ABSTRAK ZALZILATUL HIKMIA SUPRAMANA GEDE SUASTIKA

Transkripsi

1 IDENTIFIKASII SPESIES Meloidogyne spp. PENYEBAB UMBI BERCABANG PADA TANAMANN WORTEL (Daucus carotaa L.) DI JAWA TIMUR ZALZILATULL HIKMIA DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMANN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUTT PERTANIAN BOGOR 20122

2 ABSTRAK ZALZILATUL HIKMIA. Identifikasi Spesies Meloidogyne spp. Penyebab Umbi Bercabang pada Tanaman Wortel (Daucus carota L.) di Jawa Timur. Dibimbing oleh SUPRAMANA dan GEDE SUASTIKA. Umbi bercabang merupakan penyakit baru dalam budidaya tanaman wortel di Indonesia dan telah menimbulkan kerugian yang besar bagi petani. Pada tahun 2010, beberapa spesies nematoda puru akar (NPA), Meloidogyne spp., dilaporkan sebagai penyebab utama penyakit umbi bercabang pada wortel di wilayah Agropolitan - Cianjur, Jawa Barat. Kerugian yang ditimbulkan berkisar antara 15% - 95%. Gejala umbi bercabang juga telah dilaporkan pada salah satu sentra produksi sayuran di Jawa Timur, yaitu di wilayah Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu. Penelitian bertujuan mengidentifikasi spesies Meloidogyne spp. pada umbi wortel bercabang dan mengetahui prevalensi sebaran Meloidogyne spp. berdasarkan ketinggian tempat. Penelitian dilaksanakan pada pertanaman wortel di wilayah Kota Batu serta Laboratorium Nematologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Institut Pertanian Bogor dari bulan Mei hingga November Penelitian terdiri dari dua kegiatan yaitu survei dan identifikasi. Survei dilakukan di Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu pada tiga ketinggian/elevasi, yaitu 1600 m, 1700 m, dan 1800 m di atas permukaan laut (dpl). Identifikasi dilakukan dengan pengamatan ciri morfologi pola perineal (sidik pantat) nematoda betina dan identifikasi PCR ITS r-dna. Identifikasi sidik pantat nematoda dilakukan terhadap 150 ekor betina dewasa, 50 ekor mewakili setiap ketinggian. Identifikasi PCR ITS r-dna menggunakan primer multipleks untuk mengidentifikasi campuran spesies M. hapla, M. fallax, dan M. chitwoodi, serta 3 primer spesifik untuk mengidentifikasi spesies M. arenaria, M. incognita, dan M. javanica. Berdasarkan identifikasi pola sidik pantat diketahui empat spesies Meloidogyne spp., antara lain M. arenaria, M. hapla, M. incognita, dan M. javanica. Data tersebut diperkuat dengan hasil identifikasi PCR ITS r-dna. Data hasil PCR menunjukkan hasil yang positif terhadap keberadaan keempat spesies tersebut. Kata kunci: Daucus carota, penyakit umbi bercabang spesies Meloidogyne,

3 IDENTIFIKASII SPESIES Meloidogyne spp. PENYEBAB UMBI BERCABANG PADA TANAMANN WORTEL (Daucus carotaa L.) DI JAWA TIMUR ZALZILATULL HIKMIA A Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian,, Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMANN FAKULTAS PERTANIAN INSTITUTT PERTANIAN BOGOR 20122

4 Judul : Identifikasi Spesies Meloidogyne spp. Penyebab Umbi Bercabang pada Tanaman Wortel (Daucus carota L.) di Jawa Timur Nama Mahasiswa : Zalzilatul Hikmia NIM : A Menyetujui, Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II Dr. Ir. Supramana, M.Si. NIP Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. NIP Mengetahui, Ketua Departemen Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si. NIP Tanggal lulus:

5 RIWAYAT HIDUP Penulis bernama Zalzilatul Hikmia, dilahirkan di Sidoarjo, Jawa Timur 11 Desember Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Bapak Mokh. Sam un Hadi, Spd. dan Ibu Ir. Mu alifah. Penulis menyelesaikan pendidikan tingkat SMA pada tahun 2007 di SMA Negeri 1 Mojosari - Mojokerto dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Saringan Masuk IPB (USMI) dengan program studi Proteksi Tanaman. Selama kuliah, penulis mengikuti organisasi kemahasiswaan yaitu Unit Kegiatan Mahasiswa Futsal (UKM) IPB sebagai pengurus dan pemain di tim futsal putri UKM Futsal IPB (2008/2011), Anggota Himpunan Mahasiswa Proteksi Tanaman (HIMASITA) IPB (2008/2011), Pengurus UKM Organisasi mahasiswa daerah Himpunan Mahasiswa Surabaya dan Sekitarnya (HIMASURYA) IPB ( ), Anggota divisi Publikasi dekorasi dokumentasi kegiatan Olimpiade Mahasiswa IPB (2009), Penyaji dalam International Seminar and The 21 st National Congress of The Indonesian Phytopathological Society di Solo (2011). Penulis juga pernah magang di Balai Penelitian Kacang dan Umbi-umbian (BALITKABI) Malang pada tahun 2009.

6 PRAKATA Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta alah atas segala rahmat dan karunia yang dicurahkan tiada henti, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul Identifikasi Spesies Meloidogyne spp. Penyebab Umbi Bercabang pada Tanaman Wortel (Daucus carota L.) di Jawa Timur sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana di Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor. Dengan penuh rasa hormat penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Dr. Ir. Supramana, M.Si. dan Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan arahan kepada penulis selama mengerjakan penelitian hingga penulisan skripsi. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Ir. Nina Maryana, M.Si. atas kesediaannya menjadi dosen penguji tamu, baik dalam menghadiri seminar hasil penelitian maupun pelaksanaan ujian akhir skripsi. Rasa terima kasih dari lubuk hati terdalam disampaikan kepada Bapak Mokh. Sam un Hadi, Spd. dan Ibu Ir. Mu alifah, adikku Firda, dan Bojes yang telah memberikan doa, kasih sayang, dukungan moral maupun materil selama studi berlangsung. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak Gatut di Laboratorium Nematologi, Ibu Tuti dan Bapak Wawan di Laboratorium Virologi Departemen Proteksi Tanaman IPB yang telah membantu pelaksanaan penelitian, juga kepada Nisa, Ika, Ndun, Alifah atas dukungan kalian selama ini. Semua teman-taman angkatan 44 Proteksi Tanaman, Taher, Nope, Eter, Dika, Harwan, Br, Momon; teman-teman di Laboratorium Nematologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, serta temanteman UKM Futsal IPB, penulis mengucapkan terima kasih atas kebersamaannya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis khususnya dan pembaca pada umumnya. Bogor, Juni 2012 Zalzilatul Hikmia

7 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... viii DAFTAR GAMBAR... ix PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 2 Manfaat Penelitian... 2 TINJAUAN PUSTAKA... 3 Tanaman Wortel (Daucus carota L.)... 3 Sistematika dan Biologi... 3 Manfaat Wortel... 3 Persyaratan Tumbuh... 4 Hama Penyakit pada Wortel... 5 Nematoda Puru Akar (Meloidogyne spp.)... 5 Sistematika... 5 Morfologi... 5 Siklus Hidup... 6 Mekanisme Infeksi NPA... 7 Gejala Penyakit... 8 Kisaran Inang... 9 Identifikasi NPA... 9 Identifikasi NPA dengan Sidik Pantat Nematoda (Sidik Perineal) Identifikasi NPA Berdasarkan PCR Gen ITS r-dna BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Metode Penelitian Survei Identifikasi Nematoda Deskripsi Lokasi Gejala Penyakit di Lahan Identifikasi Nematoda Pengamatan Keberadaan NPA di dalam Jaringan Identifikasi NPA dengan Pola Sidik Pantat Nematoda (Sidik Perineal) 22 Identifikasi Uji Biologi Molekuler KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran... 27

