BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Materi Penelitian Sampel isolat lokal Campylobacter jejuni Hewan percobaan

Transkripsi

1 26 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung dari bulan April 2010 sampai dengan Juli 2011 di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (FKH IPB) dan fasilitas kandang Unit Pengembangan, Pemeliharaan dan Pelayanan Hewan (UP3H) FKH IPB. Materi Penelitian Sampel isolat lokal Campylobacter jejuni Isolat lokal C. jejuni berasal dari daging ayam yang dijual di pasar swalayan atau super market dan pasar tradisional di wilayah Kabupaten Demak dan Kudus. Hewan percobaan Penelitian ini menggunakan ayam broiler strain Cobb berumur 1 hari sebanyak 140 ekor yang dipelihara selama 21 hari. Ayam dibagi menjadi dua kelompok besar yaitu kelompok yang di infeksi dengan isolat C. jejuni asal Kudus dan kelompok di infeksi dengan isolat C. jejuni asal Demak. Masing-masing kelompok besar dibagi menjadi tujuh kelompok yang terdiri dari kontrol positif (+) dengan perlakuan di infeksi C. jejuni 10 4 CFU/ml tanpa pengobatan, kontrol negatif (-) tanpa perlakuan apapun, dan lima kelompok yang di infeksi C. jejuni dan masing-masing diobati menggunakan lima jenis antimikroba (amoksisilin, tetrasiklin, kloramfenikol, eritromisin dan siprofloksasin).

2 27 Tabel 3 Pengelompokkan sampel uji resistensi Asal Isolat Isolat asal Demak Isolat asal Kudus Kontrol + (positif) Campylobacter jejuni Kontrol + (positif) Campylobacter jejuni Kontrol (negatif) Aquadest Kontrol (negatif) Aquadest ND1 N1-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) NK1 N1-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) ND2 N2-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) NK2 N2-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) ND3 N3-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) NK3 N3-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) ND4 N4-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) NK4 N4-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) ND5 N5-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) NK5 N5-I (Amx, Tet, Clr, Ert, Cip) Media Media yang digunakan antara lain nutrient broth No.2 (Oxoid CM67), brain heart infusion broth (Bacto), buffered pepton water/bpw 0,1 % (Pronadisa), charcoal cefaphorazone deoxychilate agar/ccda (Oxoid CM739), preston (SR117), growth supplement (SR232), CCDA selective suplement (SR155), Campylobacter jejuni ATCC 33291, Campygen (Oxoid CN0025A), blood agar base No.2 (CM271B), dan API-Ca Campy (Bio Mèrieux, 20800), Mueller Hinton agar (Oxoid CM0337), NaCl fisiologis, alkohol 70%, aquades steril, fuchsin Ziehl, minyak emersi, mineral oil, H 2 O 2 3% dan Bactident Oxidase (Merck ). Isolat lokal C. jejuni yang digunakan adalah isolat dari Demak dan Kudus. Uji resistensi menggunakan bahan antara lain kertas cakram antimikroba, amoksisilin 20 µg (Oxoid CT0425B), tetrasiklin 30 µg (Oxoid CT0054B), amoksisilin 25 µg (Oxoid CT0061B), eritromisin 15 µg (Oxoid CT0020B), dan siprofloksasin 5 µg (Oxoid CT0425B), serta antimikroba sediaan serbuk (amoksisilin, tetrasiklin, kloramfenikol, eritromisin, dan siprofloksasin). Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap yang melibatkan proses secara in vitro dan in vivo. Tahap pertama meliputi : 1) isolasi, 2) identifikasi, dan 3) uji resisten in vitro. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk untuk mengetahui pola resistensi C.

