BAB II TINJAUAN PUSTAKA. sering (sekitar 80%) terjadi di paru-paru. Penyebabnya adalah suatu basil Grampositif

Transkripsi

1 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tuberkulosis Tuberkulosis, singkatnya TBC, adalah suatu penyakit menular yang paling sering (sekitar 80%) terjadi di paru-paru. Penyebabnya adalah suatu basil Grampositif tahan-asam dengan pertumbuhan sangat lamban, yakni Mycobacterium tuberculosis (dr. Robert Koch, 1882). Gejala TBC antara lain batuk kronik, demam, berkeringat waktu malam, keluhan pernapasan, perasaan letih, malaise, hilang nafsu makan, turunnya berat badan, dan rasa nyeri di bagian dada. Dahak penderita berupa lendir (mucoid), purulent, atau mengandung darah. Setelah terjadi infeksi melalui saluran pernafasan, di dalam gelembung paru (alveoli) berlangsung reaksi peradangan setempat dengan timbulnya benjolan benjolan kecil (tuberkel) (Tjay dan Rahardja, 2002). Pengobatan infeksi kuman tahan asam masih merupakan persoalan dan tantangan dalam bidang kemoterapi. Menurut Zubaidi (2001), faktor yang mempersulit pengobatan ialah : 1. Kurangnya daya tahan hospes terhadap mikobakteria. 2. Kurangnya daya bakterisid obat yang ada. 3. Timbulnya resistensi kuman terhadap obat. 4. Masalah efek samping obat.

2 2.2 Etambutol Hidroklorida (Ditjen POM, 1995) CH 2 OH H CH 3 CH 2 C NHCH 2 CH 2 NH C CH 2 CH 3.2HCl H CH 2 OH Gambar 1. Struktur rumus bangun etambutol (+)-2,2 -(Etilenadiimino)- di-1- butanol dihidroklorida [ ] Rumus Molekul : C 10 H 24 N 2 O 2.2HCl BM : 277,23 Pemerian Kelarutan : Serbuk hablur, putih : Mudah larut dalam air, larut dalam etanol, sukar larut dalam eter dan dalam kloroform Derivat etilendiamin ini berkhasiat spesifik terhadap M. Tuberculosa, tetapi tidak terhadap bakteri lain. Mekanisme kerjanya berdasarkan penghambatan sintesa RNA pada kuman yang sedang membelah, juga menghindarkan terbentuknya mycolic acid pada dinding sel (Tjay dan Rahardja, 2002). Etambutol diabsorbsi dengan baik dari usus. Setelah menelan obat ini 25 mg/kg, kadar puncak obat dalam darah berkisar 2-5 µg/ml yang dicapai dalam waktu 2-4 jam. Lebih kurang 20% dari obat ini diekskresikan dalam tinja dan 50% di urin dalam bentuk utuh. Ekskresi obat ini diperlambat pada penyakit gagal ginjal. Pada meningitis, etambutol dalam cairan serebrospinalis lebih dari 10-40% dari kadarnya di serum (Jawetz, 1998). Masa paruh eliminasinya 3-4 jam. Kadar etambutol dalam eritrosit 1-2 kali kadar dalam plasma. Oleh karena itu eritrosit