8 DAFTAR PUSTAKA vii

9 DAFTAR TABEL Halaman 1 Tipe gejala pada umbi wortel yang terinfeksi NPA di Desa Sumber Brantas pada ketinggian 1800 m, 1700 m, dan 1600 m dpl Tipe puru pada umbi di Desa Sumber Brantas pada ketinggian 1800 m, 1700 m, dan 1600 m dpl Prevalensi spesies Meloidogyne pada wortel di Desa Sumber Brantas, pada ketinggian 1800 m, 1700 m, dan 1600 m dpl Spesies NPA pada tanaman wortel di Desa Sumber Brantas berdasarkan hasil uji biologi molekuler... 26

10 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Siklus hidup NPA Perbedaan pola sidik pantat M. arenaria, M. hapla, M. incognita, dan M. javanica Gejala pertanaman wortel terinfeksi NPA pada ketinggian 1800 m, 1700 m, dan 1600 m dpl Gejala umbi tanaman wortel terinfeksi NPA. Gejala umbi berambut, gejala umbi bercabang, dan gejala umbi bercabang dan berambut Lokasi terbentuknya puru pada akar rambut (hairy root), pada akar, dan pada umbi wortel Tipe puru pada perakaran wortel: puru bulat pada akar rambut (hairy root), puru seperti kudis, puru seperti akar gada, puru meman jang, dan puru bulat berukuran besar (>0.5 cm) Nematoda betina dewasa dalam jaringan Hasil identifikasi pola sidik pantat NPA. M. arenaria, M. hapla, M. incognita, dan M. javanica Hasil amplifikasi DNA pada 1% agarose gel elektroforesis M. arenaria 420 bp, M. hapla 440 bp, M. incognita 1000 bp, dan M. javanica 720 bp... 25

11 PENDAHULUAN Latar Belakang Wortel (Daucus carota L.) merupakan salah satu tanaman hortikultura yang mengandung banyak vitamin A. Vitamin A merupakan jenis vitamin yang tidak dapat diproduksi sendiri oleh tubuh manusia sehingga hanya dapat diperoleh dengan mengonsumsi makanan yang mengandung vitamin A. Menurut Pitojo (2006) setiap 100 g umbi wortel mengandung S.I vitamin A. Pada tahun 2004 pemerintah mencanangkan peningkatan produksi tanaman hortikultura dalam program pembangunan pertanian tahun (Deptan 2004). Menurut Badan Pusat Statistik (2009), produksi wortel di Indonesia pada tahun 2008 mengalami kenaikan sebesar ton. Sejalan dengan berkembangnya tingkat konsumsi, produktifitas wortel sering dicekam oleh infeksi patogen yang dapat mengurangi hasil panen, sehingga mengakibatkan ketidakstabilan produksi. Puskara (1994, 2000 dalam Mustika 2010) menyebutkan bahwa nematoda merupakan salah satu jenis organisme pengganggu tanaman (OPT) penting yang menginfeksi berbagai jenis tanaman pertanian, baik pangan, hortikultura maupun perkebunan di Indonesia dan negara-negara tropis lainnya. Gejala dan infeksi nematoda pada wortel yang berupa malformasi umbi, mulai dilaporkan keberadaannya di Indonesia pada tahun 2010 di daerah Cipanas, Kabupaten Cianjur (Kurniawan 2010). Gejala malformasi umbi dapat berupa umbi bercabang (forking) dan adanya puru (galling) (Tanaka et al. 1997). Kurniawan (2010) menyebutkan bahwa beberapa spesies nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) merupakan penyebab dari penyakit umbi bercabang pada wortel. Kehilangan hasil akibat infeksi dilaporkan sebesar 15% - 95%. Penyakit ini menjadi salah satu masalah terbesar dalam budidaya wortel. Gejala serupa telah dilaporkan pula di sentra produksi sayuran di Jawa Timur, yaitu di Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu. Walaupun telah menjadi OPT utama namun belum dilakukan identifikasi spesies dari nematoda puru akar (NPA) tersebut. Oleh karena itu, dilakukan identifikasi spesies nematoda untuk dasar pengendalian yang efektif dan efisien di lapangan.

12 2 Tujuan Penelitian Melakukan identifikasi spesies nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) pada umbi wortel bercabang di wilayah Jawa Timur dan mengetahui prevalensi sebaran Meloidogyne spp. berdasarkan ketinggian tempat. Manfaat Penelitian Memberikan informasi keberadaan spesies nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) yang dapat dijadikan dasar untuk menyusun strategi pengendalian penyakit umbi bercabang wortel di lapangan yang efektif, efesien, dan ramah lingkungan.

13 TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Wortel (Daucus carota L.) Sistematika dan Biologi Wortel dalam taksonomi tumbuhan termasuk dalam divisi Spermatophyta, kelas Angiospermae, ordo Umbelliferales, famili Umbelliferae (Pitojo 2006). Bagian tubuh wortel terdiri atas daun, batang, dan akar. Daun wortel adalah daun majemuk ganda dengan anak daun terletak beraturan dan berbentuk lanset. Daun tidak berbulu dengan bagian tepi bercangap. Kedudukan daun pada batang berselang-seling. Daun ditopang oleh pelepah daun yang berukuran besar dan berbentuk pipih (perikladium), yang tidak membalut batang. Pelepah berlekuk memanjang dan dapat berukuran hingga 30 cm di bagian bawah (Pitojo 2006). Batang wortel beruas-ruas hingga delapan ruas. Cabang tanaman wortel muncul dari ruas batang kedua yang berada dekat dengan permukaan tanah. Umumnya ruas pada batang utama bagian bawah berjarak lebih pendek jika dibandingkan dengan ruas batang bagian atas yang relatif lebih panjang. Cabang tanaman berwarna hijau, keras namun tidak berkayu, dan di dalamnya terdapat jaringan gabus (Pitojo 2006). Akar tunggang muncul dari biji yang tumbuh tegak lurus ke dalam tanah. Dalam perkembangannya, akar berubah bentuk serta fungsi menjadi umbi sebagai tempat menyimpan cadangan makanan. Umbi berbentuk bulat dan memanjang dengan memiliki beberapa warna seperti kuning kemerahan, jingga, putih, dan ungu (Pitojo 2006). Manfaat Wortel Wortel berasal dari Asia Selatan dengan penyebaran luas pada daerah tropis dan subtropis (Pitojo 2006). Budidaya wortel di Indonesia awalnya hanya terkonsentrasi di daerah Lembang dan Cipanas, Jawa Barat, selanjutnya wortel berkembang dan menyebar ke berbagai daerah penghasil sayuran di Jawa dan luar Jawa (Rukmana 1995). Wortel sering dimanfaatkan sebagai bahan pangan sayur, pewarna makanan dan minuman, serta bahan ramuan obat tradisional. Umbi wortel mengandung