3 28 jejuni dan mendapatkan dosis Minimal Inhibitory Concentration (MIC) yang akan digunakan untuk pengobatan hewan coba pada penelitian tahap kedua. Tahap kedua meliputi : 1) pemeliharaan ayam, 2) infeksi ayam dengan bakteri Campylobacter jejuni (isolat lokal dari Demak dan Kudus) secara oral dengan sebanyak 1 ml (10 4 CFU/ml), 3) pengobatan ayam menggunakan lima jenis antimikroba (amoksisilin, tetrasiklin, kloramfenikol, eritromisin, dan siprofloksasin), 4) isolasi dan identifikasi Campylobacter jejuni dari usapan (swab) mukosa usus ayam setelah pengobatan dan, 5) evaluasi hasil pengobatan terhadap rasio peningkatan bobot badan. Tahapan kedua bertujuan untuk mengevaluasi dosis MIC yang digunakan setelah hewan coba di infeksi C. jejuni sebanyak 10 4 CFU/ml dan mendapatkan jenis antimikroba yang tepat untuk mengurangi kerugian akibat kampilobakteriosis. Isolasi dan Identifikasi Campylobacter jejuni Campylobacter jejuni diisolasi dari bahan pangan asal hewan yakni daging ayam. Pengambilan bahan pangan dilakukan pada berbagai tempat seperti pasar tradisional dan supermarket. a. Sampel daging ayam 1) Daging sebanyak 25 gram dipotong-potong kemudian di masukan dalam kantong steril yang sebelumnya dimasukan BPW 0,1 % (Buffered Pepton Water) sebanyak 50 ml kemudian di kocok selama 5 menit kemudian ekstrak dituang ke dalam tabung sentrifuse. 2) Kemudian ekstrak di sentrifuse dengan kecepatan 9000 rpm selama 12 menit pada suhu 4 C, endapan diambil kemudian ditambahkan nutrient broth dan di inkubasi selama jam dalam kondisi mikroaerofilik (CampyPack) pada suhu 42 C dengan menggunakan anaerobic jar. Setelah di inkubasi selama jam dilakukan strik ke selektif agar Charcoal-cefoperazone-deoxycholate-agar (CCDA), kemudian diinkubasi kembali seperti proses sebelumnya. 3) Setelah proses inkubasi selesai maka dilakukan identifikasi melalui beberapa tahap yaitu : morfologi koloni, pewarnaan fuchsin Ziehl, uji oksidase dan uji katalase.

4 29 4) Pengamatan terhadap koloni dengan penampakan sebagai berikut : berwarna keabu-abuan, datar, pinggir tidak teratur, mengkilat dan menyebar. 5) Pewarnaan gram dilakukan dengan fuchsin, kemudian diamati menggunakan mikroskop terhadap koloni dengan bentuk batang bengkok menyerupai wing shape berwarna merah muda. 6) Pengujian selanjutnya dilakukan dengan uji oksidase dan uji katalase yang akan diperoleh hasil uji dalam Tabel 4. 7) Selanjutnya dilakukan uji API Campy yang membutuhkan koloni tunggal dalam jumlah cukup banyak dari bakteri yang di identifikasi. Koloni diperbanyak dengan cara menanam 1 loop koloni yang diduga C. jejuni ke media agar darah dengan teknik goresan langsung. Kemudian diinkubasi pada suhu 36 ± 2 0 C selama jam dalam kondisi mikroaerofilik. Uji API-Campy dimulai dengan membuat suspensi bakteri dari koloni tunggal sampai setara dengan kekeruhan Mc. Farland No. 6. Suspensi ini dipindahkan kedalam mikrotube pada strip-strip API-Campy dan diinkubasi pada suhu 36 ± 2 0 C selama 24 dalam kondisi mikroaerofilik untuk setengah strip dan kondisi aerob untuk setengah strip yang lainnya. Setelah diinkubasi, diuji dengan reagen-reagen yang sudah tersedia untuk membuktikan bahwa isolat tersebut adalah C. jejuni. Diagram alir proses uji API-Campy dapat dilihat pada Lampiran. Tabel 4 Hasil Pengujian oksidase, katalase dan API-Campy untuk identifikasi C. jejuni/coli Pengujian C. jejuni C. coli Oksidase Positif Positif Katalase Hippurate Positif Positif Positif Negatif b. Sampel Swab 1) Swab mukosa usus dilakukan dengan bantuan cotton bud steril kemudian dimasukkan dalam Nutrient broth sebanyak 5 ml yang kemudian diinkubasi

5 30 dengan kondisi mikroaerofilik menggunakan anaerobic jar dan CampyPack pada suhu 42 C selama jam. Setelah diinkubasi selama jam dilakukan strik ke selektif agar Charcoal-cefoperazone-deoxycholate-agar (CCDA), kemudian diinkubasi kembali seperti proses sebelumnya. 2) Selanjutnya dilakukan identifikasi dengan tahapan dan proses yang sama seperti penjelasan sebelumnya. Uji Resistensi Antimikroba (Lalitha 2008, NCCLS 1997) Uji resistensi Antimikroba dilakukan dengan dua metode yaitu agar difusi dan pengenceran. Metode agar difusi menggunakan kertas cakram dengan lima jenis antimikroba (amoksisilin 20 µg, tetrasiklin 30 µg, amoksisillin 25 µg, eritromisin 15 µg dan siprofloksasin 5 µg) untuk mengetahui diameter zona hambat antimikroba terhadap pertumbuhan bakteri. Cakram yang digunakan berdiameter 6 mm. Prosedur uji dapat dijelaskan sebagai berikut : a. Preparasi Mueller Hinton Agar 1) Penyiapan agar dilakukan dengan melarutkan 34 g/l dengan aquades dalam penangas air. Kemudian dilakukan dengan kondisi mild autoclave (10 menit dalam suhu 115 C). 2) Setelah proses autoclave agar didinginkan pada suhu C dalam penangas air. 3) Tuangkan agar yang telah dipersiapkan ke dalam cawan petri plastik atau gelas dengan ketebalan agar 4 mm, apabila menggunakan cawan petri berdiameter 150 mm membutuhkan 60 sampai 70 ml agar sedangkan apabila menggunakan cawan petri berdiameter 100 mm membutuhkan 25 sampai 30 ml agar. 4) Medium agar diletakkan pada suhu ruang, jika tidak digunakan pada hari yang sama medium agar dapat diletakkan pada refrigerator (2 8 C). 5) Medium harus digunakan dalam tujuh hari setelah proses persiapan dengan penyimpanan dibungkus plastik.

