BAB 3 METODE PENELITIAN. 3.1 Alat dan Bahan Alat Spektrofotometri UV-Visible Rotari Evaporator. Fiber Scientific

Transkripsi

1 BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Alat Spektrofotometri UV-Visible SP-300 Rotari Evaporator Buchi Laminar air flo cabinet Astec HLF 1200 L Oven Fischer Scientific Inkubator Fiber Scientific Lemari Pendingin Toshiba Glass Beaker Gelas erlenmeyer Neraca analitis Mettler AE 200 Corong pisah Desikator Simax Czechoslovakia Pipet makro Eppendorf Jarum ose Autoklaf Yamata SN 20 Kuvet Neraca analitis Cawan petri Jangka sorong

2 3.1.2 Bahan Daun Benalu Kopi (Loranthus parasiticus (L.) Merr) Etanol Metanol Etil Asetat Aquadest Pereaksi Wagner Pereaksi Maeyer Pereaksi Bouchardat Pereaksi Dragendorf FeCl3 5% CeSO4 1% dalam H2SO4 10% Logam Mg HCl pekat Amoniak Kloroform HCl 2N DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazil) DMSO (dimetilsulfoksida) Nutrient Broth (NB) Nutrient Agar (NA) Mueller Hinton Agar (MHA) Bakteri Staphylococcus aureus Bakteri Escherichia coli p.a Merck p.a Aldrich p.a Fisons p.a Oxoid p.a Oxoid p.a Oxoid

3 3.2 Prosedur Penelitian Penyediaan Sampel Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Daun Benalu Kopi yang diperoleh dari Desa Parongil,Kecamatan Sumbul, Kabupaten Dairi, Sumatera Utara. Daun benalu kopi dipisahkan dari batang dan buahnya. Sampel dikeringkan dalam ruangan selama 5 hari kemudian dihaluskan dengan blender Analisa Kadar Air Ditimbang 2 gram sampel lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C- 110 C selama 2 jam, lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Kemudian ditimbang. Diulangi pengeringan sampai diperoleh berat tetap Pembuatan Ekstrak Metanol dan Etil asetat dari Daun Benalu Kopi Ditimbang serbuk daun benalu kopi sebanyak 600 g, dimaserasi dengan menggunakan pelarut metanol selama 3 24 jam. Kemudian disaring. Dilakukan pengulangan hingga larutan berwarna jernih. Filtrat yang diperoleh dirotarievaporator dan ekstrak pekat metanol yang diperoleh dipekatkan kembali pada penangas air sampai diperoleh ekstrak bebas dari pelarut metanol dan ditimbang. Sebagian ekstrak kering metanol dilarutkan dengan pelarut etil asetat,kemudian disaring. Dilakukan pengulangan hingga larutan berwarna jernih. Filtrat yang diperoleh dirotarievaporator dan ekstrak pekat etil asetat yang diperoleh dipekatkan kembali pada penangas air sampai diperoleh ekstrak bebas dari pelarut etil asetat dan ditimbang. Ekstrak kering yang dihasilkan diuji skrining fitokimia, aktivitas antioksidan dan antibakteri.

4 3.2.4 Uji Skrining Fitokimia 1. Uji Alkaloid Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksu Wagner, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloid. Tabung II ditetesi pereaksi Maeyer, jika terbentuk endapan putih,maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Boucahardat,jika terbentuk endapan cokelat, maka positif mengandung alkaloida,dan tabung IV ditetesi dengan pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida. 2. Uji Flavonoida Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi masing-masing dimasukkan kedalam 2 tabung reaksi. Tabung I ditetesi NaOH 10%, jika terbentuk larutan warna biru violet maka positif mengandung flavonoida. Tabung II ditambah serbuk Mg dan HCl pekat,jika terbentuk larutan warna jingga maka positif mengandung flavonoida. 3. Uji Tanin Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi masing-masing dimasukkan kedalam tabung reaksi,kemudian ditambah dengan FeCl3 5%. Jika terbentuk larutan warna biru kehitaman maka positif mengandung tanin. 4. Uji Terpenoida Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan CeSO4 1% dalam H2SO4 10%. Jika terbentuk endapan warna merah kecoklatan maka positif mengandung terpenoida.

