Metode Penelitian terdiri dari beberapa tahapan kerja (Gambar 2).

Transkripsi

1 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan dari bulan September 2010 hingga Juni 2011 di Laboratorium Mikologi, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Pusat Penelitian Pengembangan Konservasi dan Rehabilitasi, Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Bogor. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan diantaranya adalah: AIA sintetik, akuades, dedak, isolat Penicillium IPBCC dan Trichoderma IPBCC ; jagung, kemisitin, media PDA (Potato Dekstrose Agar), media EMPA (Ekstrak Malt Pepton Agar), media agar Czapek, media agar EMPT (Ekstrak Malt Pepton Tanat), media agar EMPG (Ekstrak Malt Pepton Galat), meranti tembaga (Shorea leprosula) umur 9 bulan, 1-naftol, p-kresol, reagen Salkowski, serasah meranti, tanah dan urea. Peralatan yang digunakan diantaranya adalah: autoklaf, cawan petri, cork borer, erlenmeyer, jarum inokulasi, laminar, tabung falkon, tabung reaksi, termometer, timbangan analitik, spektrofotometer, peralatan pembuatan baglog, peralatan pengomposan dan peralatan bioasai. Metode Penelitian terdiri dari beberapa tahapan kerja (Gambar 2). Peremajaan Kultur Stok Kultur stok Penicillium IPBCC dan Trichoderma IPBCC diremajakan pada media PDA dan diinkubasi selama 7 hari pada kondisi ruang. Biakan ini digunakan sebagai kultur kerja. Sebanyak 3 potong (diameter 5 mm) biakan dari kultur kerja dipindahkan ke dalam 50 g media jagung dan diinkubasi dalam kondisi ruang selama 14 hari. Biakan dalam media jagung dijadikan sebagai sumber inokulum pada proses pengomposan.

2 12 peremajaan kultur stok pada PDA kultur kerja pengumpulan serasah meranti persiapan bahan kompos produksi konidia pada media jagung pengomposan perlakuan kapang tunggal (Penicillium, Trichoderma) dan kombinasinya (1:1), KA 60% dan inkubasi 4 bulan pengamatan setiap bulan sintasan Penicillium dan Trichoderma mutu kompos kadar AIA suhu pengamatan pada akhir pengomposan kehilangan bobot laju dekomposisi bioasai analisis lignolitik Gambar 2 Alur penelitian Analisis Kualitatif Lignolitik Analisis kualitatif lignolitik dilakukan untuk menetapkan aktivitas enzim fenoloksidase, lakase dan tironase dari kultur kerja. Sepotong biakan Trichoderma dan Penicillium (± 5 mm diameter) ditumbuhkan pada media EMPA (Ekstrak Malt Pepton Agar) yang telah ditambahkan asam tanat 0.5 % (media agar EMPT) atau asam galat 0.5% (media agar EMPG). Biakan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Koloni kapang yang menampakkan aktifitas fenoloksidase akan membentuk zona berwarna coklat di bawah dan sekitar koloni (Bavendamm