6 31 6) Untuk membuktikan sterilitas media dapat dilakukan pengujian dengan menginkubasikan media dalam suhu C dalam 24 jam. b. Preparasi antimikroba Antimikroba yang digunakan dalam bentuk serbuk. Antimikroba dapat digunakan dari produk komersil. Serbuk antimikroba yang digunakan dilarutkan dengan pelarut yang cocok untuk mendapatkan konsentrasi yang dibutuhkan dengan menggunakan gelas steril. Potensi antimikroba bisa tertera di produk sediaan murni dan dapat dicari menggunakan rumus : P = kandungan aktif / berat sediaan Larutan antimikroba dipersiapkan dengan menggunakan rumus : W = (1000/P) x V x C Keterangan P = Potensi obat, V = Volume yang dibutuhkan (ml), C = Konsentrasi akhir yang akan digunakan dan W = Berat antimikroba yang akan dilarutkan (mg) c. Preparasi kertas cakram Kertas cakram yang digunakan adalah kertas saring no. 1 dengan diameter 6 mm yang diletakkan pada petri disc dan disterilkan dengan oven. Antimikroba yang akan digunakan diteteskan sengan bantuan pipet ependorf sebanyak 0,005 ml pada setiap cakramnya. Kertas cakram yang ada di pasaran telah mengandung antimikroba dapat digunakan dalam uji ini. d. Preparasi inokulum Inokulum yang terbaik diambil dari media agar kemudian ditumbuhkan terlebih dahulu medium yang digunakan adalah Nutrient Broth untuk Campylobacter jejuni dengan jumlah 4 5 ml dalam tabung. Kultur broth kemudian di inkubasi dalam kondisi mikroaerofilik dengan suhu 42 C selama 24 jam. Kemudian dilakukan pengamatan terhadap jumlah Campylobacter jejuni yang tumbuh dengan menggunakan spektrofotometer atau menggunakan standar McFarland 1 yang setara

7 32 dengan 3 x 10 8 penambahan media Broth. CFU/ml. Penyesuaian jumlah koloni dapat dilakukan dengan Penentuan Minimal Inhibitory Concentration (MIC) dan Minimal Bactericidal Concentration (MBC) Penentuan MIC dan MBC menggunakan metode Broth dilution. Pada pengujian ini digunakan 5 jenis antimikroba. Prosedur uji dijelaskan sebagai berikut : a. Pengenceran antimikroba Pada penelitian ini digunakan 5 jenis antimikroba. Uji dilakukan dengan berbagai tingkat konsentrasi antimikroba mulai dari 320 hingga mg/l (320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0,675). Sebelum pengenceran bertingkat dilakukan penyiapan larutan stok dengan konsentrasi 320 mg/l untuk masing-masing jenis antimikroba. Pengenceran dilakukan dalam tabung reaksi sebanyak 10 buah menggunakan nutrient broth no. 2, ditambah dengan 2 tabung yang terdiri dari satu tabung reaksi sebagai kontrol positif (tanpa pemberian Campylobacter jejuni) dan satu tabung reaksi sebagai kontrol negatif (tanpa pemberian antimikroba). Skema pengenceran dijelaskan dalam gambar berikut: Buang 1 ml 2 ml 320 mg/l 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml pengencer K (+) K (-) Gambar 3 Skema pengenceran antimikroba b. Pembacaan hasil MIC adalah pengenceran terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang dapat langsung diamati setelah menginkubasi Campylobacter jejuni dengan mengamati pertumbuhannya berdasarkan kekeruhan dan sedimen yang

