRS-1 pada masing-masing kelompok di jaringan adiposa dan otot skelet yang tidak memiliki perbedaan bermakna (p<0,05). Efek antioksidan dari pemberian tepung labu kuning secara umum dan karotenoid secara khusus dipengaruhi oleh variasi dosis yang diberikan pada tikus. Ekspresi IRS-1 di jaringan adiposa putih pada kelompok K1(sehat): 4,09±0,17; K3: 4,00±0,04; K4: 4,10±0,14; dan K5: 4,08±0,07 sedangkan di jaringan otot skelet kelompok K1(sehat): 4,04±0,07; K3: 3,94±0,06; K4: 4,06±0,04; dan K5: 3,98±0,10 dengan pemberian dosis pada masing-masing kelompok sebesar K4:0,32 g/200 g BB, K3:0,16 g/200 g BB, dan K5:0,64 g/200 g BB. Hasil penelitian didapatkan bahwa ekspresi IRS-1 di jaringan adiposa putih dan otot skelet pada K4 mendekati ekspresi IRS-1 pada

13 71 tikus normal K1 tetapi pada K3 dan K5 ekspresi IRS-1 lebih rendah dibandingkan dengan kelompok normal, meski tidak berbeda secara bermakna. Dosis tepung labu kuning kelompok empat yang diberikan sebesar 0,32 g merupakan dosis optimal untuk menaikkan ekspresi gen IRS-1 ke kondisi yang sama atau mendekati tikus normal. Hasil konversi dosis tersebut ke manusia menggunakan faktor konversi 0,56 (Ngatidjan, 2006) maka dosis ini setara dengan 17,92 g tepung labu kuning per hari untuk manusia dengan berat 70 kg. Kandungan karoten dalam tepung labu kuning adalah 404,508 µg/gram sehingga karoten dalam 17,92 gram tepung labu kuning adalah 7248,78 µg atau setara dengan 604 µg vitamin A. Menurut Angka Kecukupan Gizi (AKG) tahun 2013 kebutuhan vitamin A orang dewasa adalah 600 µg/hari. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian tepung labu kuning 0,32 g/200 g BB yang mengandung karotenoid sebagai antioksidan dapat memberikan efek terbaik sebagai dosis optimal, sehingga dosis 17,92 g tepung labu kuning dapat diberikan ke manusia karena dapat meningkatkkan ekspresi gen IRS-1 yang dapat mencegah terjadinya komplikasi awal terjadinya sindroma metabolik. Karotenoid yang terdapat dalam labu kuning diketahui memiliki kapasitas untuk menangkap radikal peroksil dan mengikat singlet oksigen (Krinsky, 1998), akibat induksi diet tinggi lemak dan tinggi fruktosa. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa karotenoid berpengaruh terhadap ekspresi gen dan fungsi sel melalui beberapa mekanisme seperti (a) interaksi dengan beberapa faktor transkripsi dari nuclear receptor superfamily (b) mengganggu aktivitas faktor transkripsi lain seperti nuclear factor κb (NF- κb) (c) modulasi jalur sinyal yang

14 72 dihubungkan dengan inflamasi dan respon stres oksidatif (d) melalui aktivitas ekstragenomik mencakup scavenging reactive species dan aktivasi protein kaskade kinase (Bonet et al., 2012; Breitman et al., 1996; Tanoury, 2013; Kaulmann et al., 2014). Akibat induksi diet tinggi lemak dan fruktosa kemungkinan karotenoid berperngaruh terhadap ekspresi gen melalui beberapa mekanisme tersebut. IRS-1 diketahui bekerja pada regulasi metabolisme sinyal insulin di jaringan adiposa dan otot skelet (Biddinger and Kahn, 2006). Tingkat ekspresi gen IRS-1 antar kelompok didapatkan bahwa di jaringan adiposa memiliki nilai ekspresi yang lebih besar daripada di otot skelet meskipun tidak berbeda signifikan. Diketahui bahwa jaringan adiposa merupakan target dari aktivitas dan tempat untuk penyimpanan karotenoid (Parker, 1989). Didalam adiposit, karotenoid terutama disimpan dengan triasilgliserol dalam lipid droplet dan juga ditemukan dalam sel membran (Gouranton et al., 2008). Pada manusia, kadar karotenoid dalam cadangan abdominal menunjukkan hubungan yang kuat dengan asupan dan konsentrasi plasma (Chung et al., 2009). Diketahui fungsi utama karotenoid pada manusia adalah sebagai prekursor vitamin A terkait retinoid seperti retinol, retinal, dan asam retinoat yang berperan penting dalam regulasi gen terkait banyak proses perkembangan dan fisiologis (Grune et al., 2010). Beberapa penelitian dengan berbagai macam pengaturan dan durasi yang berbeda dalam pemberian beta karoten menunjukkan terjadinya penurunan adiposit dan memicu toleransi glukosa dan sensitifitas insulin pada tikus obes (Bonet et al., 2015). Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa di jaringan adiposa

