HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 27 HASIL DAN PEMBAHASAN Tahap I. Karakteristik Spermatozoa Domba Sebelum dan Setelah Pembekuan Karakteristik Spermatozoa Domba Sebelum Pembekuan Karakteristik spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat sebelum pembekuan untuk penelitian ini ditampilkan pada Tabel 1. Tabel 1. Karakteristik spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat sebelum pembekuan Sumber asal Ulangan Parameter spermatozoa (n) Motilitas (%) Integritas membran (%) Viabilitas (%) Abnormalitas (%) Kauda epididimis 5 74,00±4,18 88,06±5,79 94,05±2,79 1,62±0,59 Ejakulat 5 78,00±2,74 84,07±2,18 91,19±0,93 1,77±0,50 Hasil penelitian menunjukkan bahwa karakteristik spermatozoa dari kauda epididimis meliputi motilitas, viabilitas, integritas membran dan abnormalitas sebelum pembekuan tidak berbeda dengan spermatozoa dari ejakulat (P>0,05). Persamaan karakteristik spermatozoa sebelum pembekuan yang berasal dari kauda epididimis dan ejakulat juga dilaporkan Varisli et al. (2009) bahwa persentase motilitas dan integritas membran spermatozoa domba dari kauda epididimis tidak menunjukkan perbedaan dengan spermatozoa dari ejakulat. Begitu pula yang dilaporkan Alvarez et al. (2009) bahwa persentase motilitas spermatozoa domba dari kauda epididimis tidak berbeda dengan spermatozoa dari ejakulat. Penelitian pada spesies lain seperti rusa merah, keledai dan kuda diperoleh persentase motilitas spermatozoa dari ejakulat lebih tinggi dibandingkan dari kauda epididimis (Martinez et al. 2008; Gloria et al. 2011; Monteiro et al. 2011). Sedangkan untuk viabilitas, Blash et al. (2000) melaporkan bahwa persentase viabilitas spermatozoa kambing dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan dari ejakulat yang ditampung menggunakan vagina buatan. Hasil serupa juga dilaporkan Gloria et al. (2011) pada keledai dan Alvarez et al. (2009) pada domba, dimana persentase viabilitas spermatozoa dari kauda epididimis lebih tinggi dari ejakulat.

2 28 Persamaan karakteristik spermatozoa pada penelitian ini berkaitan dengan keberadaan spermatozoa sebelum diejakulasikan berada di kauda epididimis yang berfungsi sebagai tempat penyimpanan dan pematangan spermatozoa, mempertahankan metabolisme dan mencegah terjadinya aktivasi dini dari spermatozoa sebelum diejakulasikan (Sostaric et al. 2008). Kondisi lingkungan di kauda epididimis yang spesifik memungkinkan spermatozoa bertahan hidup selama beberapa minggu sampai diejakulasikan (Moore 1995). Selain itu, persamaan karakteristik spermatozoa yang berasal dari kauda epididimis dengan ejakulat dikarenakan kesamaan dalam aktivitas translokasi dan distribusi fosfolipid yang merupakan sifat mendasar bagi membran plasma spermatozoa dalam rangka persiapan untuk proses fertilisasi (Muller et al. 1994). Menurut Cooper (1999), selama pematangan spermatozoa di kauda epididimis, banyak glikoprotein dan peptida yang dikeluarkan oleh kelenjar kelamin pelengkap menempel pada permukaan spermatozoa dengan berbagai afinitas dan akan memberikan pengaruh yang sama pada fungsi membran seperti halnya spermatozoa dari ejakulat. Berbeda halnya dengan yang dilaporkan Garner et al. (2000) bahwa kehadiran immobilin pada kauda epididimis dapat meningkatkan viskositas cairan epididimis dan mengurangi motilitas spermatozoa. Immobilin merupakan suatu protein yang disekresikan oleh sel-sel utama antara daerah distal dan kaput epididimis pada hewan yang telah mencapai dewasa kelamin dan berfungsi membuat spermatozoa berkurang motilitasnya dengan menciptakan kondisi lingkungan epididimis yang visko elastis ketika spermatozoa berada pada kauda epididimis (Hermo et al. 1994). Data karakteristik spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat sebelum pembekuan yang diperoleh (Tabel 1) menunjukkan bahwa spermatozoa tersebut memiliki kualitas yang baik dan memenuhi syarat untuk proses kriopreservasi. Kriteria spermatozoa segar yang dapat digunakan untuk proses kriopreservasi dan sebagai dasar penentuan fertilitas pejantan dengan kategori sangat baik harus memiliki persentase motilitas spermatozoa >50%, persentase viabilitas spermatozoa >90% (Pezzanite et al. 2012) dan persentase integritas membran spermatozoa 60% (Revell & Mrode 1994).