5 5. Uji Saponin Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi masing-masing ditambah 10 ml aquades,kemudian dikocok kuat-kuat. Jika muncul busa yang stabil maka positif mengandung saponin Uji Sifat Antioksidan Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mm Larutan DPPH 0,3 mm dibuat dengan melarutkan mg serbuk DPPH dengan etanol p.a dalam labu takar 100 ml, kemudian dihomogenkan Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu pohon kopi dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g ekstrak metanol dan etil asetat dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Kemudian dari larutan 100 ppm dibuat larutan 50 ppm. Kemudian dari larutan 50 ppm dibuat lagi variasi konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm untuk diuji aktivitas antioksidannya Uji Aktivitas Antioksidan a. Uji Aktivitas Antioksidan Larutan Blanko Sebanyak 2,5 ml etanol p.a ditambahkan 1 ml larutan DPPH 0,3 mm dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap. Kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 515 nm.

6 b. Uji Aktivitas Antioksidan Sampel Sebanyak 2,5 ml ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi 5 ppm ditambahkan dengan 1 ml larutan DPPH 0,3 mm dalam tabung reaksi,dihomogenkan dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 30 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang maksimum 515 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 10, 15, 20, 25 ppm Uji Sifat Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Pembuatan Media Nutrient Agar (NA) Sebanyak 7 g nutrient agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquadest dan dipanaska hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut C. Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi pada suhu 35 C selama jam. Hal yang sama juga dilakukan pada biakan bakteri Escherichia coli Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA) Sebanyak 19 g serbuk Mueller Hinton Agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 500 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.

7 Penyiapan Inokulum Bakteri Sebanyak 3,25 g nutrient broth dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 35 C selama 3 jam,lalu diukur panjang gelombang dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang nm. Hal yang sama dilakukan untuk koloni bakteri Escherichia coli Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Ekstrak Metanol dan Etil Asetat dibuat dalam berbagai konsentrasi dengan menimbang ekstrak masing-masing sebanyak 100 mg,200 mg,300 mg,400 mg,500 mg, kemudian dilarutkan masing-masing dengan 1 ml DMSO. Konsentrasi ekstrak adalah 100 mg/ml,200 mg/ml,300 mg/ml,400 mg/ml dan 500 mg/ml Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Sebanyak 0,1 ml inokulum Staphylococcus aureus dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 ml dengan suhu C dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata,kemudian dibiarkan sampai media memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak metanol dan etil asetat dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 C selama jam. Selanjutnya diukur diamater zona hambat di sekitar kertas cakramdengan jangka sorong. Dilakukan perlakuan yang smaa terhadap bakteri Escherichia coli.

8 3.3 Bagan Penelitian Pembuatan Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Daun Benalu Kopi dikeringkan dihaluskan Serbuk Daun Benalu Kopi ditimbang sebanyak 600 g dimaserasi dengan 3 liter metanol selama ± 5 24 jam disaring Filtrat Residu diuapkan dengan rotary evaporator Ekstrak Pekat Metanol Pelarut dipekatkan kembali dengan penangas air hingga bebas dari pelarut Ekstrak Metanol Ekstrak Metanol Hasil ditimbang diuji skrining fitokimia diuji aktivitas antioksidan diuji aktivitas antibakteri Filtrat diekstraksidengan etil asetat sampai filtrat berwarna bening dipekatkanmenggunakan penangas air hingga bebas dari pelarut Ekstrak Kering Etil Asetat ditimbang diuji skrining fitokimia diuji aktivitas antioksidan diuji aktivitas antibakteri Endapan Hasil

9 3.3.2 Analisa Kadar Air 2 g serbuk daun benalu kopi dikeringkan dalam oven pada suhu 105C-110C selama 2 jam didinginkan dalam desikator selama 30 menit ditimbang diulangi pengeringan sampai diperoleh berat tetap Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Ekstrak Metanol Daun Benalu kopi Dimasukkan kedalam 5 tabung reaksi Tabung I + Pereaksi Wagner Tabung II + Pereaksi Maeyer Tabung III + Pereaksi Dragendroff Tabung I + NaOH 10% Tabung II + logam Mg +HCl (p) Ditambahkan FeCl 3 5% Ditambahkan CeSO 4 1% dalam H 2 SO 4 10% Ditambahkan Aquades dan dikocok kuatkuat Tabung IV + Pereaksi Bouchardat Alkaloid Flavonoid Tanin Terpenoid Saponin Dilakukan perlakuan yang sama untuk ekstrak etil asetat daun benalu kopi.