3 dapat berperan sebagai depot etambutol yang kemudian melepaskannya sedikit demi sedikit ke dalam plasma (Zubaidi, 2001). Etambutol jarang menimbulkan efek samping. Dosis harian sebesar 15 mg/kgbb menimbulkan efek toksik yang minimal. Pada dosis ini kurang dari 2% penderita akan mengalami efek samping yaitu penurunan ketajaman penglihatan, ruam kulit, dan demam. Efek samping lain ialah pruritis, nyeri sendi, gangguan saluran cerna, malaise, sakit kepala, pening, bingung, dan mungkin juga halusinasi. Rasa kaku dan kesemutan di jari sering terjadi (Zubaidi, 2001). Efek sampingnya yang terpenting adalah neuritis optica (radang saraf mata) yang mengakibatkan gangguan penglihatan, antara lain kurang tajamnya penglihatan dan buta warna terhadap merah hijau. Reaksi toksis ini baru timbul pada dosis besar (di atas 50 mg/kg/hari) dan bersifat reversibel bila pengobatan segera dihentikan, tetapi dapat menimbulkan kebutaan bila pemberian obat dilanjutkan. Sebaiknya, jangan diberikan kepada anak kecil, karena kemungkinan gangguan penglihatan (visus) sulit dideteksi. Dianjurkan untuk memeriksakan mata secara periodik, terutama kepekaannya terhadap warna (Tjay dan Rahardja, 2002). 2.3 Monitoring Terapi Obat Yang dimaksud dengan monitoring kadar terapeutik obat adalah pemeriksaan secara berkala kadar obat dalam darah guna membantu klinisi dalam menetapkan dosis obat yang dapat menyembuhkan atau mengobati penyakit penderita (Muchtar, A.1985).

4 Pemantauan konsentrasi obat dalam darah atau plasma meyakinkan bahwa dosis yang telah diperhitungkan benar-benar telah melepaskan obat dalam plasma dalam kadar yang diperlukan untuk efek terapetik. Untuk beberapa obat, kepekaan reseptor pada individu berbeda, sehingga pemantauan kadar obat dalam plasma diperlukan untuk membedakan penderita yang menerima terlalu banyak obat dan penderita yang sangat peka terhadap obat (Shargel, 1988). Tujuan dari proses pemantauan terapi obat adalah menyesuaikan terapi obat pada karakteristik pasien individu, memaksimalkan manfaat dan meminimalkan risiko. Respon terhadap terapi obat adalah suatu fenomena yang kompleks dan dipengaruhi oleh obat yang digunakan pasien yang diterimanya dari dokter yang menulisnya. Sifat-sifat biofarmasi, farmakologi, dan farmakokinetik sangat penting dipertimbangkan. Sekarang ini, telah diterima bahwa ada rentang konsentrasi plasma optimal yang di dalamnya diharapkan efek terapi dapat terjadi pada kebanyakan pasien yang menerima obat tertentu. Jika konsentrasi plasma melewati rentang terapi optimal tersebut, suatu konsentrasi toksik minimal tercapai yang pada konsentrasi itu efek samping atau toksik yang tidak diinginkan dapat berkembang secara klinik pada kebanyakan pasien (Siregar dan Endang, 2004). Berbagai sifat farmakokinetik seperti absorpsi, distribusi, metabolisme, ekskresi, dan durasi kerja harus dipertimbangkan apabila mendesain suatu regimen obat (Siregar dan Endang, 2004). Faktor pasien seperti umur, kelamin, bobot tubuh, penyakit, fungsi ginjal dan hati, kehamilan, status mental serta sikap terhadap penyakit, semuanya

5 merupakan variabel penting untuk dipertimbangkan dalam menyeleksi terapi obat dan pemantauan respon pasien (Siregar dan Endang, 2004). Status penyakit pasien merupakan faktor penting lain untuk dipertimbangkan, apabila memantau terapi. Misalnya, adalah penting untuk memantau konsentrasi plasma secara berhati hati pada pasien dengan penyakit ginjal dan mengadakan penyesuaian dosis yang tepat (Siregar, dan Endang, 2004). Pemantauan konsentrasi obat dalam plasma memungkinkan untuk penyesuaian dosis obat secara individual dan juga untuk mengoptimasi terapi. Dengan adanya perubahan fungsi fisiologik sehubungan dengan penyakit, pemantauan konsentrasi obat dalam plasma dapat memberikan petunjuk untuk kemajuan keadaan penyakit dan memungkinkan peneliti mengubah dosis obat yang lebih sesuai. Namun demikian, secara klinik keputusan dan pengamatan medik adalah paling penting sebagai keputusan terapi dan jangan semata mata didasarkan pada konsentrasi obat dalam plasma (Shargel, 1988). 2.4 Darah dan Plasma Darah merupakan suatu cairan yang sangat penting bagi manusia karena berfungsi sebagai alat transportasi serta memiliki banyak kegunaan lainnya untuk menunjang kehidupan. Tanpa darah yang cukup seseorang dapat mengalami gangguan kesehatan dan bahkan dapat mengakibatkan kematian. Darah pada tubuh manusia mengandung 55% plasma darah (cairan darah) dan 45% sel-sel darah (darah padat). Jumlah darah yang ada pada tubuh kita yaitu sekitar sepertigabelas berat tubuh orang dewasa atau sekitar 4 atau 5 liter (Anonim b, 2009).