3 29 Karakteristik Spermatozoa Domba selama Proses Kriopreservasi Persentase motilitas, viabilitas dan integritas membran spermatozoa baik dari kauda epididimis maupun ejakulat sebelum pembekuan, setelah ekuilibrasi I dan II, maupun setelah pembekuan mengalami penurunan (Gambar 3, 5 dan 7), berbeda halnya dengan persentase abnormalitas yang mengalami peningkatan (Gambar 9). Hasil ini menunjukkan bahwa baik spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat tidak rentan terhadap kejutan dingin akibat penurunan suhu selama proses kriopreservasi. Spermatozoa mengalami perubahan seluler, biokimia dan osmotik selama pematangan di epididimis dan setelah penambahan plasma semen saat ejakulasi. Perubahan ini termasuk penurunan dramatis dalam komposisi membran lipid yang kemudian dapat mempengaruhi karakteristik biologi spermatozoa saat kriopreservasi, permeabilitas krioprotektan dan perubahan fase membran plasma selama pendinginan (Yeung et al. 2006). Kriopreservasi dapat mengakibatkan kerusakan fungsional membran mencakup peningkatan fluiditas membran yang diperburuk oleh kejutan osmotik pada membran yang terjadi ketika sel mengalami dehidrasi ekstrim selama proses pendinginan (Cross 1998). Proses kriopreservasi menyebabkan berkurangnya integritas akrosom, kerusakan fungsi spermatozoa dan perubahan dalam fluiditas membran, agregasi fosfolipid dan protein, yang berkaitan dengan penurunan aktivitas enzim, motilitas, viabilitas dan kemampuan fertilisasi spermatozoa (Watson 1995; Thundathil et al. 1999). Lengwinat & Blottner (1994) melaporkan penurunan motilitas dan integritas akrosom setelah thawing. Proses cooling pada kriopreservasi spermatozoa dapat menekan aktivitas metabolisme sel spermatozoa sehingga menyebabkan konsumsi energi secara signifikan berkurang dan sensitivitas kejutan dingin ditandai oleh hilangnya permeabilitas dan integritas membran plasma spermatozoa secara ireversibel yang mengarah kepada gangguan dan kematian spermatozoa (Robertson et al. 1990). Penurunan persentase motilitas, viabilitas dan integritas membran spermatozoa baik dari kauda epididimis maupun ejakulat selama proses kriopreservasi selain disebabkan oleh faktor kejutan dingin juga karena adanya perubahan intraseluler akibat pengeluaran air yang berkaitan dengan pembentukan

4 30 kristal es. Pembentukan kristal es selama proses kriopreservasi sel spermatozoa menyebabkan terjadinya penumpukan elektrolit di dalam sel yang mengakibatkan terjadi kerusakan sel secara mekanik. Elektrolit yang menumpuk akan merusak dinding sel spermatozoa, sehingga pada waktu thawing permeabilitas membran plasma utuh akan menurun dan spermatozoa mengalami kematian. Pembentukan kristal es kemungkinan berkaitan dengan perubahan tekanan osmotik dalam fraksi yang tidak mengalami pembekuan (Watson 2000). Selain itu, pada saat koleksi dan pengolahan spermatozoa sebelum dikemas di dalam straw, terjadi kontak antara spermatozoa dan udara luar yang mengandung oksigen. Hal ini mengakibatkan meningkatnya aktivitas metabolisme oksidatif yang juga berarti meningkatnya konsentrasi radikal bebas sebagai salah satu produk metabolisme. Radikal bebas sangat berbahaya bagi kelangsungan hidup spermatozoa, karena radikal bebas memiliki sifat yang sangat reaktif untuk memperoleh elektron melalui reaksi peroksidasi lipid. Radikal bebas mengambil elektron dari asam lemak tak jenuh fosfolipid membran plasma sel, dapat mengakibatkan reaksi rantai peroksidasi lipid yang berlangsung terus menerus (autokatalitik) hingga akhirnya merusak seluruh membran plasma sel spermatozoa (Holt 2000). Hasil yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan persentase motilitas, integritas membran dan viabilitas spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat setelah thawing masih cukup tinggi dan dapat dipertahankan sampai tahap ekuilibrasi 2 meskipun mengalami penurunan setelah pembekuan dan thawing. Penggunaan medium NSF I dan NSF II dengan kandungan kuning telur dan Orvus ES Paste diduga dapat melindungi spermatozoa terhadap kejutan dingin. Di dalam kuning telur terdapat lesitin yang dapat mempertahankan motilitas spermatozoa dari kejutan dingin karena kandungan phosphatidylcholine (Kikuchi et al. 1998). Kandungan phovitin, ceruloplasmin, ovalbumin dan ovotransferrin yang terdapat pada kuning telur dapat menghilangkan ion logam bebas yang dapat mengkatalisis produksi Reactive Oxygen Species (ROS). Begitu pula protein yang mirip dengan ekstraselular superoksida dismutase dan plasma glutathione peroksidase pada kuning telur dapat berkontribusi dalam meningkatkan kapasitas antioksidan (Mann & Mann 2008).