10 3.3.4 Uji Sifat Antioksidan Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi 0,025 g Ekstrak Metanol Daun Benalu Kopi dimasukkan kedalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda dihomogenkan 25 ml larutan induk 1000 ppm dipipet 2,5 ml larutan induk 1000 ppm dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda dihomogenkan 25 ml larutan induk 100 ppm dipipet 12,5 ml larutan induk 100 ppm dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml ditambahkan etanol p.a hingga garis batas dihomogenkan 25 ml larutan induk 50 ppm dibuat variasi 5,10,15,20,dan 25 ppm dipipet 2,5 ml dengan pipet volume dipipet 5 ml dengan pipet volume dipipet 7,5mL dengan pipet volume dipipet 10 ml dengan pipet volume dipipet 12,5 ml dengan pipet volume dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml diencerkan dengan etanol p.a hingga garis tanda diencerkan dengan etanol p.a hingga garis tanda diencerkan dengan etanol p.a hingga garis tanda diencerkan dengan etanol p.a hingga garis tanda diencerkan dengan etanol p.a hingga garis tanda dihomogenkan dihomogenkan dihomogenkan dihomogenkan dihomogenkan larutan 5 ppm larutan 10 ppm larutan 15 ppm larutan 20 ppm larutan 25 ppm Dilakukan perlakuan yang sama untuk ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Kopi.

11 Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mm 11,85 mg DPPH Dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas Dihomogenkan Larutan DPPH 0,3mM Uji Aktivitas Antioksidan a. Uji Blanko 1 ml larutan DPPH 0,3 mm Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 2,5 ml etanol p.a Dihomogenkan Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 515 nm Hasil

12 b. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi 1 ml larutan DPPH 0,3 mm Dimasukkan kedalam tabung reaksi Ditambahkan 2,5 ml ekstrak metanol daun benalu kopi sesuai dengan variasi konsentrasi Hasil Dihomogenkan Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 515 nm Dilakukan perlakuan yang sama untuk ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Kopi Uji Sifat Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA) 7 gram media MHA (Mueller Hinton Agar) Dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam gelas erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Media MHA (Mueller Hinton Agar) steril

13 Pembuatan Media Nutrient (NA), Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri 7 gram media NA (Nutrient Agar) Dilarutkan dengan 250 ml aquadest kedalam gelas erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Media NA (Nutrient Agar) steril Dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml Dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut o C Diambil biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama dengan jarum ose laludigoreskan pada media NA yang telah memadat Diinkubasi pada suhu 35 o C selama jam Stok Kultur Bakteri Dilakukan hal yang sama bakteri Escherichia coli.

14 Penyiapan Inokulum Bakteri 6,5 gram Media NB (Nutrient Broth) Dilarutkan dengan 500 ml aquadest kedalam gelas erlenmeyer Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Media NB (Nutrient Broth) steril Dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 5 ml Diambil koloni bakteri dari stok kultur bakteri Staphylococcus aureus dengan jarum ose Disuspensikan kedalam Nutrient Broth (NB) Diinkubasi pada suhu 350 o C selama 2-3 jam Diukur kekeruhan larutan pada panjang gelombang nm sampai diperoleh transmitan 25 (disamakan kekeruhanna dengan standart Mcfarland) Hasil Dilakukan perlakuan yang sama untuk bakteri Escherchia coli.

15 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi 0,1 ml Inokulum Bakteri Dimasukkan kedalam cawan petri steril Ditambah dengan 15 ml media Mueller Hinton Agar (MHA) dengan suhu o C Dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata Dibiarkan sampai media memadat Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak metanol daun benalu kopi dengan berbagai konsentrasi dengan cawan petri yang telah berisi bakteri Diinkubasi selama jam pada suhu 35 o C Diukur diameter zona bening di sekitar cakram dengan jangka sorong Hasil

16 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian Penentuan Kadar Air Serbuk Daun Benalu Kopi Sampel daun benalu kopi dilakukan analisa kadar air untuk mengetahui kandungan air yang masih terkandung dalam sampel yang telah dikeringkan. Kadar air daun benalu kopi diperoleh dari hasil perhitungan sebagai berikut : Berat sampel Berat setelah pemanasan Kehilangan bobot = 2 g = 1,78 g = 2 g 1,78 g = 0,22 g Kadar air serbuk daun benalu kopi = Ekstraksi Daun Benalu Kopi = Kehilangan bobot berat sampel 0,22g 2 g x 100% x 100% = 11 % Ekstraksi daun benalu kopi dilakukan secara maserasi menggunakan pelarut metanol dan etil asetat sehingga diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut : -Kadar Ekstrak Metanol Daun Benalu Kopi Berat serbuk = 600 gram Berat ekstrak = 76,23 gram Kadar ekstrak metanol daun benalu kopi = -Kadar Ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Kopi = Berat ekstrak Berat sampel kering x 100 % 76,23 gram 600 gram Berat ekstrak metanol kering = 70 gram Berat ekstrak etil asetat = 14,5 gram Kadar ekstrak etil asetat daun benalu kopi = = x 100 % = 12,705 % Berat ekstrak Berat sampel kering x 100 % 14,5 gram 70 gram x 100 % = 20,71 %

