EFISIENSI KOLOM. Bentuk-bentuk kromatogram

Transkripsi

1 EFISIENSI KOLOM Pertemuan 3 Bentuk-bentuk kromatogram - Linier (simetris, bentuk gaus), ideal (puncak sempit) - Tidak linier dan tidak ideal C S C S C S K = C S /C m K > C K < CS /C S /C m m C m C m C m 1

2 C S C S C S K = C S /C m K > C K < C S /C S /C m m C m C m Isoterm ideal isoterm konveks Isoterm Konkaf C m Simetris peak tailing peak leading (overload) Faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom Difusi Eddy (A) Difusi longitudinal (B/V) Transfer massa (CV) Pers. Van Deemter: HETP = A + B/V + CV 4 2

3 Persamaan Van Deemter: Suku A dp = diameter partikel isis kolom λ = faktor geometri (keseragaman partikel) 3

4 1. Faktor Difusi Eddy Packing kolom tidak seragam, jalur yang dilalui analit berbeda, sampai di ujung kolom dalam waktu yang berbeda 7 Suku B/V (difusi longitudinal) Dg = koef difusi analit pada fasa pembawa (gas) = 10 5 D L 4

5 2. Faktor Difusi Longitudinal Arah aliran fasa gerak berbeda dengan arah aliran (gas) 9 Suku C.V (efek perpindahan massa) diabaikan k = faktor kapasitas d f = tebal lapisan cairan fasa diam D l = koef difusi komponen dalam fasa diam ω = tetapan gas Dp = diameter partikel isi kolom D g = koef difusi komponen dalam fasa gerak 5

6 3. Faktor Efek perpindahan massa Analit yang ada di pusat aliran bergerak lebih cepat dibandingkan dengan analit di dekat dinding kolom 11 Distribusi Ideal Distribusi tidak ideal Fasa gerak Fasa diam 12 6

7 Grafik Van Deemter HETP H min V optimal V, Laju Laju alir operasional : 2 Vopt 13 Berilah penjelasan: Makna dari grafik Van Deemter: Suku A? Suku B Suku C Kondisi optimum? 7

8 Mengapa kolom dapat memisahkan campuran komponen? Karena perbedaan interaksi komponen-komponen dengan kolom/fasa diam Komponen 2 keluar dari kolom Dalam waktu yang berbeda-beda Waktu retensi (tr) Berbeda-beda pula 15 Prinsip Pemisahan Perbedaan distribusi komponen diantara fasa gerak dan fasa diam yang menyebabkan perbedaan migrasi diferensial komponen-komponen analit dalam kolom kromatografi Kemampuan kolom untuk membedakan suatu komponen dari komponen lain Selektivitas kolom dasar Perbedaan k` Faktor selektivitas, 16 8

9 1. Faktor Selektivitas ( ) K K 2 1 K adalah Koef partisi komponen 1 dan 2 t ' r2 t ' r1 t r(2) t r(1) t r(0) t r(0) Untuk Pemisahan: >>1 17 Apakah parameter menjamin pemisahan sempurna?? I 3,2 4,5 T 0 = 0,99 Tr, menit : menjamin pemisahan bagian atas kromatogram (puncak) Tidak memperhitungkan overlap puncakpuncak Parameter lain : R (resolusi) 18 9

10 1 2 w 2. Resolusi (Rs) Rs 2( t ( w t 1 2 r(2) 1 r(2) ( w 1 t w r(1) 2 ) t r(1) w 2 ) W = lebar puncak 19 W 1/2 w Rs 2( t 1,699( w r(2) 1/ 2(1) t r(1) w ) 1/ 2(2) ) Rs ideal = 1,25 (97,5% terpisah) 20 10

11 Cara lain menghitung Rs : memperhitungkan selektivitas efisiensi faktor kapasitas 1 k` 1 R ( )( ) 4 1 k` N Faktor kapasitas Faktor selektivitas Faktor efisiensi 21 INSTRUMENTASI HPLC 22 11

12 KCKT Teknik untuk pemisahan dan analisis zat yang sukar dipisahkan dan termolabil Teknik untuk kontrol ketakmurnian Eluat dikumpulkan detektor Tempatelue n pompa injektor kolom rekorder Diagram blok alat KCKT 23 GAMBAR HPLC 24 12

13 1. Tempat eluen/pelarut Botol terbuat dari bahan yang bereaksi dgn pelarut (gelas) Dilengkapi dgn penyaring (stainless steel) Pipa kecil polietilen eluen harus di degassing Eluen harus disaring dengan saringan Pompa eluen Gambar Pompa Gunanya memompa eluen ke dalam kolom Terbuat dari stainless steel/teflon Seals terbuat dari mas atau teflon/grafit Tekanan sampai 400 bar Memberikan laju alir sampai 5 ml/menit Tidak memberikan pulsa 26 13

14 Spesifikasi pompa yang baik: Repeatability (keberulangan) Presisi jangka pendek (short term precision) Noise pompa (menyebabkan pulsa) karena gerakan piston dan check valve Drift (perubahan kecepatan alir pompa 3. Injektor karena waktu alir lama) Valve Injektor Syringe injection 27 Syarat injektor: dapat memasukkan contoh ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin untuk menghindari pelebaran puncak Mudah digunakan Keberulangan tinggi Dapat bekerja meskipun ada tekanan balik 4. Kolom tinggi Gambar kolom 28 14

15 Kolom yang baik bahan kolom kuat dan tidak mudah berkarat partikel Isi kolom berdiameter kecil (5 10 m), ukuran seragam, bulat, berpori Efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<) Tahan terhadap tekanan tinggi Menghasilkan puncak simetri dan sempit 29 Karakteristik packing kolom untuk kromatografi 30 15