5 31 Penggunaan Orvus ES Paste bersamaan dengan kuning telur berfungsi mengubah struktur tersier lipoprotein kuning telur dalam media ekstraseluler yang berperan untuk melindungi membran spermatozoa (Pena & Linde 2000). Morton et al. (2010) melaporkan bahwa penggunaan Orvus ES Paste dapat meningkatkan persentase motilitas spermatozoa setelah thawing. Penggunaan Orvus ES Paste pada penelitian ini dengan komponen aktif berupa sodium dodecyl sulphate (SDS) diduga dapat meningkatkan integritas membran spermatozoa setelah thawing. Penggunaan Orvus ES Paste dapat melindungi membran spermatozoa dalam menjalankan fungsinya untuk mengatur transportasi Ca 2+ ektrasellular kedalam sel dan mengurangi perubahan pada proses kapasitasi serta menyebabkan pemasukan kalsium dengan konsentrasi tinggi setelah thawing (Pena et al. 2003). Storm et al. (2000) melaporkan bahwa penggunan Orvus ES Paste dapat memperpanjang daya hidup spermatozoa, meningkatkan kemampuan spermatozoa dalam mengikat zona dan menstabilkan mekanisme membran spermatozoa didalam mencegah proses kapasitasi dini. Selain itu, Pena & Linde (2000) melaporkan bahwa komponen aktif pada Orvus ES Paste yaitu sodium dodecyl sulphate (SDS) dalam bahan pengencer dapat meningkatkan viabilitas dan fluiditas membran plasma spermatozoa setelah thawing. Efisiensi penggunaan Orvus ES paste dalam meningkatkan viabilitas spermatozoa dikarenakan efek stabilitas dari membran lipid spermatozoa untuk meminimalkan proses kapasitasi dini dan kerusakan spermatozoa sebagai akibat dari kriopreservasi (Watson 1995). Motilitas Spermatozoa Domba selama Proses Kriopreservasi Motilitas spermatozoa telah lama dianggap sebagai kriteria utama dalam penilaian kualitas spermatozoa dan kemampuan fertilisasi dari hewan jantan. Persentase motilitas spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat selama proses kriopreservasi ditampilkan pada Gambar 3. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata (P<0,05) pada persentase motilitas spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat saat ekuilibrasi ke-2 (65,00±3,54% vs 72,00±4,47%) dan setelah thawing (48,00±4,47% vs 54,00±2,24%), dimana persentase motilitas spermatozoa dari kauda epididimis lebih rendah dibandingkan ejakulat. Fenomena rendahnya

6 32 persentase motilitas spermatozoa dari kauda epididimis setelah thawing dibandingkan ejakulat juga dilaporkan Hermansson & Axner (2007) bahwa persentase motilitas spermatozoa kucing dari kauda epididimis dan ejakulat masing-masing sebesar 53,8% dan 72,5%. Hasil serupa juga dilaporkan Martinez- Pastor et al. (2006) bahwa persentase motilitas spermatozoa rusa merah Iberian setelah thawing adalah 17,50% untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan 52,50% untuk spermatozoa dari ejakulat. Gambar 3. Persentase motilitas spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat selama proses kriopreservasi. Dalam setiap tahapan kriopreservasi, bar dengan huruf yang berbeda (a,b,c; x,y) menunjukkan perbedaan yang nyata untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat (P<0,05). (*) menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) pada persentase motilitas diantara sumber spermatozoa. Persentase motilitas spermatozoa dari ejakulat yang lebih tinggi dikarenakan keberadaan plasma semen yang memberikan pengaruh terhadap motilitas spermatozoa (Goovaerts et al. 2006). Motilitas spermatozoa terjadi karena adanya protein khusus yang disebut dynein di mikrofibril eksternal pada ekor spermatozoa. Protein ini berfungsi sebagai enzim ATP-ase untuk mengkonversi adenosin triphosphate (ATP) menjadi adenosin monophosphate (AMP) dan dua anorganik ion phosphate (Pi). Proses ini menghasilkan energi tinggi yang dapat menginduksi kontraksi dari mikrofibril dan pergerakan sperma