3 ). Aktivitas fenoloksidase ditetapkan secara kualitatif berdasarkan rasio diameter zona berwarna di luar koloni terhadap diameter koloni. Aktivitas lakase dan tirosinase ditetapkan menurut metode pewarnaan (Hutchinson 1990). Kultur kerja ditumbuhkan pada media EMPA hingga berumur 4 hari, selanjutnya koloni diberi 1-2 tetes naftol pada posisi pukul 12 dan kresol pada posisi pukul 6. Perubahan warna diamati 1 jam setelah penetesan dan diulang pada jam ke 24. Perubahan warna koloni dan media di sekitar tempat penetesan naftol menjadi biru sampai ungu menandakan adanya lakase. Pembentukan warna merah orange sampai coklat setelah penetesan kresol menandakan adanya tirosinase. Pengomposan Serasah meranti yang berasal dari hutan penelitian CIFOR Dramaga dikumpulkan. Kemudian serasah tersebut dicuci dengan air mengalir sampai bersih dan dikering udarakan. Sebanyak 100 g dari serasah yang telah dikering udarakan dipergunakan untuk penetapan kadar airnya (KA). Sejumlah serasah lainnya dihancurkan dengan menggunakan mesin pencacah. Cacahan serasah meranti selanjutnya ditambah 15% dedak dan 2% urea serta akuades hingga mencapai kadar air 60% dan dicampur dengan bantuan mesin pencampur. Sebanyak 100 g berat basah campuran bahan kompos dimasukkan ke dalam kantong plastik putih tahan panas (baglog) kemudian dipadatkan dan diberi cincin paralon pada ujungnya. Selanjutnya bahan kompos dalam baglog ditutup dengan kapas dan kertas lalu diikat dengan karet. Baglog-baglog disterilisasi dengan mesin uap (steam) pada suhu 104ºC selama setengah jam. Bahan kompos yang tidak disteam digunakan sebagai pembanding (S-I-). Bahan kompos yang disteam kemudian dicampur dengan suspensi konidia Penicillium (SI1) atau Trichoderma (SI2) sebagai inokulan tunggal sebanyak ± 10 g dalam media jagung atau inokulan campurannya (1:1) (SI3). Bahan kompos yang disteam saja digunakan sebagai kontrol negatif (SI-), sedangkan sebagai kontrol positif (SA) adalah bahan kompos yang ditambah AIA sintetik 4 ppm. Setiap perlakuan dibuat 80 kantong. Sebanyak tiga kantong setiap pelakuan diamati setiap bulan selama empat bulan dengan

4 14 variabel pengamatan meliputi: sintasan Trichoderma dan Penicillium, kualitas kompos (rasio C/N, KA dan uji organoleptik kompos), suhu serta kadar AIA. Pada bulan keempat dilakukan analisis hara makro (P, K, Ca dan Mg), pengukuran bobot kompos dan laju dekomposisi. Laju dekomposisi dihitung berdasarkan persamaan Fioretto (2005) yaitu: k = - ln (X t /X o ) t dengan k = laju dekomposisi X o = berat awal substrat (g) X t = berat tersisa substrat (g) dan t = bulan. Kualitas kompos meliputi analisis kadar air, rasio C/N, kadar hara makro (P, K, Ca dan Mg) serta uji organoleptik terhadap warna, tekstur dan bau kompos dilakukan dengan tiga responden. Warna, tekstur dan bau kompos ditetapkan berdasarkan sistem skor (Tabel 1) dan dinyatakan dalam rataan skor. Tabel 1 Daftar skor untuk warna, tekstur dan bau kompos Skor Warna Tekstur Bau 0 tidak hitam seperti bahan kompos seperti bahan kompos 1 Hitam seperti tanah seperti tanah Penetapan kadar air (KA), rasio C/N dan kadar hara makro dilakukan pada sampel yang diambil dari kompos campuran 3 baglog. Analisis dilakukan oleh laboratorium Kesuburan Tanah, Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB). Analisis KA dan kandungan C ditetapkan secara berkesinambungan. Analisis KA menggunakan metode gravimetri dan kadar C dalam kompos diukur berdasarkan metode lost on ignation (Lampiran 1). Analisis kadar N, P dan K diukur dengan menggunakan metode berturut-turut yaitu Kjeldahl, titrasi, pengabuan basah dan kalorimetri serta flamefotometer (Lampiran 2). Analisis kadar Ca dan Mg dilakukan dengan menggunakan metode pengabuan basah dan AAS (Atomic Absorption Spectroscopy) (Lampiran 3).