15 73 mengalami peningkatan gen IRS-1 daripada di otot skelet hal ini kemungkinan karena metabolime karotenoid terjadi di jaringan adiposa. Ekspresi IRS-1 pada kelompok K3 (tikus hiperglikemia yang diberi 0,16 gram tepung labu kuning) dan kelompok K5 (tikus hiperglikemia yang diberi 0,64 gram tepung labu kuning) tidak berbeda signifikan dengan kelompok K2 (tikus hiperglikemia). Kelompok K3 (dosis 0,16 g) dan K5 (dosis 0,64 g) yang diberi perlakuan tepung labu kuning tidak menunjukkan peningkatan ekspresi IRS-1 dibandingkan kelompok normal. Ekspresi IRS-1 pada kedua kelompok K3 dan K5 cenderung lebih rendah dibandingkan kelompok normal. Pemberian dosis yang lebih rendah memungkinkan kurangnya aktivitas antioksidan sedangkan konsentrasi karotenoid yang tinggi dapat memiliki efek prooksidatif, yang kemungkinan dimodifikasi oleh interaksi dengan nutrien lain (Gaziano et al., 1995). Kelebihan karotenoid dapat berkontribusi terjadinya stres oksidatif khususnya di jaringan adiposa. Paparan akibat kelebihan karotenoid pada preadiposit manusia menghasilkan penurunan potensial membran mitokondria, respirasi mitokondria, dan kandungan ATP seluler, yang mengindikasikan terjadinya gangguan fungsi mitokondria (Bonet et al., 2015). Rendahnya ekspresi protein IRS-1 dihubungkan dengan rendahnya kadar mrna (Carvalho et al., 1999). Pada penelitian ini terjadi penurunan kadar glukosa darah pada tikus yang diberikan tepung labu kuning, namun ekspresi IRS-1 tidak meningkat signifikan. Hal ini dimungkinkan karena terjadinya peningkatan aktivasi IRS-1 namun tidak terjadi peningkatan ekspresi/jumlah mrna IRS-1, sehingga diperlukan penelitian selanjutnya untuk melihat tingkat aktivasi IRS-1. Hal ini sejalan dengan penelitian

16 74 yang dilakukan oleh Li et al. (2014) yang menyatakan bahwa tikus yang diinduksi diet tinggi fruktosa, tidak mengubah ekspresi gen IRS-1 pada jaringan adiposa, tetapi mempengaruhi aktivasi IRS-1. Ekspresi IRS-1 yang rendah pada penelitian ini dimungkinkan karena adanya peningkatan fosforilasi serin IRS-1. Diet tinggi lemak dan fruktosa menyebabkan peningkatan glukosa dan asam lemak bebas yang berakibat pada terjadinya stres oksidatif dengan mengaktivasi jalur sinyal sensitif-stres. Jalur aktivasi ini berakibat pada terganggunya sekresi dan aktivitas insulin (Evans et al., 2003). Jalur sinyal sensitif-stres meningkatkan fosforilasi serin/treonin sehingga menurunkan kemampuan molekul IRS untuk berhubungan atau berikatan dengan insulin reseptor dan melanjutkan sinyal berikutnya khususnya PI3K, hal ini berdampak pada terganggunya aktvitas insulin seperti aktivasi protein kinase B (PKB) dan transpor glukosa (Zick, 2000; Birnbaum, 2001). Kandungan karotenoid yang terdapat pada tepung labu kuning dengan pemberian dosis sebesar 0,16 g dan 0,64 g kemungkinan belum memberikan dampak besar untuk menekan peningkatan ROS yang ditimbulkan oleh diet tinggi lemak dan fruktosa, sehingga menurunkan kemampuan molekul IRS-1 berikatan dengan reseptor insulin dan menyebabkan IRS-1 terdegradasi. Protein IRS kemungkinan juga diregulasi oleh penurunan kadar ekspresi protein. Hiperinsulinemia diketahui menurunkan ekspresi IRS-1 di jaringan pada mencit (Hirashima et al., 2003). Dua mekanisme yang mungkin dapat menjelaskan efek ini. Pertama, hiperinsulinemia menginduksi degradasi protein IRS-1, kedua, beberapa penelitian menunjukkan bahwa protein SOCS yang mungkin menginduksi degradasi IRS-1 dimediasi oleh

17 75 ubiquitin (Taniguchi et al., 2006). Tanpa memperhatikan mekanisme, penurunan kadar protein IRS-1, dipasangkan dengan penurunan kadar IR itu sendiri, yang berkontribusi pada resistensi insulin pada kondisi diabetes baik di manusia dan hewan pengerat (Shimomura, et al., 2000). V.3.5. Kesimpulan Pemberian tepung labu kuning terhadap ekspresi gen IRS-1 pada tikus yang diinduksi diet tinggi lemak dan fruktosa dapat menunjukkan bahwa : 1. Pemberian tepung labu kuning dapat meningkatkan ekspresi gen IRS-1 di jaringan adiposa putih dan otot skelet namun tidak berbeda secara bermakna. 2. Tingkat ekspresi gen IRS-1 di jaringan adiposa memiliki nilai lebih besar daripada di otot skelet setelah pemberian tepung labu kuning namun tidak berbeda secara bermakna.