17 4.1.3 Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Ekstrak metanol daun benalu kopi yang diperoleh diuji skrining fitokimia untuk mengetahui adanya golongan senyawa alkaloida, flavonoida, terpenoida dan tanin sedangkan ekstrak etil asetat daun benalu kopi mengandung golongan senyawa alkaloida, flavonoida dan terpenoida, yang ditunjukkan pada tabel 4.1. Tabel 4.1. Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Sampel No Parameter Pereaksi Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat 1 Alkaloida Dragendrorf - - Bouchardat + + Mayer - - Wagner Flavonoida NaOH 10 % + + Mg + HCl pekat Tanin FeCl3 5% Terpenoid CeSO4 1 % dalam H2SO4 10 % Saponin Aquadest - - Keterangan : - = Tidak terdeteksi adanya senyawa metabolit sekunder + = Terdeteksi adanya senyawa metabolit sekunder Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Ekstrak metanol daun benalu kopi dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH radikal bebas untuk memperoleh nilai IC50 menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang maksimum 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur sebagai penurunan serapan larutan DPPH (peredaman warna ungu DPPH). Tabel 4.2 dan gambar 4.1 menunjukkan hasil pengukuran absorbansi ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat daun benalu kopi.

18 Tabel 4.2 Hasil Pengukuran Absorbansi Ekstrak Metanol dan Ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Kopi Absorbansi % Peredaman Konsentrasi Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Blanko 0,931 0, ppm 0,750 0,622 19,44 33,19 10 ppm 0,586 0,572 37,05 38,56 15 ppm 0,488 0,506 47,58 45,64 20 ppm 0,355 0,491 61,86 47,26 25 ppm 0,309 0,398 66,80 57,25 % Peredaman Gambar 4.1 Grafik % peredaman terhadap konsentrasi y = 2,3906x + 10,687 R² = 0,9715 Grafik % Peredaman Vs Konsentrasi Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi. y = 1,1364x + 27,334 R² = 0, Konsentrasi (ppm) Persamaan garis regresi dan nilai IC50 yang diperoleh dari ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi dapat ditunjukkan pada Tabel 4.3 dibawah ini. Tabel 4.3 Persamaan Garis Regresi dan Nilai IC50 yang diperoleh dari ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi. No Sampel Persamaan Garis Regresi IC50 1. Ekstrak Metanol y = 2,390x + 10,68 R 2 = 0, Ekstrak Etil Asetat y = 1,136x + 27,33 R 2 = 0,964 % Peredaman Ekstrak Metanol - % Peredaman Ekstrak Etil Asetat - 16,66 ppm 19,29 ppm

19 4.1.5 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi a. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Daun Benalu Kopi Sifat antibakteri ekstrak metanol daun benalu kopi menunjukkan zona hambat pada pertumbuhan beberapa bakteri yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus aureus seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.4 dan gambar 4.2 dan 4.3 dibawah ini : Tabel 4.4 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi. Bakteri Diameter Zona Hambatan No. Konsentrasi (mm) Gram-Positif Gram- Negatif (mg/ml) Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat 1. Staphylococcus aureus Blanko ,03 12,76 13,33 14,9 16,96-11,7 12,73 13,86 14,2 15,2 2. Escherichia Blanko - - coli ,56 11, ,7 13, ,56 13, ,83 15, ,2 16,43 Keterangan : Blanko = kertas cakram direndam dengan pelarut DMSO.

20 Gambar 4.2 Zona hambat bakteri Escherichia coli. Gambar 4.3 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus.

21 b. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Kopi. Sifat antibakteri ekstrak etil asetat daun benalu kopi menunjukkan zona hambat pada pertumbuhan beberapa bakteri yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus aureus seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.4 diatas dan gambar 4.4 dan 4.5 dibawah ini. ` Gambar 4.4 Zona hambat bakteri Escherichia coli. Gambar 4.5 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus.

