1/14/2014 PENDAHULUAN TEKNOLOGI IMOBILISASI ENZIM

Transkripsi

1 PENDAHULUAN TEKNOLOGI IMOBILISASI ENZIM Tujuan Instruksional Khusus : Mahasiswa dapat menjelaskan metode-metode imobilisasi pada enzim yang dapat diterapkan pada industri pengolahan pangan Kelemahan sifat enzim : Tidak stabil Biaya isolasi dan pemurnian tinggi Pemakaian ulang sulit terutama dalam bentuk larutan Enzim yang belum mengalami perubahan struktur dapat dipakai berulang Stabilisasi enzim dilakukan dengan cara merubah struktur kimiawi enzim sehingga enzim tetap aktif dan tidak rusak oleh pengaruh lingkungan seperti oksidasi, perubahan ph, suhu, proteolisis, hidrolisis Enzim bebas mudah membuka (oleh pengaruh suhu) aktivitas menurun Denaturasi enzim menyebabkan : Penurunan aktivitas enzim Kerusakan total (aktivitas = 0) terjadi karena perubahan ikatan kovalen (oksidasi gugus asam amino reaktif dan hidrolisis) serta perubahan non kovalen Pada perubahan non kovalen yang tidak dapat balik, struktur enzim dapat menutup kembali tapi dengan pola yang salah sehingga fungsi hayatinya tidak dapat diperoleh kembali. Untuk mengatasi kekurangan penggunaan enzim konvensional imobilisasi enzim 1

2 Kelebihan dan kekurangan enzim imobil : Enzim yang terimobilisasi : enzim yang secara fisik dan kimia tidak bebas bergerak sehingga dapat dikendalikan kapan enzim harus kontak dengan substrat. Dasar teknologi imobilisasi : membuat konformasi aktif enzim tahan terhadap lingkungan Enzim yang terimobilisasi : Dapat dipakai berulang karena stabilitasnya lebih terjaga Mudah dipisahkan dari larutan pereaksi karena enzim tidak larut Reason Reuse of enzyme (reducing cost) Easy product separation Continious processing : Facilitated process control Low residence time (high columetric activity) Optimisation of product yield Stabilization by immobilisation Limitations Cost of carriers and immobilisation Changes in properties (selectivity) Mass transfer limitation Problems with cofactor and regenration Problem with multienzymes systems Activity loss during immobilisation Cara-cara imobilisasi enzim : Metode Pengikatan dengan bahan penyangga Metode ikatan silang Metode penjeratan tercapai struktur granula padat yang stabil 2

3 Stabilisasi konformasi enzim melalui pengikatan dengan bahan penyangga Stabilisasi konformasi enzim melalui pengikatan silang Stabilisasi konformasi enzim karena terlindung oleh suatu matriks polimer Stabilisasi konformasi enzim karena terlindung oleh proses kopolimerisasi gel 3

4 Cara pemisahan enzim terimobilisasi dari substrat : - sentrifusi - filtrasi Enzim yang diperoleh dapat digunakan kembali pada proses selanjutnya Cara pemakaian berulang enzim imobil : - digunakan di dalam kolom dan mengalirkan substrat ke dalam kolom - diikat sebagai kompleks pada suatu lempeng berpori - ditempatkan dalam membran ultrafiltrasi - diikat pada suatu bead (granula) kaca atau polimer plastik Penggunaan emzim imobil secara berulang Sistem imobilisasi enzim : a)enzim diadsorpsi secara nonkovalen pada sebuah partikel yang tidak larut b)enzim diikat secara kovalen pada partikel yang larut c)enzim dijerat pada partikel yang tidak dapat larut melalui sebuah polimer d)enzim diikat pada sebuah membran semi permiable Metode imobilisasi dapat diterapkan pada : - satu jenis enzim - multienzim - sel mikroba penghasil enzim - kultur sel hewan dan tanaman Imobilisasi untuk enzim intraseluler : mahal dan tidak efisien dilakukan imobilisasi sel sehingga enzimnya tidak perlu diekstrak dari sel penghasil. Teknik imobilisasi sel disukai pada proses yang melibatkan reaksi sintesis dan degradasi, dimaka kofaktor enzimnya terdapat di dalam sel itu sendiri. Untuk enzim yang memerlukan kofaktor, imobilisasi enzim dilakukan bersama-sama (koimobilisasi) dengan kofaktornya. 4