7 33 (Rizal et al. 2003). Komponen dari plasma semen berupa fruktosa, sorbitol, asam sitrat, inositol, gliseril fosforil kolin (GPC), ergothionine, natrium, kalium, kalsium, magnesium, dan klorida merupakan zat penting untuk membran dan sebagai sumber energi untuk menghasilkan ATP (Hafez & Hafez 2000). Mackenna (1995) melaporkan bahwa persentase motilitas progresif dari spermatozoa ejakulat berhubungan erat dengan aktivitas mitokondria terutama dalam hal pengaturan energi untuk motilitas spermatozoa sebagai salah satu penentu utama kemampuan fertilisasi. Respirasi spermatozoa dari ejakulat lebih cepat dibandingkan spermatozoa dari kauda epididimis, sehingga mendorong aktivitas mitokondria yang lebih cepat dalam pemanfaatan energi yang dipakai (Cooper 2005). Adenosine triphosphate (ATP) dari mitokondria memberikan kontribusi untuk motilitas spermatozoa tetapi tidak selalu menjadi penentu utama dalam hal viabilitas spermatozoa (Hung et al. 2008). Hasil penelitian ini berbeda dengan yang dilaporkan oleh Tebet et al. (2006) bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan pada persentase motilitas spermatozoa kucing setelah thawing baik yang berasal dari kauda epididimis dengan ejakulat. Hasil serupa juga dilaporkan oleh Monteiro et al. (2011) bahwa persentase motilitas spermatozoa kuda setelah thawing adalah 36,2% untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan 33% untuk spermatozoa dari ejakulat. Berbeda halnya dengan yang dilaporkan Alvarez et al. (2009) dengan penggunaan Biladyl (Minitube, Tiefenbach, Germany) sebagai bahan pengencer untuk kriopreservasi spermatozoa domba Black Manchega, dimana persentase motilitas spermatozoa dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan dari ejakulat yang dikoleksi dengan elektroejakulator (57,50% vs 36,67%). Integritas Membran Spermatozoa Domba selama Proses Kriopreservasi Unsur penting dari membran spermatozoa adalah kemampuannya dalam transportasi molekul secara selektif. Jika berada dalam kondisi yang hipoosmotik, air akan masuk ke dalam spermatozoa untuk mencapai keseimbangan osmotik sehingga dapat diasumsikan bahwa kemampuan ekor spermatozoa yang mengalami penggembungan (swollen) dengan adanya larutan hipoosmotik menunjukkan bahwa membran spermatozoa dalam kondisi utuh dan ditandai

8 34 dengan spermatozoa yang melingkar (Gambar 4.a). Hal ini tidak muncul pada spermatozoa yang membran plasmanya tidak utuh ditandai dengan ekor lurus (Gambar 4.b). Spermatozoa dengan ekor melingkar ketika berada pada kondisi hipoosmotik menandakan bahwa transportasi air melintasi membran berjalan normal dan membran memiliki fungsi yang normal (Tartaglion & Ritta 2004). Spermatozoa dengan ekor lurus menunjukkan efek perubahan suhu atau kejutan osmotik dan kerusakan midpiece spermatozoa yang disebabkan pemaparan kejutan dingin atau lingkungan yang hipotonik (Bissett & Bernard 2005). Gambar 4. Gambaran integritas membran spermatozoa domba. Spermatozoa dengan membran plasma utuh (ekor melingkar, a) dan spermatozoa dengan membran plasma tidak utuh (ekor lurus, b). Hasil yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan bahwa persentase integritas membran spermatozoa setelah thawing dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan ejakulat (Gambar 5). Fenomena tingginya persentase integritas membran spermatozoa setelah thawing dari kauda epididimis dibandingkan ejakulat juga dilaporkan Martinez-Pastor et al. (2006) pada rusa merah Iberian. Hasil serupa juga dilaporkan Yulnawati et al. (2008) bahwa persentase integritas membran spermatozoa kerbau belang dari kauda epididimis setelah thawing lebih tinggi dibandingkan ejakulat. Berbeda halnya dengan yang dilaporkan Monteiro et al. (2011) bahwa persentase integritas membran