22 4.2 Pembahasan Penentuan Kadar Air Daun Benalu Kopi Dari hasil penelitian diperoleh kadar air untuk simplisia daun benalu kopi adalah sebesar 11%. Simplisia dinilai cukup aman bila mempunyai kadar air ±10 %. Tujuan dari penentuan kadar air adalah untuk mengetahui batasan maksimal atau rentang besarnya kandungan air didalam bahan. Hal ini terkait dengan kemurnian dan adanya kontaminan dalam simplisia tersebut. Dengan demikian, penghilangan kadar air hingga jumlah tertentu berguna untuk memperpanjang daya tahan bahan selama penyimpanan (Harborne, 1987). Dan juga proses pengeringan didalam prosedur percobaan bertujuan untuk mencegah kerusakan yang ada dalam tanaman sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lama dan juga bertujuan untuk mencegah penjamuran pada sampel,dimana kapang dapat berkembang dengan baik dalam simplisia dengan kadar air sekitar 18% (Miryanti et al, 2011) Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Dari hasil penelitian yang diperoleh kadar ekstrak metanol daun benalu kopi lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etil asetat yaitu masing-masing sebesar 11% dan 20,71%. Kadar ekstrak etil asetat daun benalu kopi lebih besar dibandingkan ekstrak metanol kemungkinan karena didalam daun benalu kopi memiliki kadar tanin yang lebih besar dibandingkan dengan senyawa metabolit sekunder lainnya Skrining Fitokimia Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Skrining fitokimia merupakan tahap pendahuluan dari suatu penelitian yang bertujuan untuk memberikan gambaran tentang golongan senyawa yang terkandung dalam tumbuhan. Berdasarkan hasil skrining fitokimia, golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol adalah alkaloid, flavonoid, tanin dan terpenoida, sedangkan dalam ekstrak etil asetat adalah alkaloid, flavonoid dan terpenoid dapat dilihat dari tabel 4.1.

23 Ekstrak metanol daun benalu kopi positif pada golongan alkaloida, apabila direaksikan dengan pereaksi Bouchardat yang menghasilkan endapan cokelat. Pada pembuatan pereaksi Bouchardat, iodin bereaksi dengan ion I - dari kalium iodida menghasilkan ion I3 - yang berwarna cokelat. Pada uji Bouchardat, ion logam K + akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada alkaloid membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Pardede et al, 2013) Gambar 4.6 dibawah ini menunjukkan reaksi alkaloid dengan pereaksi Bouchardat. I2 + I - I3 - Coklat Kalium-Alkaloid Endapan cokelat Gambar 4.6 Reaksi Alkaloid dengan pereaksi Bouchardat (Pardede et al, 2013). Pada uji flavonoida, penambahan NaOH pada ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi menghasilkan perubahan warna menjadi biru violet yang menunjukkan kandungan golongan flavonoid. Sedangkan penambahan HCl pekat digunakan untuk menghidrolisis flavonoid menjadi aglikonnya yaitu dengan menghidrolisis O-glikosil. Glikosil akan terganti oleh H + dari asam karena sifatnya yang elektrofilik. Glikosida berupa gula dapat dijumpai yaitu glukosa, galaktosa, dan ramnosa. Serbuk Mg menghasilkan senyawa kompleks yang berwarna merah / jingga ( Sangi et al, 2008). Gambar 4.7 menunjukkan reaksi flavonoid dengan HCl pekat dan serbuk Mg. Gambar 4.7 Reaksi uji flavonoid dengan HCl pekat dan serbuk Mg (Sangi et al, 2008)

24 Pengujian tanin dilakukan dengan penambahan larutan FeCl3 5% pada ekstrak metanol daun benalu kopi sehingga menghasilkan hasil yang positif dan terbentuk warna biru kehitaman. Pada penambahan larutan FeCl3 5% diperkirakan larutan ini bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada senyawa tanin. Pereaksi FeCl3 dipergunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol termasuk tanin (Robinson, 1995). Gambar 4.8 menunjukkan reaksi tanin dengan FeCl3. Gambar 4.8 Reaksi uji tanin dengan FeCl3 (Robinson, 1995). Dan juga terpenoid, analisis senyawa didasarkan pada kemampuan senyawa tersebut membentuk warna dengan penambahan CeSO4 1% dalam H2SO4 10%. Hasil yang diperoleh menunjukkan hasil positif dengan perubahan warna menjadi merah kecoklatan yang menunjukkan kandungan golongan senyawa terpenoida. Dari hasil uji skrining fitokimia ekstrak etil asetat mengandung golongan senyawa flavonoida, alkaloida dan terpenoida. Ekstrak metanol dan etil asetat memberikan hasil yang negatif untuk golongan saponin. Ekstrak metanol dapat mengikat golongan flavonoida dan tanin karena pelarut metanol merupakan pelarut yang kepolarannya sangat tinggi sehingga dapat mengikat senyawa polar dan juga senyawa nonpolar. Sedangkan pada ekstrak etil asetat tidak terkandung tanin karena tanin sangat polar sehingga pelarut etil asetat tidak dapat melarutkan tanin.