14 4 tiga elemen penting, yaitu betakaroten, vitamin A, dan fitokemikalia. Betakaroten dapat digunakan sebagai pewarna makanan, selain itu dapat mengurangi kerusakan kulit akibat sinar matahari. Kandungan vitamin A selain berguna untuk kesehatan mata juga dapat memperkuat membran sel sehinga lebih kuat melawan penyakit yang diakibatkan mikroorganisme. Sedangkan fitokemikalia dapat mengurangi resiko stroke, menghindari proses penuaan dini, menjaga keseimbangan metabolisme hormonal, dan berperan sebagai anti virus serta anti bakteri (Pitojo 2006). Wortel juga mengandung mineral Ca, P, K, dan serat yang baik bagi tubuh (Novary 1997). Persyaratan Tumbuh Wortel merupakan sayuran dataran tinggi pada kisaran 1200 m dpl dengan iklim subtropis. Tanaman wortel dapat tumbuh dengan baik pada kondisi lingkungan lembab dengan kisaran suhu 15.6 o C 21.1 o C. Suhu udara yang terlalu tinggi sering kali menyebabkan umbi menjadi kecil, terhambatnya perkecambahan, penurunan kandungan β-karoten dan berwarna pucat (kusam) (Pitojo 2006). Pracaya (2002) menambahkan jika suhu udara terlalu rendah (sangat dingin) juga tidak baik bagi wortel karena umbi yang terbentuk menjadi panjang dan kecil. Wortel dapat ditanam sepanjang tahun di Indonesia (Pracaya 2002). Tanaman wortel tumbuh dengan baik pada tanah gembur, remah, poros, serta memiliki aerasi udara yang bagus seperti tanah andosol (Pitojo 2006). Tanah andosol banyak dijumpai di daerah dengan curah hujan 2000 mm setahun tanpa bulan kering yang pasti. Andosol terbentuk dari bahan induk tufa atau abu volkan yang berada di sekitar puncak gunung berapi atau dataran tinggi. Solum tanah andosol agak tebal, berwarna hitam agak kuning, konsistensi gembur, kadang-kadang membentuk pasir palsu dan fragipan, dan tekstur kaya debu. Reaksi tanah berkisar dari agak masam sampai netral, kaya bahan organik pada permukaan, kerapatan isi <0.85 g/cm 3, kejenuhan basa sedang dengan KTK liat >24 me/100 g, fiksasi P tinggi, miskin N, P, dan K, mineral liat dominan alofan, permeabilitas sedang, dan peka erosi air dan angin (Supardi 1983). Keasaman tanah andosol sangat cocok dengan sifat wortel yang tumbuh dengan baik pada ph (Pitojo 2006).

15 5 Hama Penyakit pada Wortel Rukmana (1995) menjelaskan bahwa dalam penanaman wortel sering terjadi banyak gangguan terutama gangguan biotik yaitu gangguan organisme pengganggu tanaman (OPT). Beberapa spesies hama yang umum dijumpai dan menyerang tanaman wortel antara lain: Hyposidra sp. (Lepidoptera: Geometridae), Heliothis assula (Lepidoptera: Noctuidae), Agrotis ipsilon (Lepidoptera: Noctuidae), Nezara viridula (Hemiptera: Pentatomidae), dan Coccinella spp. (Coleoptera: Coccinellidae). Penyakit yang sering dijumpai pada pertanaman wortel antara lain busuk pangkal batang (Sclerotinia slerotiorum), bercak daun Cercosprora (Cercospora carotae), hawar daun (Alternaria dauci), dan nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) (Pitojo 2006). Nematoda Puru Akar (Meloidogyne spp.) Sistematika Nematoda berasal dari bahasa Yunani/ Greek nematos yang artinya benang dan eidos yang berarti menyerupai. Secara harfiah nematoda merupakan binatang yang bentuk tubuhnya menyerupai benang (Dropkin 1991). Nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) tergolong ke dalam kingdom Animalia, filum Nematoda, ordo Tylenchida, famili Heteroderidae, genus Meloidogyne (Dropkin 1991). Menurut Kurniawan (2010), terdapat lima spesies NPA yang dipertimbangkan sebagai nematoda parasit penting pada tanaman wortel di Indonesia, yaitu M. arenaria, M. hapla, M. incognita, M. javanica, dan M. chitwoodi. Morfologi Meloidogyne spp. tidak berwarna seperti halnya dengan jenis nematoda parasit tumbuhan lainnya. Meloidogyne jantan dewasa, betina dewasa dan juvenil mudah dibedakan berdasarkan morfologi tubuhnya (Eisenback et al. 2003). Juvenil 2 (J2) berbentuk silindris dengan panjang ± 450 µm. Stilet dan kerangka kepala J2 mengalami sklerotinasi yang tipis dengan ekor berbentuk kerucut hialin dimulai dekat ujung ekor (Luc et al. 2005). Tubuh nematoda betina berbentuk seperti buah pir dengan leher yang pendek dan posterior membulat. Betina dewasa memiliki ukuran panjang 921 µm

16 6 yang diukur dari leher hingga posterior (Eisenback et al. 2003). Stilet berukuran pendek dan mengalami sklerotinasi sedang. Nematoda betina memiliki kerangka kepala lembek dengan lubang ekskresi terletak agak anterior sampai pada lempeng klep median bulbs dan sering terlihat pada dekat basal stilet. Vulva terletak subterminal dekat anus, kutikula berwarna agak keputihan, tipis dan beranulasi jelas (Luc et al. 2005). Nematoda jantan berbentuk seperti cacing (vermiform) dengan panjang 1873 µm (Eisenback et al. 2003). Stilet jantan lebih panjang dibandingkan dengan stilet betina. Kerangka kepala nematoda jantan lebih kuat, dengan ekor pendek setengah melingkar. Jantan memiliki spikula yang kuat dan tidak mempunyai bursa (Luc et al. 2005). Siklus Hidup Siklus hidup nematoda terdiri dari 3 stadia, dimulai dari telur, juvenil, dan dewasa. Stadia juvenil dibagi menjadi 4 tahap, yaitu Juvenil 1 (J1), Juvenil 2 (J2), Juvenil 3 (J3), dan Juvenil 4 (J4) (Dropkin 1991). Setiap stadia dalam siklus hidup nematoda berada di tempat yang berbeda-beda. Siklus hidup nematoda dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1 Siklus hidup NPA (sumber: Mitkowski & Abawi 2003) Telur-telur yang dihasilkan nematoda betina dewasa diletakan berkelompok pada massa gelatinus yang bertujuan untuk melindungi telur dari kekeringan dan

17 7 jasad renik (Roberts & Mullens 2002). Telur yang baru diletakan mengandung zigot set tunggal. Embrio berkembang menjadi Juvenil 1 (J1) dan mengalami pergantian kulit pertama menjadi Juvenil 2 (J2) (Dropkin 1991). J1 mengalami perubahan menjadi Juvenil 2 (J2) saat telur menetas. J2 keluar dari cangkang telur dan masuk ke dalam tanah sebagai stadium infektif. Setelah menemukan tempat infeksi yang cocok, J2 mengalami pertumbuhan dan pergantian kulit tiga kali berturut-turut menjadi Juvenil 3 (J3), Juvenil 4 (J4), dan dewasa di dalam jaringan inang (Dropkin 1991). Nematoda jantan meninggalkan akar setelah dewasa sedangkan nematoda betina hidup menetap pada jaringan tanaman inang (Roberts & Mullens 2002). Sistem reproduksi betina terbentuk setelah fase dewasa, setelah itu pola sidik pantat akan tampak (Eisenback & Trpiantaphyllou 1991). Betina mengalami beberapa pergantian bentuk selama masa perkembangannya, setelah ganti kulit terakhir betina tumbuh dengan cepat dan bentuknya menjadi seperti buah pir (Franklin 1995). Siklus hidup nematoda bergantung pada spesies nematoda dan temperatur musim. Satu sampai tiga generasi dapat terjadi dalam satu musim. Temperatur optimum untuk M. hapla, M. fallax, dan M. chitwoodi antara 15 ºC 25 ºC, sedangkan M. arenaria, M. incognita, dan M. javanica antara 25 ºC 30 ºC. Sangat sedikit aktivitas nematoda pada suhu di atas 38 ºC dan di bawah 5 ºC (Roberts & Mullens 2002). Mekanisme Infeksi NPA Tahap J2 adalah tahap satu-satunya yang dapat melakukan infeksi. J2 bergerak aktif di dalam tanah menuju akar yang sedang tumbuh. J2 menginfeksi tanaman dimulai dengan melakukan penetrasi ke dalam akar tumbuhan melalui epidermis akar yang terletak di sekitar tudung akar. J2 bergerak di antara sel-sel menuju sel dekat silinder pusat atau berada di daerah pertumbuhan akar samping. J2 merusak sel-sel akar dengan menginjeksikan hasil sekresi kelenjar esofagus (elisitor) menggunakan stilet ke dalam jaringan inang. Sekresi nematoda ini menyebabkan perubahan fisiologis dalam sel-sel inang, yang mengubah sel inang menjadi sel raksasa (giant cells) (Mitkowski & Abawi 2003). Giant cells merupakan bentuk respon inang terhadap infeksi nematoda, yang selanjutnya