6 Plasma darah merupakan bagian cair darah. Cairan ini didapat dengan membuat darah tidak beku dan sel darah disentrifugasi. Serum darah adalah cairan bening yang memisah setelah darah dibekukan (Mutschler, 1999). Darah cair atau plasma darah adalah cairan darah berbentuk butiranbutiran darah. Di dalamnya terkandung benang-benang fibrin/fibrinogen yang berguna untuk menutup luka yang terbuka. Menurut anonim b (2009), isi kandungan plasma darah manusia: 1. Gas oksigen, nitrogen dan karbondioksida. 2. Protein seperti fibrinogen, albumin dan globulin. 3. Enzim. 4. Antibodi. 5. Hormon. 6. Urea. 7. Asam urat. 8. Sari makanan dan mineral seperti glukosa, gliserin, asam lemak, asam amino, kolesterol. Protein-protein plasma dapat dipisahkan pada ultrasentrifuge atau dengan elektroforesis menjadi albumin; alfa, beta, dan gama globulin; dan fibrinogen. Albumin adalah komponen utama dan mempunyai peranan utama mempertahankan tekanan osmotik darah. Gama globulin adalah antibodi dan dinamakan imunoglobulin. Fibrinogen diperlukan untuk pembentukan fibrin dalam langkah terakhir pembekuan (Junqueira dan Carneiro, 1982).

7 2.5 Kromatografi Kromatografi didefenisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion. Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, sehingga zat tersebut terpisah dari zat terlarut lain, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen (Ditjen POM, 1995). Berdasarkan fase gerak, yang dapat berupa zat cair atau gas, kita dapat menggolongkan kromatografi menjadi kromatografi cair (KC) dan kromatografi gas (KG). Berdasarkan fase diam, yang dapat berupa zat cair atau zat padat, kita dapat menggolongkan kromatografi menjadi kromatografi partisi dan kromatografi jerap (Gritter, 1991). Menurut Gandjar, (2007), kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung atas pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi: 1. Kromatografi adsorbsi 2. Kromatografi partisi 3. Kromatografi pasangan ion 4. Kromatografi penukar ion

8 5. Kromatogarfi eksklusi ukuran 6. Kromatografi afinitas Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: 1. Kromatografi kertas 2. Kromatografi lapis tipis 3. Kromatografi cair kinerja tinggi 4. Kromatografi gas Pemakaian Kromatografi Menurut Gritter (1991), pemakaian kromatografi ada tiga yaitu : 1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu dalam cuplikan 2. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran 3. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni Puncak Asimetri Baik tailing maupun fronting tidak dikehendaki karena dapat menyebabkan pemisahan kurang baik dan data retensi kurang reprodusibel (Gandjar, 2007). Menurut Gandjar, (2007), adanya puncak, yang asimetri dapat disebabkan oleh hal-hal berikut: 1. Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka fase gerak tidak mampu membawa solut dengan sempurna karenanya akan terjadi pengekoran atau tailing.