9 35 spermatozoa kuda setelah thawing dari kauda epididimis tidak menunjukkan perbedaan dengan spermatozoa dari ejakulat. Gambar 5. Persentase integritas membran spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat selama proses kriopreservasi. Dalam setiap tahapan kriopreservasi, bar dengan huruf yang berbeda (a,b; x,y) menunjukkan perbedaan yang nyata untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat (P<0,05). (*) menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) pada persentase integritas membran diantara sumber spermatozoa. Persentase integritas membran spermatozoa setelah thawing dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan ejakulat disebabkan karena spermatozoa yang berasal dari kauda epididimis belum terkena sekresi kompleks dari kelenjar kelamin pelengkap, dimana sekresi ini dapat mengubah sensitivitas pada saat pendinginan dan resistensi pembekuan seperti pada spermatozoa dari ejakulat (Yu et al. 2002). Spermatozoa yang didinginkan pada temperatur di bawah titik beku air akan mengalami kerusakan membran plasma secara ireversibel. Kandungan kolesterol yang tinggi selama pematangan spermatozoa di kauda epididimis dapat menstabilkan membran spermatozoa dari efek kejutan dingin selama proses cooling yang diakibatkan kadar asam lemak jenuh yang tinggi dalam fosfolipid (Parks 1997). Berbeda halnya dengan spermatozoa dari ejakulat, spermatozoa bercampur dengan plasma semen dimana kandungan komponen yang terdapat di dalamnya berinteraksi memodifikasi fungsi spermatozoa sehingga mengubah sifat

10 36 dan respon dari membran spermatozoa terhadap perlakuan yang berbeda (White 1993). Membran plasma spermatozoa mengandung asam lemak tak jenuh yang rentan terhadap kerusakan peroksidasi dikarenakan perubahan ph yang dihasilkan dari reactive oxygen species selama inkubasi aerobik sehingga mengakibatkan hilangnya integritas membran dan akhirnya berdampak pula pada penurunan fertilitas (Yaniz et al. 2008). Plummer & Watson (1985) melaporkan bahwa kejutan dingin berakibat pada berkurangnya integritas akrosom dan membran plasma pada spermatozoa domba dari ejakulat. Telah dilaporkan juga oleh Rath & Niemann (1997) bahwa spermatozoa dari kauda epididimis babi lebih resisten terhadap kejutan dingin dibandingkan dari ejakulat. Menariknya, Gilmore et al. (1998) meneliti sensitivitas kejutan dingin spermatozoa dari beberapa spesies satwa liar dan juga menemukan bahwa spermatozoa dari babi, impala dan gajah yang diperoleh dengan teknik elektroejakulator lebih sensitif terhadap proses cooling dibandingkan spermatozoa dari kauda epididimis. Viabilitas Spermatozoa Domba selama Proses Kriopreservasi Persentase viabilitas spermatozoa dapat dilakukan melalui pemeriksaan fungsi membran dengan menggunakan pewarna eosin-negrosin. Spermatozoa hidup masih mempunyai sistem membran yang berfungsi termasuk fungsi pengaturan ion sehingga menyebabkan penahanan difusi medium pewarna eosinnegrosin yang mengandung ion oleh sistem membran pada saat pemaparan spermatozoa ke dalam medium pewarna eosin-negrosin sehingga spermatozoa tidak akan terwarnai. Sebaliknya pada spermatozoa mati, sistem membrannya telah rusak sehingga dengan mudah dapat dilewati oleh pewarna eosin-negrosin dan spermatozoa akan berwarna merah (Gambar 6).

11 37 Gambar 6. Gambaran viabilitas spermatozoa domba. Spermatozoa yang ditandai dengan kepala berwarna putih menunjukkan spermatozoa hidup (a) dan kepala berwarna merah menunjukkan spermatozoa mati (b). Gambar 7. Persentase viabilitas spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat selama proses kriopreservasi. Dalam setiap tahapan kriopreservasi, bar dengan huruf yang berbeda (a,b; x,y) menunjukkan perbedaan yang nyata untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat (P<0,05).