18 8 digunakan sebagai sumber nutrisi bagi nematoda (Vrain 1999; Williamson & Richard 1996). Nematoda memerlukan bantuan enzim untuk bergerak dan berkembang biak di dalam sel inang. Enzim yang digunakan adalah enzim selulase, enzim endopektin metal transeliminase, dan enzim proteolitik. Enzim-enzim tersebut dapat menguraikan dinding sel tumbuhan yang mengandung protein dan polisakarida (pektin selulose, hemiselulose, pektin sukrosa, dan glikosid) menjadi bahan-bahan lain. Enzim selulase dapat menghidrolisis selulosa, enzim endopektin metal transeliminase dapat menguraikan pektin, dan enzim proteolitik dapat mengurai protein. Nematoda mengeluarkan enzim proteolitik dengan melepaskan asam indol asetat yang merupakan heteroauksin tritopan yang diduga membantu terbentuknya puru. Terurainya bahan-bahan penyusun dinding sel ini menyebabkan dinding sel akan rusak dan terbentuk luka (Lamberti & Taylor 1979). Gejala Penyakit Gejala infeksi NPA pada tajuk tanaman wortel dicirikan dengan tanaman yang mengerdil dan daun menguning (klorosis) yang menyebabkan berkurangnya vigor tanaman. Apabila tanaman terinfeksi pada masa pembibitan, maka produksi umbi akan sangat sedikit (Roberts & Mullens 2002). Infeksi nematoda juga menyebabkan kerusakan pada akar tanaman karena nematoda mengisap sel-sel pada akar, jaringan pembuluh terganggu sehingga translokasi air dan hara terhambat. Kerusakan akar tanaman juga akan menyebabkan pasokan air ke daun menjadi berkurang sehingga stomata menutup dan laju fotosintesis menurun (Wallace 1987 dalam Mustika 2010). Akibatnya, pertumbuhan tanaman terhambat dan produktivitas tanaman menurun (Melakeberhan et al dalam Mustika 2010). Puru merupakan gejala khas dari infeksi NPA. Puru muncul sebagai tanda awal terjadinya asosiasi antara tanaman wortel dan betina NPA. Puru terjadi akibat pembesaran dan pembelahan sel yang berlebihan pada perisikel, serta perubahan bentuk jaringan pengangkut. Tanaman yang mengalami infeksi berat oleh NPA sistem perakarannya mengalami pengurangan jumlah akar. Pembentukan akar baru hampir tidak terjadi, sehingga fungsi perakaran dalam

19 9 menyerap dan menyalurkan air dan unsur hara ke seluruh bagian tanaman terhambat (Kurniawan 2010). Bentuk puru akibat infeksi NPA berbeda-beda tergantung dari spesies nematoda, misalnya M. hapla menyebabkan timbulnya puru seperti manik-manik dan cenderung lebih kecil dibandingkan dengan puru yang diakibatkan oleh spesies NPA lain, yang cenderung lebih besar dan menyatu (Roberts & Mullens 2002). Puru bergabung dan berjajar di sepanjang perakaran. Akar yang terinfeksi biasanya pendek dan mempunyai sedikit akar lateral dan akar rambut (hairy root) (Agrios 2005). Malformasi merupakan salah satu gejala infeksi NPA selain adanya puru. Infeksi NPA menyebabkan umbi tanaman wortel menjadi bercabang (forking) (Nunez et al. 2008), membulat dengan ukuran lebih pendek, dan membentuk akar rambut yang cukup banyak (hairiness) (Vrain 1982). Infeksi NPA mengakibatkan tanaman semakin rentan terhadap infeksi OPT lain. Infeksi cendawan patogen meningkat apabila kandungan eksudat puru akar diubah dan jumlahnya lebih banyak, sehingga cendawan pada stadium istirahat yang terjangkau oleh akar menjadi aktif (Agrios 2005). Kisaran Inang NPA punya kisaran inang yang luas. Lebih dari 700 spesies tanaman menjadi inang Meloidogyne spp., diantaranya adalah kara, kacang, kubis, wortel, waluh, tomat, labu, kentang, tanaman hias, dan rerumputan (Pitojo 2006). M. arenaria, M. hapla, M. incognita, M. javanica, M. fallax, dan M. chitwoodi telah dilaporkan menjadi parasit wortel di Amerika (Roberts dan Mullens 2002). M. hapla dan M. chitwoodi dilaporkan menginfeksi kentang, bit, kacang polong dan wortel di Eropa, selain itu M. chitwoodi juga menginfeksi tanaman jagung, gandum, barley, dan oat (Zijlstra et al.1995). Identifikasi NPA Identifikasi nematoda diperlukan untuk mengetahui spesies penyebab penyakit tanaman. Identifikasi dapat dilakukan dengan cara identifikasi konvensional dan pendekatan biologi molekuler.

20 10 Identifikasi NPA dengan Sidik Pantat Nematoda (Sidik Perineal) Identifikasi konvensional memerlukan pengetahuan tentang struktur tubuh dan ciri-ciri dari nematoda antara lain: bentuk bibir, kerangka kepala, rongga mulut, stilet, tipe esophagus, tipe vulva, ekor, dan anulasi. Hasil penggolongan dibandingkan dengan panduan identifikasi A guide to the four most common species of Root Knot Nematodes (Meloidogyne species) with a pictorial key (Eisenback et al. 1981). Identifikasi dapat dilakukan terhadap juvenile 2, jantan, dan betina dewasa. Identifikasi morfologi sidik pantat (perineal patterns) dilakukan terhadap betina dewasa NPA. Setiap spesies memiliki pola sidik pantat berbeda-beda yang dicirikan oleh tanda yang khas pada area yang mengelilingi vulva dan anus (perineum). M. arenaria dicirikan oleh lengkung dorsal rendah dan ramping di sekitar garis lateral. Bagian lengkung stria bercabang di dekat garis lateral dengan bagian stria atas lebih mendatar (Gambar 2A). M. hapla dicirikan oleh lengkung dorsal yang rendah dengan bagian ujung membentuk sayap ke bagian lateral baik pada satu ujung atau pada kedua ujungnya. Pada zona ujung ekor terdapat tonjolan-tonjolan seperti duri (Gambar 2B). M. incognita dicirikan dengan adanya lengkung dorsal yang tinggi dan menyempit, sedangkan pada bagian paling luarnya sedikit melebar dan agak mendatar, tidak memiliki garis lateral dan bagian stria terlihat jelas (Gambar 2C). M. javanica dicirikan oleh dua garis lateral yang memisahkan stria bagian dorsal dan ventral yang sangat jelas (Gambar 2D) (Eisenback et al. 1981). A B C D Gambar 2 Perbedaan pola sidik pantat M. arenaria (A), M. hapla (B), M. incognita (C), dan M. javanica (D) (sumber: Eisenback et al. 1981)