16 Jenis kolom 1. Kolom polar : silika, amina 2. Kolom non polar : C-8, C-18 silika C-18 yang terikat silika Si O O Si Si O O H Struktur fasa Si diam Osilika Si Si Struktur fasa diam C-18 terikat pada silika O O Si R R Detektor Syarat detektor Tingkat noise dan drift rendah Sensitivitas tinggi respons cepat Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir pelarut dan temperatur mudah pengoperasiannya awet Detektor dalam KCKT detektor spektrofotometrik (UV/VIS) detektor fluoresensi Detektor indeksrefraksi (Optis) Detektor elektrokimia 32 16

17 Berdasarkan jenis kolom dan eluen : 1. Kromatografi fasa terbalik : Fasa diam lebih nonpolar dari fasa gerak 2. Kromatografi fasa normal : Fasa diam lebih polar dari fasa gerak Pemeliharaan kolom 1. Saring eluen dgn saringan membran 2. Hindari pengaliran eluen ke dalam kolom dari arah yang sebaliknya 3. Gunakan kolom pengaman (column guard) 4. Simpan kolom dalam pelarut yang sesuai jika tidak digunakan (kolom polar dalam metanol, kolom nonpolar dalam kloroform) 5. Jangan sampai kolom jatuh 6. Jangan menggunakan eluen yang terlalu asam 7. Cuci kolom sesudah digunakan. 8. Lakukan regenerasi kolom sesuai prosedur 33 Trouble shoot Trouble Shoot 1. Pompa berhenti/tekanan tinggi Alat Hasil pengukuran Saring kembali fasa gerak Periksa saringan fasa gerak Periksa ujung-ujung kolom periksa klep pompa (harus dgn ahlinya.) Bersihkan kolom dengan laju alir minimal ganti kolom Penanggulangan 2. Keberulangan injeksi rendah Cuci kolom Uji keberulangan pompa Periksa detektor 3. Puncak tidak terpisah Perlambat laju alir Ubah komposisi fasa gerak Ganti fasa gerak Ganti kolom 4. Puncak terlalu lebar dan tr >> - Percepat laju alir 34 17

18 TIPE-TIPE PUNCAK KROMATOGRAM 35 TIPE-TIPE KROMATOGRAM 36 18

19 Soal resolusi: 1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui terdiri dari senyawa A dan B, diperoleh data sbb: tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menit W(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit. Hitung Resolusi dan faktor pemisahannya Soal efisiensi kolom: Komponen x terelusi dalam KCKT dengan data sbb: t r (x) = 21,5 menit, W = 4,1 menit, W 1/2 = 1,85 menit, t o = 0,95 menit. Hitung N, HETP, dan Faktor kapasitas, bila elusi dilakukan dalam kolom 12,5 cm 37 Analisis kualitatif -Agak sukar dilakukan terutama bila dalam campuran -Dapat dilakukan bila pemisahan baik dan tidak ada interferensi -Dasar: membandingkan waktu retensi analit dengan standar -Kondisi elusi analit harus sesuai dengan kondisi standar - Kesulitan: sukar menemukan standar 38 19

20 Analisis Kuantitatif Tahapan kerja: *Penyiapan fasa gerak : Pelarutan, pencampuran, penyaringan, degasing *Preparasi sampel : Pemisahan dgn ekstraksi Pengenceran/pelarutan ekstrak penyaringan/degasing *Penyiapan larutan standar : Induk : larutan 1000 ppm pengenceran dengan fasa gerak. pembuatan larutan kerja: 39 *Pengukuran sampel *Penentuan konsentrasi sebenarnya analit dalam sampel Pengukuran sampel: -Teknik membandingkan area standar dengan area analit Area standar = A s, konsentrasi = Cs Area analit = Ac, konsentrasi analit = Cc As/Ac = Cs/Cc 40 20

21 - Teknik kurva kalibrasi Dibuat beberapa seri larutan standar, dari konsentrasi kecil sampai besar ( minimal 4 larutan standar) Dibuat larutan sampel sedemikian sehingga area berada dalam range konsentrasi standar Larutan standar diinjeksikan mulai dari konsentrasi kecil Larutan sampel diinjeksikan Plot Area sampel dalam kurva kalibrasi Area (C vs area standar) * * * * * C, ppm Cx 41 Teknik analisis kuantitatif dengan kalibrasi adisi standar Untuk mendekatkan kondisi sampel dengan kondisi larutan standar Caranya: ke dalam sejumlah larutan standar (seri) ditambahkan sejumlah yang sama sampel, kemudian diperlakukan sesuai prosedur seperti pada cara kalibrasi biasa Area * * * * * Cx C, ppm 42 21

22 Parasetamol adalah obat analgesik dan antipretik yang biasanya dikemas dalam bentuk cair untuk konsumsi anak-anak. Selain parasetamol sebagai zat aktif, biasanya dalam kemasan tersebut ditambahkan aditif gula dan etanol dalam jumlah sedikit selain air sebagai pelarut. OH HN C = O CH3 43 Bila senyawa parasetamol akan dianalisis dengan HPLC, teknik mana yang akan dipilih, a. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak metanol/air b. RPLC dengan fasa diam C-18 dan fasa gerak n- heksana/air c. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak n- heksana d. NPLC dengan fasa diam silika dan fasa gerak kloroform Detektor apa yang dapat digunakan dalam analisis ini? Bagaimana gambaran kromatogram yang akan dihasilkan? 44 22

23 45 23