12 38 Persentase viabilitas spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat selama proses kriopreservasi ditampilkan pada Gambar 7. Hasil yang diperoleh pada penelitian ini menunjukkan bahwa tidak adanya perbedaan yang nyata (P>0,05) pada viabilitas spermatozoa baik yang berasal dari kauda epididimis maupun ejakulat selama proses kriopreservasi. Hasil yang diperoleh pada penelitian sama dengan yang dilaporkan Yulnawati et al. (2008) yang membandingkan kualitas spermatozoa dari kauda epididimis maupun ejakulat pada kerbau belang dengan penggunaan bahan pengencer Andromed untuk kriopreservasi, dimana persentase viabilitas spermatozoa setelah thawing dari kauda epididimis tidak menunjukkan perbedaan dengan spermatozoa dari ejakulat. Persamaan persentase viabilitas spermatozoa dari kauda epididimis dengan ejakulat dikarenakan pada sekresi cairan kauda epididimis dan plasma semen terdapat nucleobindin dan protein lipocalin-type prostaglandin D synthase (PGDS) yang menempel pada akrosom spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat dan berperan sebagai protein multifungsi dalam mengikat kalsium, berpartisipasi dalam aktivasi sinyal intraselular, interaksi sel-sel, apoptosis, serta dapat mempengaruhi viabilitas spermatozoa tidak hanya ketika berada di kauda epididimis tetapi juga setelah diejakulasikan (Moura et al. 2007). Hasil penelitian ini berbeda dengan yang dilaporkan Martinez-Pastor et al. (2006) dimana untuk kriopreservasi spermatozoa rusa merah Iberian menggunakan bahan dasar pengencer Tes-Tris buffering system dengan 15% kuning telur diperoleh persentase viabilitas spermatozoa setelah thawing dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan ejakulat. Begitu pula dengan yang dilaporkan Alvarez et al. (2009) dengan penggunaan bahan pengencer Biladyl (Minitube, Tiefenbach, Germany) dengan 20% kuning telur untuk kriopreservasi spermatozoa domba Black Manchega, dimana diperoleh persentase viabilitas spermatozoa setelah thawing dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan ejakulat. Abnormalitas Spermatozoa Domba selama Proses Kriopreservasi Abnormalitas spermatozoa telah diidentifikasi sebagai karakteristik yang dapat digunakan untuk memprediksi kemampuan fertilisasi dari spermatozoa,

13 39 sehingga abnormalitas spermatozoa selama proses kriopreservasi merupakan penilaian penting dalam penelitian ini. Menurut McPeake & Pennington (2009), abnormalitas spermatozoa dikelompokkan ke dalam dua kategori, yaitu primer (abnormalitas kepala dan bentuk midpiece) yang terjadi pada saat proses spermatogenesis dan sekunder (kepala normal yang terputus, droplet dan ekor yang membengkok) yang terjadi selama proses penyimpanan atau kriopreservasi spermatozoa. Pada penelitian ini, evaluasi abnormalitas spermatozoa lebih ditekankan pada abnormalitas sekunder yaitu kepala normal yang terputus dan ekor yang membengkok seperti ditampilkan pada Gambar 8. Gambar 8. Gambaran abnormalitas spermatozoa domba. Spermatozoa utuh (a), spermatozoa dengan ekor melingkar atau membengkok (b), spermatozoa dengan kepala normal yang terputus (c). Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi peningkatan dalam persentase abnormalitas spermatozoa baik kauda epididimis maupun ejakulat selama proses kriopreservasi. Hasil penelitian juga menunjukkan tidak adanya perbedaan yang nyata (P>0,05) antara persentase abnormalitas spermatozoa dari kauda epididimis dengan ejakulat selama proses kriopreservasi (Gambar 9). Hasil serupa juga dilaporkan Monteiro et al. (2011) bahwa persentase abnormalitas spermatozoa kuda setelah thawing dari kauda epididimis dan ejakulat masing-masing sebesar 11,4% dan 15,2%. Berbeda halnya dengan yang dilaporkan Martins et al. (2007)

14 40 bahwa persentase abnormalitas spermatozoa sapi setelah thawing dari kauda epididimis lebih tinggi dibandingkan ejakulat. Sedangkan Axner et al. (1998) melaporkan bahwa persentase abnormalitas spermatozoa kucing setelah thawing dari kauda epididimis lebih rendah dibandingkan ejakulat. Gambar 9. Persentase abnormalitas spermatozoa domba dari kauda epididimis dan ejakulat selama proses kriopreservasi. Dalam setiap tahapan kriopreservasi, bar dengan huruf yang berbeda (a,b; x,y) menunjukkan perbedaan yang nyata untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat (P<0,05). Kriopreservasi dapat menyebabkan perubahan pada morfologi spermatozoa, termasuk kerusakan pada mitokondria, akrosom dan ekor spermatozoa. Oleh karena itu, fungsi spermatozoa dalam mempertahankan membran utuh, ekor dan aktivitas mitokondria setelah pembekuan menjadi rendah (Holt 2000). Disamping itu, proses cooling selama kriopreservasi dapat menekan aktivitas metabolisme sel spermatozoa dan menyebabkan konsumsi energi secara signifikan berkurang dan sensitivitas kejutan dingin ditandai oleh hilangnya permeabilitas selektif secara ireversibel dan integritas membran plasma spermatozoa yang mengarah kepada abnormalitas spermatozoa (Robertson et al. 1990). Perubahan morfologi yang mengarah kepada abnormalitas ini terkait