21 11 Identifikasi NPA Berdasarkan PCR Gen ITS r-dna Identifikasi dengan pendekatan biomolekuler memiliki tingkat kecepatan, akurasi, dan sensitifitas terpercaya dibandingkan dengan identifikasi konvensional. Terdapat dua basis metode dalam identifikasi biomolekuler, yaitu metode berbasis protein dan metode berbasis DNA. Teknik yang digunakan dalam metode berbasis protein yaitu serologi (monoklonal/poliklonal), dan elektroforesis enzim spesifik dalam tubuh nematoda. Teknik yang digunakan pada metode berbasis DNA antara lain: RFLP (Restiction Fragment Length Polymorphism), DNA probes, PCR dan PCR - RFLP (Power 1993, Zijlstra et al. 1995, Orui 1998), dan RAPD (Random amplified polymorphic DNA) (Cenis 1993). Polymerase Chain Reaction (PCR). Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode mengamplifikasi DNA secara in vitro untuk mensintesis asam nukleat dengan menggandakan satu bagian DNA (Blackburn et al. 2006). Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) oligonukleotida primer, yaitu sekuen nukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis antai DNA, (3) deoksiribonukleotida trifosfat (dntp), terdiri dari datp, dctp, dgtp, dan dttp, serta (4) enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer (Yuwono 2006; Muladno 2010). Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan berpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan pada suhu 95 o C selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55 o C sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Proses annealing biasa dilakukan selama 1-2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72 o C selama 3 menit. Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen

22 12 dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95 o C. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya (Yuwono 2006). Darmono (2001 dalam Rahmawati 2010) menyatakan bahwa DNA digunakan sebagai objek eksploitasi karena spesifitasnya tinggi dan tidak dipengaruhi oleh perubahan lingkungan. Amplifikasi bagian tertentu dari genom nematoda merupakan cara efektif untuk karakterisasi dan identifikasi nematoda. Power dan Haris (1993) melakukan pemisahan spesies nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) dengan mengamplifikasi gen DNA ribosomal. DNA ribosomal (rdna) mengkode RNA ribosomal. Ribosom adalah makromolekul intraseluler yang menghasilkan protein atau rantai polipeptida. Ribosom sendiri terdiri dari gabungan protein dan RNA (Richard et al. 2008). DNA ribosomal merupakan bagian genom paling informatif dan bagian paling sering digunakan pada studi filogenik. Setiap unit rdna dalam satu rangkaian kromosom mengkode gen dengan urutan 5-18S, 5.8S, 28S -3 subunit rrna. Diantara daerah 18S dan 5.8S terdapat beberapa ratus pasang basa DNA yang disebut internal transcribed spacer 1 (ITS 1), dan diantara 5.8S dan 28S adalah ITS2 (Powers et al. 1997), daerah ini secara khusus digunakan untuk menentukan sistematika molekuler dan tingkat variasinya tinggi (Jusuf 2001). Menurut Odorico dan Miller (1997 dalam Rahmawati 2010) analisis filogenik dengan penanda ITS dapat digunakan untuk mengevaluasi hubungan antar spesies. Beberapa populasi nematoda puru akar dapat dibedakan dengan membandingkan urutan parsial ITS yang diperoleh dengan PCR. Teknik amplifikasi dengan menggunakan daerah ITS dapat mempermudah pendeteksian karena sekuens ITS lebih terkonservasi dibandingkan dengan menggunakan yang lain. Satu juvenil sudah cukup digunakan untuk PCR, akan tetapi amplifikasi ITS menjadi lebih pendek (Zijlstra et al. 1995).

23 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di kebun petani wortel Desa Sumber Brantas, Kecamatan Bumiaji, Kota Batu, Jawa Timur, serta di Laboratorium Nematologi Tumbuhan dan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei hingga November Metode Penelitian Survei Survei dilakukan pada beberapa kebun wortel di Desa Sumber Brantas yang terletak pada ketinggian 1600 m, 1700 m, dan 1800 m dpl. Wortel yang digunakan sebagai sampel adalah umbi wortel yang menunjukkan gejala umbi bercabang. Sampel diletakkan dalam cooling box yang telah diberi es batu dan dililit kertas koran untuk menjaga suhu nematoda agar tetap stabil (Trigiano et al. 2004). Pengamatan pertanaman dilakukan untuk mendapatkan informasi terhadap lokasi kebun, varietas wortel yang ditanam, dan tipe gejala penyakit. Berdasarkan hasil survei diharapkan dapat diketahui prevalensi sebaran Meloidogyne spp. berdasarkan ketinggian tempat. Pengamatan gejala penyakit dilakukan pada bagian tajuk (di atas permukaan tanah) dan perakaran tanaman sakit. Gejala pada tajuk yang diamati adalah tinggi tanaman, warna daun, dan klorosis, sedangkan gejala pada perakaran berupa bentuk umbi, letak dan ukuran puru, dan keberadaan akar rambut (hairy root). Identifikasi Nematoda Pengamatan Keberadaan NPA di Dalam Jaringan. Akar rambut (hairy root) berpuru direndam dalam klorox 5% selama 10 menit dan dibilas dengan air hingga tak berbau. Akar rambut berpuru kemudian direndam dalam acid fuchsin dan dipanaskan hingga mendidih. Akar rambut berpuru dibilas dengan air,

24 14 kemudian direndam dengan glyserin dicampur dengan dua tetes HCl dan dipanaskan sampai warna merah pudar. Akar rambut berpuru diletakkan di gelas preparat cekung, dilem, kemudian diamati stadia nematoda yang ada dengan menggunakan mikroskop. Hal ini digunakan untuk melihat siklus hidup nematoda yang berada di dalam akar. Identifikasi NPA Dengan Pola Sidik Pantat Nematoda (Sidik Perineal). Identifikasi sidik pantat dilakukan terhadap 150 nematoda betina. Setiap 50 ekor nematoda betina mewakili satu ketinggian tempat/ elevasi. Akar dan umbi sakit dicuci untuk membersihkan tanah yang menempel. Puru kemudian dipisahkan dari akar dan umbi. Puru direndam selama kurang lebih 24 jam. Setelah puru melunak, nematoda betina dicongkel perlahan dari puru dan dipindahkan ke dalam cawan sirakus yang telah berisi asam cuka. Asam cuka berguna untuk menghilangkan lemak yang berada dalam tubuh nematoda betina. Setelah itu, nematoda betina dipindahkan ke gelas objek. Bagian anterior dipotong dengan pisau khusus kemudian bagian posterior ditekan agar sisa kotoran dan lemak dalam tubuh nematoda keluar. Potongan dipindahkan dalam laktophenol blue 0.03% dan dibiarkan sebentar. Bagian posterior disayat dan jaringan di dalam dibuang secara hati-hati. Sidik pantat kemudian dipindahkan ke gelas objek lain dengan ditetesi setetes laktophenol blue. Gelas penutup direkat kutek kuku kemudian diamati lebih lanjut di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Selanjutnya preparat dicocokkan dengan panduan A guide to the four most common species of root knot nematodes (Meloidogyne species) with a pictorial key (Eisenback et al. 1981; Shurtleff & Averre 2005). Identifikasi NPA Berdasarkan PCR Gen ITS r-dna. Ekstraksi Total DNA Nematoda. Ekstraksi DNA nematoda dilakukan dengan mengekstraksi puru yang berada pada akar dan umbi terinfeksi NPA (Zouhar et al. 2001). Puru digerus dengan mortar dan pistil, kemudian ditambahakan buffer ekstrak (50 mm Tris HCl ph 8.0, 0.7 M NaCl, 10 mm EDTA, 1% CTAB) dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 60 o C. Setiap 10 menit tabung mikro dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Tabung mikro kemudian diambil dari waterbath dan didinginkan sekitar 3-5 menit pada suhu ruangan. Chloroform Isoamilalcohol ditambahkan dengan perbandingan 1:1 terhadap buffer ekstrak. Suspensi