9 2. Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor. 3. Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting). Untuk menentukan tingkat asimetri puncak dilakukan dengan menghitung faktor asimetri atau disebut juga dengan tailing factor (TF) yang dinyatakan dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak. Kromatogram yang memberikan harga TF =1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris. Harga TF > 1 menunjukkan bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar,2007). Suatu ukuran alternatif (yang tergantung pada panjang kolom kromatografi) adalah tinggi lempeng (H) atau juga biasa disebut dengan tinggi setara pelat teori (HETP=Height Equivalent Theoritical Plate). Tinggi setara pelat teori atau HETP dalam kromatografi yang menggunakan kolom (KCKT dan KG) merupakan panjang kolom kromatografi (dalam mm) yang diperlukan sampai terjadinya satu kali keseimbangan molekul solut dalam fase gerak dan fase diam. Kolom yang memberikan jumlah lempeng (N) yang besar dan nilai HETP yang kecil akan mampu memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran yang lebih baik yang berarti bahwa efisiensi kolom adalah besar (Gandjar, 2007).

10 2.6 Kromatogarafi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal 1970-an. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asamasam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produkproduk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintetis (Gandjar, 2007) Cara Kerja KCKT Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel (Gandjar, 2007). Sistem kromatografi dijalankan dengan cara sebagai berikut. Fase gerak didorong melalui kolom dengan tekanan yang dikehendaki dengan laju sesuai dengan yang diinginkan. Setelah sistem mencapai kesetimbangan, cuplikan yang dilarutkan di dalam pelarut yang cocok disuntikkan ke dalam sistem, biasanya

11 melalui katup. Linarut terbawa ke dalam kolom, dipisahkan, dan keluar dalam efluen melalui detektor (Gritter, 1991). Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya, jadi memastikan kesetimbangan yang baik antara fase. Persyaratan kedua agar pemisahan baik ialah fase gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada sebagian besar situasi kromatografi, maka penyerap atau penyangga berupa serbuk halus. Untuk memaksa fase gerak bergerak cepat melalui fase diam yang terbagi pada serbuk halus harus digunakan tekanan tinggi (Gritter, 1991) Komponen KCKT Wadah Fase Gerak pada KCKT Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. (Gandjar, 2007).

12 Fase Gerak pada KCKT Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Untuk fase normal (fase diam lebih polar darpada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Gandjar, 2007). Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu peubah yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua ragam KCKT, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang berlaku umum. Menurut Edward dan Stevenson, (1991), fase gerak haruslah: a. Murni, tanpa cemaran. b. Tidak bereaksi dengan kemasan. c. Sesuai dengan detektor. d. Dapat melarutkan cuplikan. e. Mempunyai viskositas yang rendah. f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan. g. Harganya wajar. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril (Gandjar, 2007).

13 Pompa pada KCKT Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang dgunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/ menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 ml/menit (Gandjar, 2007). Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan (Gandjar, 2007) Injektor Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mugkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Menurut Edward dan Stevenson (1991), ada tiga ragam utama injektor: a. Aliran henti: aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer; sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya sistem aliran utama tetap berada pada tekanan kerja). Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi. b. Septum: ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tesebut dapat

14 dipakai pada tekanan sampai atmosfer. Sayang sekali, septum tidak dapat dipakai untuk semua pelarut KC. Selain itu, partikel kecil terlepas dari septum dan cenderung menyumbat. c. Katup jalan-kitar: jenis injektor ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum yang lebih besar dari 10 µl dan sekarang dipakai dalam sistem yang diotomatkan. (Volum yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual memakai adaptor khusus). Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi pada tekanan atmosfer. Jika katup dijalankan (dibuka), cuplikan di dalam jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom Kolom Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut Edward dan Stevenson (1991), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok: a. Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya cm. b. Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang cm Fase Diam pada KCKT Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil

15 benzen. Oktadesil silika (ODS atau C 18 ) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar, 2007) Detektor Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam efluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis senyawa. Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair kecepatan tinggi modern (KCKT) ialah detektor UV 254 nm (Edward dan Stevenson, 1991). Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Menurut Gandjar (2007), idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel 2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil 3. Stabil dalam pengoperasiannya 4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

16 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas 6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak Elusi Gradien dan Isokratik Menurut Putra (2007), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu: 1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi). 2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu analisis kromatografi berlangsung. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat ditahan di dalam kolom.