25 4.2.2 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi. Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi dengan metode DPPH dengan menggunakan alat spektrofotometri UV Visible. Adapun mekanisme utama peredaman utama peredaman radikal DPPH adalah sebagai berikut: Pada uji DPPH, perendaman radikal DPPH diikuti dengan pematauan penurunan absorbansi pada panjang gelombang maksimum yang terjadi karena pengurangan radikal oleh antioksidan AH atau reaksi dengan spesi radikal (R) yang ditandai dengan berubahnya warna ungu pada larutan menjadi warna kuning pucat, data yang sering dilaporkan sebagai IC50 merupakan konsentrasi antioksidan yang dibutuhkan untuk 50 % peredaman radikal DPPH pada periode waktu tertentu (15 30 menit) (Pokornya et al, 2001). DPPH merupakan suatu molekul radikal bebas yang distabilkan oleh bentuk resonansi seperti ditunjukkan pada gambar 4.9 dibawah ini. Gambar 4.9 Kestabilan radikal bebas DPPH (Pokornya et al, 2001). Tabel 4.2 dan 4.3 (halaman 45 dan 46) menunjukkan telah terjadi peredaman radikal bebas DPPH setelah penambahan ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi, dimana semakin tinggi konsentrasi maka % peredaman semakin besar yang ditandai dengan menurunnya absorbansi.

26 Dari persamaan Y = ax + b dapat diketahui oleh nilai IC50 dengan memasukkan nilai 50 sebagai sumbu Y, sehingga diperoleh berapa besar nilai x yang akan mempresentasikan besaran IC50. Dari perhitungan diperoleh nilai IC50 untuk ekstrak metanol dan etil asetat masing-masing sebesar 16,66 mg/l dan 19,29 mg/l. Hasil skrining fitokimia menunjukkan ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi mengandung golongan senyawa kimia berupa flavonoida dan tanin. Flavonoida dan tanin merupakan senyawa fenol yang bersifat sebagai antioksidan (Harbone, 1996). Senyawa senyawa polifenol mengandung gugus hidroksil yang dapat bertindak sebagai donor hidrogen terhadap radikal bebas, yang reaksinya dapat dilihat pada gambar 4.10 (Silalahi, 2006). Gambar 4.10 Reaksi DPPH dengan turunan fenol (Silalahi, 2006). Pada senyawa polifenol, aktivitas antioksidan berkaitan erat dengan struktur rantai samping dan juga substitusi pada cincin aromatiknya. Kemampuannya untuk bereaksi dengan radikal bebas DPPH dapat mempengaruhi urutan kekuatan antioksidannya. Aktivitas perendaman radikal bebas senyawa polifenol diyakini dipengaruhi oleh jumlah dan posisi hidrogen fenolik dalam molekulnya. Dengan demikian aktivitas antioksidan yang lebih tinggi akan dihasilkan pada senyawa fenolik yang mempunyai jumlah gugus hidroksil yang lebih banyak pada inti flavonoidnya. Senyawa fenolik ini mempunyai kemampuan untuk menyumbangkan hidrogen, maka aktivitas antioksidan senyawa fenolik pada reaksi netralisasi radikal bebas yang mengawali proses oksidasi atau pada penghentian reaksi radikal berantai yang terjadi.

27 Dari literatur dapat diketahui bahwa jika nilai IC50 yang dihasilkan kurang dari 50, maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat. Oleh karena itu berdasarkan perhitungan yang diperoleh dapat dikatan bahwa senyawa antioksidan yang terdapat dalam ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi sama-sama memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat. Tingkat kekuatan senyawa antioksidan menggunakan metode DPPH dapat dilihat pada tabel 4.5 dibawah ini. Tabel 4.5 Tingkat kekuatan senyawa antioksidan dengan menggunakan DPPH. `Intensitas IC50` Sangat kuat Kuat Sedang Lemah <50 mg/l mg/l mg/l >150 mg/l (Ionita, 2005) Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol dan Etil Asetat Daun Benalu Kopi Pengujian aktivitas antibakteri bertujuan untuk mengetahui aktivitas bakteri terhadap sampel uji. Metode pengujian aktivitas antibakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah metode difusi agar. Pada metode ini aktivitas bakteri terhadap sampel uji ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat disekitar kertas cakram yang menandakan daerah pertumbuhan bakteri. Pada penelitian ini menggunakan bakteri patogen yang berasal dari gram positif dan gram negatif. Bakteri patogen yang digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Berdasarkan Clinical and Laboratory Standars Institute (2012) bahwa suatu senyawa memiliki aktivitas antibakteri dengan zona hambat 14 mm lemah (resistant), 15 hingga 19 mm sedang (intermediate) dan 20 mm kuat.