25 15 disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan rpm. Supernatan yang terbentuk diambil secara hati-hati sebanyak 500 µl dan dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Natrium asetat (CH 3 COONa 3M; ph 5.2) ditambahkan dengan perbandingan 1:10 dengan supernatan yang diambil, kemudian dicampur sampai homogen. Sebanyak 1 ml etanol ditambahkan dan dicampur hingga homogen untuk presipitasi DNA. Tabung diinkubasi pada suhu -20 o C selama 1 jam atau dibiarkan semalaman. Selain ekstraksi DNA NPA menggunakan puru, dilakukan pula ekstraksi terhadap nematoda betina dari NPA (Cenis 1993). Sekitar nematoda betina yang telah dipisahkan dari akar dan puru dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml. Buffer ekstrak (200 mm Tris-HCl: ph 8.5, 250 mm NaCl, 25 mm EDTA dan 0.5% SDS) sebanyak 150 µl DNA kemudian ditambahkan ke dalam tabung mikro dan digerus dengan cornical grinder steril. Setelah homogen ditambahkan larutan sodium asetat (CH 3 COONa 3M; ph 5.2) 0.5 volume dan disimpan dalam ruangan bertemperatur -20 o C selama 10 menit. Kedua suspensi yang didapat masing-masing disentrifugasi pada kecepatan rpm selama 10 menit. Cairan suspensi dibuang dan ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 ml untuk mencuci pelet (endapan DNA), kemudian cairan pelet disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit. Lalu cairan etanol dibuang dan endapan DNA dikeringkan. Buffer TE (10 mm Tris-HCl: ph 8.0, 1 mm EDTA) ditambahkan pada tabung mikro sesuai dengan ketebalan endapan DNA. Pada endapan yang tipis, cukup ditambahkan 30 µl - 40 µl dan untuk endapan yang tebal ditambahkan 50 µl -100 µl. Deteksi Gen ITS r-dna Dengan PCR. Amplifikasi DNA dengan menggunakan primer spesifik untuk (1) M. incognita, yaitu MI-F (primer forward) dengan susunan nukleotida 5 -GTG AGG ATT CAG TCT CCCAG-3 dan MI-R (primer reverse) dengan susunan nukleotida 5 -ACG AGG AAC ATA CTT CTC CGT CC-3 yang telah berhasil digunakan oleh Meng et al. (2004 dalam Kurniawan 2010), (2) M. arenaria, dengan primer forward Far 5 -TCG GCG ATA GAG GTA AAT GAC-3 dan primer reverse Rar 5 -TCG GCG ATA GAC ACT ACA AAC T-3, dan (3) M. javanica, menggunakan primer Fjav (primer forward) 5 -GGT GCG CGA TTG AAC TGA GC-3 dan Rjav (primer

26 16 reverse) 5 -CAG GCC CTT CAG TGG AAC TAT AC-3 (Zijlstra et al. 2000). Sedangkan deteksi M. hapla, M. falax, dan M. chitwoodi menggunakan primer multiplex, yaitu JMV1 5 -GGA TGG CGT GCT TTC AAC-3, JMV2 5 -TTT CCC CTT ATG ATG TTT ACC C-3, dan JMV-hapla 5 AAA AAT CC CTC GAA AAA TCC ACC-3 (Wishart et al. 2002). PCR reagen yang digunakan untuk setiap reaksi PCR yaitu µl ddh 2 O, 2.5 µl Taq buffer 10x Mg 2+, 2.5 µl sukrosa, 0.5 µl dntp 10 mm, 1 µl primer Forward 10 µm, 1 µl primer Reverse 10 µm, 1 µl DNA, dan 0.25 µl Taq DNA polimerase sehingga total volume reaksi PCR menjadi 25 µl (Hyman et al. 1997). Selanjutnya dilakukan PCR pada mesin PCR (thermo cycler) dengan program denaturasi awal pada suhu 94 o C selama 4 menit, diikuti dengan 35 siklus yang meliputi: denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, annealing pada suhu 57 o C selama 45 detik, ekstensi/ pemanjangan pertama pada suhu 72 o C selama 1 menit, kemudian ekstensi akhir pada suhu 72 o C selama 7 menit, dan diakhiri dengan final hold pada suhu 4 o C selama 5 menit. DNA hasil amplifikasi dianalisis untuk melihat visualisasi DNA melalui elektroforesis menggunakan gel agarose 1%, dari besar jumlah buffer yang digunakan (sebanyak g), dalam 40 ml buffer TBE (Tris HCl 45mM, asam borat 45 mm, dan EDTA 1 mm) dan air ml. Agarose dipanaskan selama 2 menit dan setelah agarose agak dingin, larutan tersebut ditambahkan dengan ethidium bromide sebanyak 0.5 µl untuk setiap 10 ml bahan (sebanyak 2 ml untuk 40 ml larutan). Agarose dingin kemudian dituangkan ke dalam wadah cetakan. Pengukuran fragmen DNA menggunakan penanda 1 kb DNA ladder buatan fermentas, United States of America. Sampel disiapkan dengan mencampur 8 µl DNA dan 10 µl loading buffer, kemudian sampel diisikan dalam sumuran gel sebesar 5 µl dengan mikro pipet. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 50 Volt DC selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transiluminator UV dan foto dengan kamera digital.

27 HASIL DAN PEMBAHASAN Deskripsi Lokasi Desa Sumber Brantas berada di Kecamatan Bumiaji, Kota Batu, Jawa Timur. Desa ini terletak di sebelah utara Kota Batu dengan posisi ketinggian 1400 m m dpl. Suhu rata-rata wilayah Desa Sumber Brantas adalah 12 o C - 24 o C dengan kisaran curah hujan tertinggi sebesar 2471 mm dan hari hujan 134 hari (Anonim 2010). Luas wilayah Desa Sumber Brantas kurang lebih ha dengan hampir 75% berupa lahan pertanian (BPS Jatim 2010). Wilayah desa memiliki letak yang diapit oleh beberapa gunung sehingga menjadikan Desa Sumber Brantas memiliki lahan yang subur. Jenis tanah yang terdapat di daerah ini adalah jenis tanah andosol yang berasal dari letusan gunung berapi dan mengandung banyak mineral (Anonim 2010). Penduduk Desa Sumber Brantas berjumlah 3991 jiwa, sebagian besar penduduk bekerja di sektor pertanian. Potensi utama pertanian Desa Sumber Brantas adalah sayur-mayur dengan luas lahan sekitar 387 ha. Tiga jenis sayuran yang menjadi komoditas utama adalah tanaman kentang, wortel, dan kubis (BPS Jatim 2010). Wortel merupakan salah satu komoditas yang memiliki potensi cukup besar selain kentang, dengan luas panen 25 ha dan produktivitas sebesar 1.5 ton/ha (BPS Jatim 2010). Penanaman wortel merupakan pengalihan budidaya tanaman yang dilakukan sejak terjadinya penyebaran infeksi Nematoda Sista Kentang (NSK). Petani mulai menanam tanaman selingan seperti wortel, brokoli, kubis, krisan, dan sebagainya, namun untuk tanaman wortel pada beberapa tahun terakhir sudah menjadi tanaman intensif yang terus ditanam. Gejala Penyakit di Lahan Gejala infeksi nematoda pada bagian tajuk berupa ukuran tajuk yang kerdil dan rumpun tanaman sangat jarang (botak) (Gambar 3). Hal ini disebabkan oleh pertumbuhan tanaman yang melambat dan tingkat infeksi yang tinggi. Daun tanaman wortel yang terinfeksi NPA menguning dan mengalami kelayuan pada siang hari. Roberts dan Mullens (2002) mengungkapkan gejala yang sama akibat