8 33 dihasilkan, sedangkan MBC adalah pengenceran tertinggi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Penentuan MBC dapat dibuktikan dengan penambahan waktu inkubasi 1 x 24/48 jam untuk pengamatan pertumbuhan mikroba pada tabung. Uji Efektifitas Pengobatan Terhadap Hewan (in vivo) Setelah dilakukan pengujian resistensi antimikroba secara in vitro maka dilanjutkan pengujian efektifitas pengobatan 5 jenis antimikroba terhadap infeksi Campylobacter jejuni pada ayam broiler. Pengujian ini meliputi beberapa tahap yaitu ; 1) Pemeliharaan ayam broiler, 2) Infeksi Campylobacter jejuni, 3) Pengamatan gejala klinis yang timbul pasca infeksi, 4) Pengobatan terhadap ayam terinfeksi, 5) Evaluasi hasil pengobatan. Data yang diperoleh berupa data primer berbentuk kualitatif dan kuantitatif terhadap efektifitas pengobatan 5 jenis antimikroba terhadap infeksi Campylobacter jejuni. Tahapan uji ini dijelaskan sebagai berikut : 1. Pemeliharaan ayam broiler Jenis ayam yang digunakan adalah ayam broiler strain Cobb. Kelompok uji akan dibagi menjadi 7 kelompok yaitu : 5 kelompok sesuai dengan jenis antimikroba yang digunakan, 1 kelompok sebagai kontrol positif infeksi tanpa pengobatan dan 1 kelompok sebagai kontrol negatif tanpa perlakuan. Masing-masing kelompok berjumlah 10 ekor. Pengujian dilakukan menggunakan dua isolat C. jejuni (isolat asal Demak dan isolat asal Kudus) sehingga kebutuhan hewan coba (ayam) untuk pengujian masing-masing isolat sejumlah 70 ekor sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang dibutuhkan adalah 140 ekor. Ayam dipelihara mulai DOC di fasilitas kandang UP3H FKH IPB dan rencana vaksinasi yang akan dilakukan meliputi 2 jenis vaksin yaitu ND dan IB jenis penyakit ini endemis dan bersifat umum disekitar Bogor. Untuk meminimalkan infeksi bakteri maka dilakukan water treatment terhadap air minum dengan menggunakan Benzalkonium Chloride atau BKC dengan nama dagang Destan. Treatment lain adalah pemberian multivitamin dan mineral untuk menjaga kondisi tubuh ayam tetap sehat.

9 34 2. Infeksi Campylobacter jejuni Infeksi Campylobacter jejuni dilakukan pada umur 10 hari dengan cara dicekok atau peroral. Konsentrasi Campylobacter jejuni yang di infeksi ke hewan coba sebanyak 10 4 CFU/ml yang ditambahkan larutan BPW 0.1 %. Gejala klinis akan nampak setelah waktu inkubasi sekitar 2 sampai 5 hari pasca infeksi. Satu hari sebelum dilakukan infeksi terhadap ayam Perlakuan air minum menggunakan desinfektan dihentikan. 3. Pengamatan gejala klinis yang timbul pasca infeksi Gejala klinis yang tampak akan diamati dan dilakukan pencatatan setiap hari selama 9 hari setelah infeksi. Gejala yang diamati berupa diare, kelemahan umum, penurunan nafsu makan hingga ke kematian. 4. Pengobatan terhadap ayam terinfeksi Pengobatan dilakukan dengan menggunakan 5 jenis antimikroba. Masing-masing antimikroba diaplikasikan di 1 kelompok. Dosis yang diujikan disesuaikan dengan dosis baktericidal yang didapatkan sesuai dengan hasil uji resistensi dan MIC/MBC. Pengobatan dilakukan pada umur ayam 14 hari, Pengobatan dilakukan selama 5 hari secara oral atau sampai umur ayam 18 hari. 5. Evaluasi hasil pengobatan Evaluasi hasil pengobatan terhadap keberadaan Campylobacter jejuni dengan swab usus setelah pengobatan saat ayam umur 19 hari. Evaluasi dilakukan dengan mengisolasi keberadaan Campylobacter jejuni dari swab usus yang mengalami kelainan patologis menggunakan media selektif CCDA, secara rinci pola pemeliharaan, uji, pengamatan dan evaluasi dijabarkan pada Tabel 5 berikut:

10 35 Tabel 5 Pola Pemeliharaan dan Aktifitas Percobaan Umur Pakan (gram) Minum (ml) Aktivitas O/Vit Vaksin TAM Infeksi Pengamatan B-komp + ATP VIT C VIT C ND-IB B-komp B-komp BKC B-komp BKC B-komp BKC Campylobacter jejuni 0 GK Pengambilan spesimen GK GK GK A.biotik 4 GK A.biotik 5 GK A.biotik 6 GK A.biotik 7 GK A.biotik 8 GK GK Swab usus Keterangan : Ma : Makan Mi : Minum O/Vit : Obat/Vitamin TAM : Terapi Air Minum GK : Gejala Klinis PA : Patologi Anatomi Analisis Data Hasil yang diperoleh dianalisis secara deskriptif antara rata-rata diameter zona hambatan dan dosis MIC menggunakan standar National Antimicrobial Resistance Monitoring System Enteric bacteria (NARMS 2006), metode yang dilakukan oleh Holasova dan Karpiskova (2007), dan British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC 2009).