28 Hasil uji aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol dan etil asetat efektif menghambat perrtumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Pada tabel 4.4 memperlihatkan bahwa ekstrak metanol dan etil asetatmemiliki aktivitas antibakteri dengan kategori sedang pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat masing-masing sebesar 16,96 mm dan 15,2 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat masing-masing sebesar 17,2 mm dan 16,43 mm terhadap bakteri Escherichia coli. Adanya perbedaan diameter zona hambat pada kedua bakteri menunjukkan bahwa terdapat perbedaan sentivitas ekstrak pada mikroba uji tersebut. Senyawa yang bersifat sebagai antimikroba dapat menyebabkan kerusakan pada dinding sel serta kerusakan pada membran sel berupa denaturasi protein dan lemak yang menyusun membran sel. Ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi lebih efektif menghambat pertumbuhan bakteri gram positif Staphylococcus aureus dibandingkan dengan bakteri gram negatif Escherichia coli. Hal ini disebabkan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada bakteri gram positif dan gram negatif. Struktur dinding sel bakteri gram positif berlapis tunggal dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri gram negatif memiliki kandungan lipid tinggi yaitu 11-12% (Fardiaz, 1992) dan membran luar terdiri dari 3 lapisan yaitu lipopolisakarida, lipoprotein dan pospolipid (Tortora, 2011). Berdasarkan hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun benalu kopi mengandung golongan senyawa metabolit sekunder berupa alkaloid, flavonoida, terpenoida dan tanin, sedangkan ekstrak etil asetat mengandung senyawa akaloid, flavonoid dan terpenoid.adanya senyawa flavonoida dan tanin menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan etil asetat daun benalu kopi mempunyai aktivitas antibakteri karena flavonoida dan tanin merupakan golongan senyawa fenol (Robinson, 1995).

29 Senyawa fenol bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel sehingga protein sel bakteri menjadi kehilangan aktivitas biologinya. Akibatnya fungsi permeabilitas sel bakteri terganggu dan sel bakteri akan mengalami lisis yang berakibat pada kematian sel bakteri (Harborne, 1987). Selain itu senyawa fenol juga dapat merusak lipid pada membran sel melaui mekanisme penurunan tegangan permukaan membran sel (Pelczar dan Chan, 1988). Senyawa alkaloid yang terkandung dalam ekstrak daun benalu kopi yang memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Mekanisme diduga dengan cara mengganggu komponen penyusun peptidoglikan pada sel bakteri sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh, terganggunya sintesis peptidoglikan sehingga permukaan sel tidak sempurna karena tidak mengandung peptidoglikan dan dinding selnya hanya meliputi membran sel. Rangka dasar dinding sel bakteri adalah lapisan peptidoglikan. Peptidoglikan tersusun dari N-asetil glukosamin dan N-asetil asam muramat, yang terikat melalui ikatan 1,4- glikosida. Pada N-asetil asam muramat terdapat rantai pendek asam amino : alanin, glutamat, diaminopimelat, lisin dan alanin, yang terikat melalui ikatan peptida. Peranan ikatan peptida sangat penting dalam menghubungkan antara rantai satu dengan rantai yang lain. Mekanisme kerusakan dinding sel bakteri terjadi karena proses perakitan dinding sel bakteri yang diawali dengan pembentukan rantai peptida yang akan membentuk jembatan silang peptida yang menggabungkan rantai glikan dari peptidoglikan pada rantai yang lain sehingga menyebabkan dinding sel terakit sempurna. Keadaan ini menyebabkan sel bakteri mudah mengalami lisis, baik berupa fisik maupun osmotik dan menyebabkan kematian sel. S.aureus merupakan bakteri gram positif yang memiliki dinding peptidoglikan yang tebal. Sehingga lebis sensitif terhadap senyawa-senyawa yang punya potensi merusak atau menghambat sintesis dinding sel. Rusaknya dinding sel akan menyebabkan terhambatnya pertumbuhan sel bakteri, dan pada akhirnya bakteri akan mati. Secara umum adanya kerja suatu bahan kimia sebagai zat antibakteri dapat mengakibatkan terjadinya perubahan- perubahan yang mengarah pada kerusakan terhambatnya pertumbuhan sel bakteri tersebut. Diduga kerja alkaloid terlebih dahulu merusak dinding sel dan dilanjutkan kerja flavonoid yang merusak membran sitoplasma sel bakteri (Rijayanti, 2014).