28 infeksi nematoda selain puru, yaitu rumpun tanaman yang jarang, tanaman kerdil, daun menguning, dan rata-rata menjadi layu akibat kehilangan vigor. 18 A B C Gambar 3 Gejala pertanaman wortel terinfeksi NPA pada ketinggian 1800 m (A), 1700 m (B), dan 1600 m (C) dpl Gejala pada bagian perakaran (umbi) yang terinfeksi nematoda dapat berupa akar rambut (hairy root), puru, dan umbi bercabang. Gejala serupa telah dilaporkan oleh Kurniawan (2010) di daerah Jawa Barat, yakni terdapat tanaman wortel dengan gejala kerdil dan ketika dicabut umbi wortel bercabang dengan jumlah puru yang cukup banyak. NPA merupakan nematoda primer pada tanaman wortel yang mampu menginfeksi umbi sehingga umbi mengalami malformasi, umbi menjadi membulat pendek, bercabang, dan berpuru (Nunez et al. 2008). Beberapa gejala pada umbi wortel yang ditemukan di lapang antara lain: gejala umbi berambut, gejala umbi bercabang, dan gejala umbi bercabang berambut (Gambar 4). A B C Gambar 4 Gejala umbi tanaman wortel terinfeksi NPA. Gejala umbi berambut (A), gejala umbi bercabang (B), dan gejala umbi bercabang dan berambut (C) Pada gejala umbi berambut, umbi wortel tampak besar, panjang dengan akar rambut menjuntai lebat disertai dengan puru akar. Puru akar kecil membulat seperti manik-manik pada sepanjang akar rambut. Puru yang terbentuk sama

29 19 dengan puru akibat infeksi M. hapla yang lebih kecil dan lebih membulat dibandingkan dengan puru yang disebabkan spesies NPA lain, yang cenderung lebih besar dan menyatu (Roberts & Mullens 2002) (Gambar 4A). Pada gejala umbi bercabang, umbi wortel membentuk percabangan tanpa akar rambut. Percabangan umbi wortel tumbuh memanjang dengan 2-3 cabang (Gambar 4B). Pada gejala umbi bercabang dan berambut, umbi bercabang dengan banyak akar rambut (hairy root) dan percabangan terjadi lebih dari 2 cabang. Pada akar rambut terdapat puru, berbentuk kecil seperti manik-manik, berderet sepanjang perakaran. Umbi lebih pendek dan membengkak dibandingkan dengan umbi sakit pada dua gejala sebelumnya (Gambar 4C). Infeksi NPA menyebabkan umbi tanaman wortel menjadi bercabang (forking) (Tanaka et al. 1997), membulat dengan ukuran lebih pendek, dan membentuk akar rambut yang cukup banyak (hairiness) (Vrain 1982). Gejala yang sama dilaporkan Kurniawan (2010) dan Taher (2012), umbi wortel yang terinfeksi nematoda di Jawa Barat dan Jawa Tengah juga mengalami malformasi umbi. Gejala malformasi di kedua daerah tersebut dikelompokan menjadi empat bentuk malformasi umbi yakni umbi bercabang, umbi pendek membulat, umbi pecah, dan umbi berambut (hairiness). Berdasarkan hasil pengambilan sampel umbi wortel sakit pada ketinggian 1600 m m dpl, ditemukan ketiga tipe umbi tersebut (Tabel 1). Lokasi pengambilan sampel pertama pada ketinggian 1800 m dpl dengan suhu tanah 15 o C, didominasi oleh gejala umbi berambut (Gambar 4A). Gejala umbi bercabang paling dominan pada lokasi kedua, yaitu pada ketinggian 1700 m dpl dengan suhu tanah 18 o C (Gambar 4B). Sedangkan pada lokasi ketiga berada pada ketinggian 1600 m dpl dengan suhu tanah 19 o C, gejala yang mendominasi adalah gejala umbi bercabang dan berambut (Gambar 4C). Pada ketinggian ini, intensitas penyakit dirasa paling besar dibandingkan dengan dua ketinggian lain. Kondisi lahan lebih botak di setiap gundukan dan kondisi tanaman lebih banyak yang kerdil dengan daun menguning. Hal tersebut dikarenakan tingkat infeksi NPA lebih tinggi pada lokasi ketiga dibandingkan dengan lokasi pertama dan kedua.

30 20 Tabel 1 Tipe gejalaa pada umbi wortel yang terinfeksi NPA di Desa Sumber Brantas pada ketinggian m, m, dan m dpl Bentuk Umbi Ketinggian (m dpl) Umbi berambut (hairy root) Ada Ada Ada Umbi bercabang Ada Ada Ada Umbi bercabang berambut Ada Ada Ada Tanaman bergejala terkonsentrasi pada titik-titik tertentu dan tidak dijumpai pada titik lainnya. Pada lahan dengan tingkat infeksi rendah pola penyebaran penyakit terjadi pada beberapaa titik dan mengelompok pada guludan tertentu. Pola sebaran inilah yang dikenal sebagai pola penyebaran spasial (Barker & Campbell 1981). Setelah diamati lebih rinci, diketahui bahwa puru yang ditemukan pada tanaman wortel sakit terbentuk pada akar rambut (hairy root), akar, dan umbi (Gambar 5). Gejala puru ini dapat dijumpaii pada akar yang umbinya tidak normal atau mengalami malformasi (Kurniawan 2010). A Gambar 5 B C Lokasi terbentuknya puru pada akar rambut (hairy root) (A), padaa akar (B), dan pada umbi wortel (C) Hasil pengamatan umbi wortel ditemukan lima tipe puru yaitu tipe bulat pada akar rambut (hairy root), puru seperti kudis, puru seperti akar gada, puru memanjang, dan puruu bulat berukuran besar (>0.5 cm) (Gambar 6). Keberadaan kelima tipe puru pada tiap ketinggian memiliki jumlah yang berbeda-beda berdasarkan hasil pengamatan.

31 21 A B C D E Gambar 6 Tipe puru pada perakaran wortel: puru bulat pada akar rambut (hairy root) (A), puru seperti kudis (B), puru seperti akar gada (C), puru memanjang (D), dan puru bulat berukuran besar (>0.5 cm) (E) Kelima tipe puru tersebut menurut Kurniawan (2010) dideskripsikan sebagai berikut: (1) puru tipe bulat pada akar rambut (hairy root) berupa puru berbentuk bulat, kecil sempurna dengan warna krem yang berada di sepanjang akar rambut yang tumbuh di permukaan umbi wortel (Gambar 6A), (2) puru seperti kudis ditandai dengan adanya bagian perakaran yang terlihat seperti kudis (Gambar 6B), (3) puru seperti akar gada berbentuk menyerupai akar gada yang terdapat pada famili kubis-kubisan (Gambar 6C), (4) puru tipe memanjang terbentuk pada akar dan berada di sepanjang perakaran, biasanya tidak terlalu banyak jumlahnya dalam satu akar memanjang (Gambar 6D), dan (5) puru tipe bulat berukuran besar (>0.5 cm) banyak terdapat pada umbi wortel yang kerdil, agak membesar dan pada umbi bercabang. Puru berukuran lebih besar dari 0.5 cm, berwarna orange putih (Gambar 6E). Semua tipe puru dapat ditemukan pada setiap ketinggian kecuali puru yang berbentuk akar gada. Puru tipe tersebut hanya dapat ditemukan pada ketinggian 1600 m dpl (Tabel 2). Tabel 2 Tipe puru pada umbi di Desa Sumber Brantas pada ketinggian m, m, dan m dpl Tipe Puru Ketinggian (m dpl) Bulat pada akar rambut (hairy root) Ada Ada Ada Bulat berukuran besar (>0.5 cm) Ada Ada Ada Memanjang Ada Ada Ada Seperti kudis Ada Ada Ada Seperti akar gada Tidak ada Tidak ada Ada