5 PENGGUNAAN ENZIM IMOBIL SECARA KOMERSIAL Glukosa isomerase di dalam pembuatan gula cair untuk merubah glukosa fruktosa Laktase imobil : hidrolisis laktosa dalam whey glukosa + galaktosa susu berlaktosa rendah Amiloglukosidase : menguraikan komponen laktosa dalam whey meningkatkan pemanfaatannya dalam pembuatan es krim dan produk olahan susu. L-amino asilase yang diisolasi dari A.oryzae teknik imobilisasi : pengikatan ionik pada DEAE-Sephadex (Dietilaminoetil Sepharosa Dextrin) menguraikan gugus asetil dari asam amino bentuk L dalam produksi asam L methionin. PENGGUNAAN ENZIM IMOBIL SECARA KOMERSIAL... Enzim galaktosidase imobil mengkatalisa hidrolisis komponen antinutrisi golongan oligosakarida (contoh : rafinosa) yang dapat menimbulkan gas dan diare pada leguminosa. Nutrisi susu kedele diperbaiki dengan penambahan enzim galaktosidase imobil. Katalase imobil untuk menguraikan sisa H 2 O 2 yang diberikan pada pasteurisasi dingin. Aplikasi dalam pembuatan elektroda enzim yang digunakan untuk analisis komponen kimia tertentu. METODE IMOBILISASI ENZIM 1. Metode Pengikatan Silang Didasarkan pada pembentukan ikatan melintang di antara sel-sel dengan bantuan pereaksi bifungsional atau multifungsional Contoh pereaksi bifungsional : glutaraldehida, diazobenzidin, 1,5-difluoro 2,4 dinitrobenzene, trikloro-s-triazin, 2,4- Diisotiosianat toluen, heksametilenn diisosianat. Yang paling banyak digunakan : glutaraldehida [ ] glutaraldehida yang biasa digunakan 0,2-0,6% dan [ ] enzim mg/ml. Saat ini tidak begitu populer 5

6 Berbagai pereaksi multifungsional yang dimanfaatkan dalam membuat enzim imobil glutaraldehida Pembentukan basa Schiff pada reaksi glutaraldehida dengan sisi samping lisin pada enzim. 2. Metode Pengikatan dengan Bahan Penyangga Didasarkan pada pengikatan enzim langsung pada pembawa yang tidak larut air dengan 4 metode penyerapan : fisik, ionik, logam dan kovalen. Adsorpsi fisik : mudah dan murah Bahan penyanga : aluminium hidroksida, karbon aktif, tanah lempung, kolagen, gelas, tanah diatom dan hidroksi apatit. Pengikatan enzim dengan ikatan ion lebih stabil Bahan penyangga : DEAE (Dietilaminoetil) Selulosa, DEAE- Sephadex, Amberlit IRA (penukar ion), CM-Sephadex, dekstran sulfat dan Amberlit IRC (penukar kation) Pengikatan enzim dengan logam yang dapat mencengkeram (chelating) contoh : titanium klorida Metode pengikatan dengan ikatan kovalen diperlukan kondisi lingkungan yang kompleks, tapi enzim imobilnya lebih stabil. Bagian enzim yang diikat polimer penyangga merupakan gugus fungsional asam amino penyusun yang bebas dan tidak atau belum diikat pada rantai polipeptida protein enzim, misal : - gugus fungsional pada lisin - gugus SH atau S-S pada sistein - gugus fenol pada tirosin - gugus imidazol pada histidin - gugus karboksil bebas pada aspartat 6

7 Beberapa gugus fungsional polimer penyangga dan protein enzim yang berikatan secara kovalen 3. Metode Penjeratan Menjerat enzim secara langsung ke dalam matriks polimer atau dibungkus dalam membran semipermiabel dengan erat sehingga enzim menjadi tidak bebas dan menjalankan fungsi katalitiknua di dalam kisi-kisi polimer tersebut. Enzim diperangkap secara fisik bukan kimiawi sehingga penurunan aktivitas enzim lebih kecil dibanding pengikatan secara kimia. Sarana penempatan enzim dapat berbentuk gel, bentuk serabut kapiler atau suatu mikrokapsul. Bahan penjerat yang banyak digunakan adalah gel yang sudah berbentuk polimer seperti : kolagen, gelatin, agar, alginat, karagenan dan kitosan. Dapat juga berbentuk mikrokapsul yang dibuat dari polimer organik seperti nitroselulosa, polistiren, polivinil asetat. 7