15 41 dengan permeabilitas membran terhadap ion intraseluler, fungsi saluran ion dan integritas cytoskeletal (Petrunkina et al. 2005). Senger (2005) melaporkan bahwa setiap fraksi spermatozoa baik yang berasal dari kauda epididimis maupun ejakulat mengandung spermatozoa yang abnormal sebesar 5-15% dan penurunan kemampuan fertilisasi terjadi apabila morfologi spermatozoa yang abnormal melebihi 20%. Persentase abnormalitas spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat yang diperoleh pada penelitian ini masih dalam batas normal. Tahap II. Kemampuan Fertilisasi In Vitro Spermatozoa Domba Setelah Pembekuan Evaluasi secara in vitro untuk penilaian kemampuan fertilisasi pertama kali dijelaskan oleh Cramer et al. (1994). Perkembangan inti oosit setelah fertilisasi in vitro dilakukan dengan mengamati pembentukan pronukleus (PN) dimana yang terfertilisasi ditandai dengan pembentukan dua pronukleus (2PN) atau lebih dari 2 pronukleus (>2PN) (Gambar 10). A B Gambar 10. Pembentukan pronukleus (PN) dari oosit setelah fertilisasi in vitro. A. dua pronukleus (2PN), B. lebih dari 2 pronukleus (>2PN). Tanda menunjukkan pronukleus. Kemampuan penetrasi spermatozoa domba setelah pembekuan baik yang berasal dari kauda epididimis maupun ejakulat setelah fertilisasi in vitro yang diamati dengan menghitung jumlah oosit yang dapat membentuk dua atau lebih pronukleus ditampilkan pada Tabel 2.

16 42 Tabel 2. Kemampuan fertilisasi in vitro spermatozoa domba setelah pembekuan yang berasal dari kauda epididimis dengan ejakulat Spermatozoa Jumlah Ulangan Pembentukan PN (%) Tingkat Kauda epididimis Oosit (n) Ejakulat Tidak terbentuk PN 32 (28,07) 29 (23,57) 1PN 2PN >2PN 12 (10,53) 12 (9,76) 49 (42,98) 60 (48,78) PN: Pronukleus, 1PN: tidak terfertilisasi, 2PN: Normal, >2PN: Polispermia, Tingkat fertilisasi: jumlah oosit yang dapat membentuk 2PN atau >2PN. 21 (18,42) 22 (17,89) Fertilisasi 70 (61,40) 82 (66,67) Hasil penelitian menunjukkan bahwa kemampuan fertilisasi in vitro spermatozoa domba setelah pembekuan yang berasal dari kauda epididimis tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan spermatozoa dari ejakulat baik pada persentase fertilisasi total, normal maupun polispermia. Hasil ini menunjukkan bahwa kemampuan fertilisasi spermatozoa dari kauda epididimis sama dengan ejakulat, seperti yang dilaporkan Kaabi et al. (2003) yang mengamati tingkat perkembangan embrio sebagai indikator penilaian kemampuan FIV dari spermatozoa domba, dimana diperoleh persentase pembelahan sel sebesar 53% dan 50% masing-masing untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat. Begitu pula yang dilaporkan Blash et al. (2000) pada kambing, dimana fertilisasi in vitro menggunakan spermatozoa dari kauda epididimis diperoleh sebanyak 40% yang menunjukkan pembelahan sel, sedangkan dengan spermatozoa dari ejakulat mencapai 37%. Kemampuan fertilisasi oosit secara in vitro yang sama antara spermatozoa domba setelah thawing dari kauda epididimis maupun ejakulat dikarenakan spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat memiliki kesamaan dalam kemampuan mengikat protein pada zona pelusida dan menjaga kondisi kromatin dari spermatozoa tetap stabil yang didukung oleh defosforilasi protamine selama spermatozoa berada di epididimis (Harkema et al. 2004; Garcia et al. 2006; Alvarez et al. 2009).