32 22 Identifikasi Nematoda Pengamatan Keberadaan NPA di dalam Jaringan Pengamatan keberadaan NPA di dalam jaringan dilakukan untuk mengetahui posisi dan stadia nematoda tanaman wortel, juga sebagai bukti bahwa nematoda memang penyebab dari penyakit umbi bercabang ini. NPA betina dewasa berhasil ditemukan di dalam jaringan akar wortel (Gambar 7). A B C Gambar 7 Nematoda betina dewasa dalam jaringan (A), (B), dan (C) Identifikasi NPA dengan Pola Sidik Pantat Nematoda (Sidik Perineal) Hasil indentifikasi pola sidik pantat nematoda betina dewasa menunjukan adanya 4 spesies NPA di semua lokasi pengambilan sampel. Keempat spesies tersebut adalah M. arenaria, M. hapla, M. incognita, dan M. javanica. Masingmasing spesies dapat dikenali berdasarkan ciri khas dari pola sidik pantat yang dimiliki. Perbedaan pola sidik pantat dari setiap spesies dapat dilihat pada Gambar 8. M. arenaria memiliki lengkung dorsal rendah dan ramping di sekitar garis lateral. Bagian lengkung stria bercabang di dekat garis lateral dengan bagian stria atas lebih mendatar (Gambar 8A). M. hapla dicirikan oleh lengkung dorsal yang rendah dengan bagian ujung sering membentuk sayap ke bagian lateral baik pada satu ujung atau kedua ujungnya. Pada zona ujung ekor terdapat tonjolan-tonjolan seperti duri (Gambar 8B). M. incognita memiliki ciri khas lengkung dorsal yang tinggi dan menyempit, sedangkan pada bagian paling luarnya sedikit melebar dan agak mendatar, tidak memiliki garis lateral dan bagian stria terlihat jelas (Gambar 8C). M. javanica dicirikan oleh dua garis lateral yang sangat jelas memisahkan bagian dorsal dan ventral (Gambar 8D) (Eisenback et al. 1981).

33 23 A B C D h Gambar 8 Hasil ideentifikasi poola sidik paantat NPA. M. arenariia (A), M. hapla (B), M. inncognita (C C), dan M. ja avanica (D)) Prevvalensi spesies Meloiddogyne spp.. berdasarkaan ketinggiaan menunju ukkan spesies M. M hapla meerupakan sppesies yang g dominan pada p setiapp elevasi di Desa Sumber Brantas. B P Prevalensi M. hapla berkisar antara a 64% % sampai 90%, sedangkann prevalensii paling rendah adalah M. arenariaa dengan kiisaran prevaalensi sebesar 0% % sampai 2%. 2 M. inccognita dan n M javanicca ditemukkan lebih baanyak pada ketinnggian m dpl, sebbesar 6% dan n 16% (Tabbel 3). Tabel 3 Prevalensi spesies Meeloidogyne pada p worteel di Desa S Sumber Braantas, pada ketingggian 1800 m, 1700 m,, dan 1600 m dpl S Spesies Prevalenssi pada ketinnggian temppat (%) m dpl m dpl m dp pl M. arenaaria M. haplaa M. incoggnita M. javanica

34 24 Keempat spesies yang ditemukan pada penelitian ini juga ditemukan di daerah Jawa Tengah (Taher 2012) dan Jawa Barat (Kurniawan 2010). Di daerah Jawa Barat, Kurniawan (2010) juga menemukan keberadaan spesies selain keempat spesies tersebut yaitu M. fallax. M. hapla termasuk ke dalam organisme pengganggu tanaman karantina (OPTK) A2, yang artinya keberadannya telah terdeteksi di Indonesia namun daerah penyebarannya masih terbatas pada daerah endemik penyakit. Daerah endemik M. hapla adalah Cipanas, Jawa Barat (Kurniawan 2010), akan tetapi dari dua penelitian yang dilakukan di Jawa Tengah dan Jawa timur, M. hapla telah teridentifikasi menginfeksi tanaman di dua daerah tersebut. Pada tabel prevalensi (Tabel 3), diketahui M. hapla merupakan spesies yang paling banyak ditemukan pada setiap ketinggian. M. hapla memiliki suhu optimum pada suhu 15 o C 25 o C sedangkan suhu di Desa Sumber Brantas berkisar antara 15 o C hingga 19 o C. Hal ini dapat dijadikan sebagai salah satu alasan mengapa M. hapla dapat berkembang biak dengan baik dibandingkan dengan spesies yang lain di daerah ini. Selain itu, jenis tanah andosol Desa Sumber Brantas yang memiliki konsintensi gembur, kadang tekstur membentuk pasir palsu, kaya akan debu (Supardi 1983) memudahkan M. hapla dalam berpindah dan menginfeksi tanaman. NPA lebih bertahan di tanah bertekstur pasir dan kotor dibandingkan dengan tanah liat, hal itu berhubungan dengan ukuran pori dan kecepatan pergerakan nematoda pada lapisan air dan ruang udara antar pori (Roberts & Mullens 2002). Identifikasi Uji Biologi Molekuler Identifikasi PCR dilakukan untuk memperkuat data dan memberikan konfirmasi kebenaran hasil identifikasi sidik pantat. Identifikasi dengan teknik PCR menggunakan tiga pasang primer spesifik yaitu primer Far dan Rar yang berhasil mengamplifikasi wilayah ITS dari M. arenaria dengan pita DNA berukuran 420 bp (Gambar 9A), primer MI-F dan MI-R juga berhasil mengamplifikasi wilayah ITS dari M. incognita dengan pita DNA berukuran 1000 bp (Gambar 9C), serta primer Fjav dan Rjav yang berhasil mengamplifikasi wilayah ITS dari M. javanica dengan pita DNA berukuran 720 bp (Gambar 9D). Primer multiplex hanya berhasil mendeteksi satu spesies, yaitu M. hapla dengan

35 25 menggunakan primer JMV1 dan JMV-hapla yang berhasil mengamplifikasi wilayah ITS dari M. hapla dengan pita DNA berukuran 440 bp (Gambar 9B). M. falax (670 bp) dan M. chitwood bernilai negatif, pita DNA pita kedua spesies ini tidak munculnya pada hasil elektroforesis. M M bp 440 bp A M B M bp 720 bp C D Gambar 9 Hasil amplifikasi DNA pada 1% agarose gel elektroforesis M. arenaria 420 bp (A), M. hapla 440 bp (B), M. incognita 1000 bp (C), dan M. javanica 720 bp (D). M: DNA ladder; 1: ketinggian 1800 m, 2: ketinggian 1700 m, 3: ketinggian 1600 m dpl; panah menunjukkan ukuran DNA hasil amplifikasi Hasil PCR positif menunjukan keberadaan empat spesiess NPA yaitu M. hapla, M. incognita, M. arenaria, dan M. javanica (Tabel 4). Hal ini memperkuat hasil identifikasi pola sidik pantat yang dilakukan sebelumnya. Pengujian dengan pendekatan biologi molekuler diyakini lebih cepat dan lebih akurat dibandingkan dengan identifikasi karakter morfologi dan pola sidik pantat (Esbenshade & Triantaphyllou 1990) ).