30 Senyawa flavonoid merupakan salah satu senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak daun benalu kopi yang bersifat bakteriostatik. Mekanisme kerjanya dengan cara mendenaturasi protein sel bakteri dan merusak membran sitoplasma. Volk dan Wheeler (1998) dalam Prajitno (2007) menjelaskan bahwa senyawa flavonoid dapat merusak membran sitoplasma yang dapat menyebabkan bocornya metabolit penting dan menginaktifkan sistem enzim bakteri. Kerusakan ini memungkinkan nukleotida dan asam amino merembes keluar dan mencegah masuknya bahan-bahan aktif kedalam sel, keadaan ini dapat menyebabkan kematian bakteri. Pada perusakan membran sitoplasma, ion H + dari senyawa fenol dan turunannya (flavonoid) akan menyerang gugus polar (gugus posfat) sehingga molekul fosfolipida akan terurai menjadi gliserol, asam karboksilat dan asam posfat. Hal ini mengakibatkan fosfolipida tidak mampu mempertahankan bentuk membran sitoplasma akibatnya membran sitoplasma akan bocor dan bakteri akan mengalami hambatan pertumbuhan dan bahkan kematian. Senyawa tanin juga dapat menghambat dan membunuh pertumbuhan bakteri dengan cara bereaksi dengan membran sel. Senyawa tanin termasuk senyawa polifenol, senyawa ini dapat menghambat bakteri dengan cara merusak membran plasma bakteri yang tersusun dari 60 % protein dan 40 % lipid yang umumnya berpa fosfolipid, didalam membran sel tanin akan bereaksi dengan protein membentuk ikatan hidrogen sehingga protein akan terdenaturasi, selain itu tanin juga dapat bereaksi dengan fosfolipid yang terdapat dalam membran sel, akibatnya senyawa tanin akan merusak membran sel, yang menyebabkan bocornya metabolit penting yang menginaktifkan sistem enzim bakteri. Kerusakan pada membran sel dapat mencegah masuknya bahan-bahan makanan atau nutrisi yang diperlukanbakteri untuk menghasilkan energi akibatnya bakteri akan mengalami hambatan pertumbuhan atau bahkan kematian (Volk and Wheller, 1998). Mekanisme terpenoid sebagai antibakteri adalah bereaksi dengan porin (protein transmembran) pada membran luar dinding sel bakteri, membentuk ikatan polimer yang kuat sehingga mengakibatkan rusaknya porin (protein transmembran) (Cowan, 1999).

31 Hasil penelitian uji aktivitas antioksidan dan antibakteri menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan dan antibakteri ekstrak metanol lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etil asetat daun benalu kopi. Hal ini kemungkinan terjadi karena adanya gugus hidroksil dan gula yang terikat pada inti flavonoid yang membuat flavonoid lebih polar sehingga tidak terekstraksi dengan pelarut etil asetat yang menyebabkan ekstrak etil asetat tidak efektif bekerja sebagai antibakteri (Crozier, A, 2006). Kemudian untuk uji aktivitas antioksidan sama halnya dengan uji antibakteri. Dimana Menurut Juniarti (2009), bahwa aktivitas antioksidan berkaitan erat dengan struktur rantai samping dan juga subtitusi pada cincin aromatiknya. Aktivitas peredaman radikal bebas senyawa polifenol diyakini dipengaruhi oleh jumlah dan posisi hidrogen fenolik dalam molekulnya. Dengan demikian aktivitas antioksidan yang lebih tinggi akan dihasilkan pada senyawa fenolik yang mempunyai jumlah gugus hidroksil yang lebih banyak pada inti flavonoidnya. Senyawa fenolik ini mempunyai kemampuan untuk menyumbangkan hidrogen, maka aktivitas antioksidan senyawa fenolik dapat dihasilkan pada reaksi netralisasi radikal bebas yang mengawali proses oksidasi atau pada penghentian reaksi radikal berantai yang terjadi.

32 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan 1. Berdasarkan uji skrining fitokimia ekstrak metanol daun benalu kopi mengandung senyawa alkaloid, flavonoida, terpenoida dan tanin, sedangkan ekstrak etil asetat daun benalu kopi mengandung senyawa alkaloid, flavonoida dan terpenoida. 2. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol dan etil asetat termasuk golongan antioksidan yang sangat kuat dimana kedua ekstrak tersebut memiliki nilai IC50 masing-masing sebesar 16,66 mg/l dan 19,29 mg/l. 3. Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan etil asetat memiliki aktivitas antibakteri dengan kategori sedang pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat 16,96 mm dan 15,2 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat 17,2 mm dan 16,43 mm terhadap bakteri Escherichia coli. 5.2 Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut isolasi dan elusidasi struktur komponen kimia senyawa yang bersifat antioksidan dan antibakteri dari daun benalu kopi (Loranthus parasiticus (L.) Merr.).