17 43 Walaupun plasma semen dari spermatozoa ejakulat diikutsertakan selama proses kriopreservasi, namun pada saat proses FIV keberadaan plasma semen dihilangkan melalui sentrifugasi sehingga kondisinya sama dengan spermatozoa dari kauda epididimis. Spermatozoa yang disentrifugasi terlebih dahulu sebelum diinkubasi dalam medium FIV bertujuan untuk memisahkan suspensi dan pellet spermatozoa dimana spermatozoa dengan kualitas baik berada pada endapan atau pellet yang dihasilkan (Ollero et al. 2001). Selain itu, spermatozoa yang dikumpulkan dari pellet hasil sentrifugasi menunjukkan kerusakan DNA yang rendah (Larson et al. 1999), menghasilkan reactive oxygen species (ROS) yang lebih sedikit dan menghilangkan senyawa antioksidan yang terdapat pada plasma semen (Ollero et al. 2001). Harkema et al. (1998) melaporkan bahwa keberadaan plasma semen pada spermatozoa dari ejakulat yang dihilangkan sebelum diinkubasi dalam medium FIV dapat meningkatkan persentase spermatozoa dalam mengikat protein zona pelusida pada membran plasma, sama seperti halnya pada spermatozoa dari kauda epididimis. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa tingkat fertilisasi oosit dengan kejadian polispermia sebesar 18,42% dan 17,89% masing-masing untuk spermatozoa dari kauda epididimis dan ejakulat (Tabel 2). Kejadian polispermia dengan frekuensi tinggi pada prosedur FIV dapat mengurangi efisiensi produksi embrio secara in vitro (Nagai et al. 2006). Polispermia merupakan fertilisasi yang melibatkan lebih dari satu spermatozoa dan menjadi salah satu faktor utama yang mempengaruhi efisiensi FIV secara keseluruhan (Wang et al. 1998). Penetrasi spermatozoa secara bersamaan dan penundaan reaksi zona pada saat penetrasi spermatozoa dapat menyebabkan penetrasi polispermia pada kondisi in vitro (Funahashi 2003). Selain itu, medium FIV yang mengandung kafein sebagai komponen nukleotida siklik fosfodiesterase inhibitor dapat meningkatkan konsentrasi camp intraseluler, menginduksi kapasitasi sperma dan reaksi akrosom secara spontan, sehingga meningkatkan penetrasi polispermia (Funahashi & Nagai 2001). Dalam metodologi FIV, gamet jantan dan betina berada dalam media cokultur dimana tidak ada hambatan yang mengatur interaksi antara spermatozoa dengan oosit. Biasanya dalam sistem FIV, konsentrasi spermatozoa yang berada

18 44 dalam medium fertilisasi sering menghasilkan jumlah spermatozoa yang tinggi dalam menembus oosit secara bersamaan, meskipun oosit mempunyai mekanisme untuk memblokir penetrasi lebih lanjut dari spermatozoa setelah fertilisasi (Suzuki et al. 2003). Berkurangnya kemampuan oosit yang matang secara in vitro untuk memblokir polispermia akibat tertundanya reaksi pada zona pelusida yang disebabkan oleh paparan pada medium FIV dengan komposisi tidak seperti pada fertilisasi in vivo (Funahashi 2003). Selain itu, polispermia terjadi karena penuaan oosit, abnormalitas zona pada oosit dan kondisi kultur selama FIV, disamping perkembangan yang abnormal dari oosit seperti pembelahan yang tidak teratur dan kelainan degenerasi kromosom (Sathananthan et al. 1999; Wang et al. 2003). Selama FIV, terjadi peningkatan [Ca 2+ ] cyt pada zona pellucida (ZP) yang merupakan komponen penting dari membran blok untuk mencegah penetrasi polispermia, namun keberadaan membran blok kurang efektif dalam mencegah fusi spermatozoa disamping pembentukannya yang lambat sehingga memberikan waktu bagi penetrasi polispermia (Abbott & Ducibella 2001; Gardner et al. 2007). Dari oosit yang difertilisasi secara in vitro baik menggunakan spermatozoa dari kauda epididimis maupun ejakulat, ada oosit yang hanya mengalami pembentukan satu pronukleus (1PN). Hal ini menunjukkan bahwa oosit teraktivasi namun mengalami kegagalan fertilisasi yang dapat disebabkan oleh beberapa hal, antara lain: 1) proses pematangan inti maupun sitoplasma yang kurang sempurna, 2) kegagalan spermatozoa melakukan kapasitasi dan reaksi akrosom sehingga tidak mampu membuahi oosit, 3) kegagalan spermatozoa mengalami kondensasi dalam sitoplasma oosit sehingga terjadi kegagalan pembentukan pronukleus jantan, dan 4) aktivasi parthenogenesis dari oosit (Crozet et al. 1995; Chian et al. 1995). Kegagalan spermatozoa mengalami kondensasi dalam sitoplasma oosit disebabkan oleh: 1) abnormalitas spermatozoa sehingga migrasi inti spermatozoa tidak lengkap, kesalahan lokasi dari centrosomal dan tersebarnya distribusi kromatin, 2) kegagalan aktivasi oosit sehingga inti dari spermatozoa mengalami kondensasi kromosom yang prematur (Tesarik & Sousa 1995).