5 15 Sintasan Penicillium dan Trichoderma Sintasan Penicillium dan Trichoderma ditetapkan berdasarkan perhitungan populasi Penicillium dan Trichoderma yang dapat diisolasi kembali dari kompos dan dinyatakan dalam jumlah koloni/gram kompos. Sebanyak 1 g kompos direndam dengan 9 ml akuades steril, dan diencerkan secara bertingkat sampai Suspensi dihomogenisasi dengan menggunakan vortek. Sebanyak 1 ml suspensi dituangkan dan disebarkan pada permukaan media agar Czapek cawan yang mengandung kemisitin. Biakan diinkubasikan selama 3 hari pada masing-masing perlakuan dengan 3 ulangan. Setelah 3 hari, koloni yang menggambarkan ciri Penicillium dan Trichoderma dihitung. Koloni kapang kontaminan diidentifikasi dan dihitung. Penetapan Kadar AIA Sebanyak 10 g kompos direndam dalam 90 ml akuades steril selama 15 menit dan divortek selama 1 menit. Filtrat dipisahkan dari serbuk kompos dengan jalan disentrifus pada 4500 rpm selama 30 menit. Supernatan dipergunakan sebagai sumber AIA. Sumber AIA sebanyak 1 ml ditambahkan ke dalamnya 4 ml reagen Salkowski (150 ml H 2 SO 4 pekat, 7.5 ml 0.5 M FeCl 3, 250 ml akuades steril) (Patten & Glick 2002). Perubahan warna menjadi merah jambu menandakan adanya AIA. Absorbansi dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang panjang gelombang 530 nm. Konsentrasi AIA (ppm) yang diproduksi diperoleh melalui konversi absorbansi pada kurva standar AIA (Ahmad et al. 2005). Analisis AIA dilakukan pada setiap perlakuan dengan 3 ulangan. Adanya AIA dengan konsentrasi tinggi pada kompos terpilih dilanjutkan dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) pada panjang gelombang 530 nm. Analisis HPLC dilakukan di Laboratorium Residu Bahan Agrokimia, Balai Penelitian Lingkungan Pertanian, Departemen Pertanian, Bogor. Analisis HPLC dilakukan berdasarkan pada prosedur analisis dari lembaga tersebut (Lampiran 8). Analisis AIA ini menggunakan HPLC Shimadzu L Mpa, dengan kolom C18, fase gerak menggunakan metanol 60%, kecepatan aliran sekitar 5 ml/menit pada suhu 40 o C dengan panjang

6 16 gelombang 530 nm dan waktu 15 menit. Konsentrasi AIA (ppm) ditentukan melalui konversi area kromatogram sampel terhadap kurva standar AIA dikali faktor pengenceran. Bioasai Stek pucuk dari bibit meranti tembaga (S. leprosula) yang berumur sembilan bulan digunakan sebagai indikator efektifitas pengomposan. Bahan stek yang digunakan memiliki ukuran minimal 2 ruas daun dengan sepasang daun yang telah dipotong ¾ bagian. Kompos berumur 4 bulan dari masingmasing perlakuan dicampur tanah steril (1:1). Campuran ini digunakan sebagai media tanam. Media tanam dimasukkan ke dalam potray ukuran 4.5 cm x 4.5 cm x 12 cm. Media tanam sebelumnya dibuat lubang tanam dengan menggunakan potongan batang kayu yang runcing, agar ujung stek tidak terluka pada saat penanaman. Pada setiap pot ditanam 1 bahan stek, lalu media tanam dipadatkan dengan cara ditekan menggunakan 2 jari agar stek tidak bergoyang saat penyiraman. Sebanyak 30 bahan stek meranti ditanam pada setiap jenis kompos. Potray kemudian disungkup dan diletakan di rumah kaca yang dilengkapi dengan sistem pendingin atau sistem KOFFCO (Komatsu-FORDA Fog Cooling System). Setelah penanaman dilakukan penyiraman dengan percikan air yang halus. Penyiraman dilakukan setiap 3 hari pada minggu pertama, kemudian seminggu sekali pada minggu ketiga sampai minggu keempat dan selanjutnya penyiraman dilakukan setiap bulan. Setelah 2 bulan, jumlah stek yang berakar, jumlah dan panjang akar (cm) serta bobot kering (mg) akar stek diamati. Berat kering akar diukur dengan cara akar dikeringkan dengan oven pada suhu 70 o C selama 2 x 24 jam selanjutnya ditimbang.