8 Enzim dicampur dengan larutan polimer pada konsentrasi yang tepat campuran dipaksa menetes secara fisik ke dalam larutan ion atau pelarut organik tergantung jenis polimernya. Jika polimer yang digunakan adalah polianion seperti Na Alginat atau CMC, campuran diteteskan dalam larutan ion logam Ba 2+ atau Ca 2+, sehingga terbentuk struktur bundar berpori yang dapat menangkap molekul enzim. Tingkat porositas dan efektivitas motode imobilisasi tergantung pada konsentrasi polimer, ion logam penangkap dan konsentrasi enzim sendiri. Imobilisasi enzim dengan polianion berpa Na-Alginat paling banyak disukai karena murah dan mudah imobilisasi dilakukan pada suhu kamar dengan menggunakan larutan CaCl 2 sebagai ion penetral dan diperoleh enzim imobil yang terperangkap dalam padatan Ca Alginat. Komponen Ca penting dalam mempertahankan struktur padatan. Jika Ca terlarut oleh senyawa pengkelat atau digantikan oleh kation lain seperti Mg 2+ atau K +, struktur enzim imobil akan pecah atau rusak. Polimer lain seperti gelatin, kolagen, agar atau kappakaragenan biasanya dijadikan media pemerangkap enzim dengan metode pengendapan polimer akan mengendap jika ph, suhu, salinitas atau kekuatan ion larutan diubah-ubah. Untuk memperoleh struktur gel polimer yang lebih stabil sering ditambah glutaraldehida sebagai senyawa bifungsional. Cara pembuatan enzim imobil di dalam perangkap agar atau kappa-karagenan : Larutan enzim dicampur dengan larutan agar/karagenan pada suhu o C. Suhu campuran didinginkan sehingga terbentuk gel/padatan Cara lain membuat struktur padatan agar : Menambahkan ion monovalen seperti K +, Rb +, Cs + dan NH 4 + atau senyawa amino dan pelarut organik seperti metanol dan aseton. Struktur fisik gel diperkuat dengan bantuan tanin atau glutaraldehid. 8

9 Bentuk padatan yang diperoleh diperkecil ukurannya hingga diperoleh ukuran yang diinginkan. Biasanya enzim imobil ini dikeringkan dengan spray drying kemudian digiling dan diayak untuk memperoleh ukuran granula enzim yang diinginkan. Enzim imobil bersama polimer pemerangkap yang masih basah dapat diekstrusi melalui suatu lubang kecil dengan diameter < 1mm sebelum dikeringkan sehingga diperoleh granula enzim imobil yang bebas debu. Pada metode penjeratan dengan struktur serabut, digunakan polimer yang dapat membentuk serabut seperti selulosa triasetat di dalam pelarut organik seperti kloroform, karbon tetraklorida dsb larutan ini akan membentuk emulsi dengan larutan enzim yang lebih polar. Jika emulsi yang terbentuk disemprotkan dengan proses ekstruksi ke dalam cairan penggumpal seperti toluene, akan terbentuk endapan polimer dalam bentuk serabut dengan enzim yang terperangkap di dalam bentuk serabut tersebut. Bentuk serabut/filamen lebih tahan terhadap pengaruh asam atau alkali 34 penggunaannya terbatas pada enzim yang tahan terhadap pelarut organik dan larutan penggumpal serta enzim yang molekul substratnya relatif kecil sehingga dapat berdifusi melalui struktur padatan filamen untuk dapat bereaksi dengan enzim tersebut. Pada teknologi imobilisasi dengan mikrokapsulasi, enzim dibuat imobil dalam bentuk kapsul berukuran kimro yang dibuat dari polimer organik. Membran kapsul dibuat permiable terhadap substrat maupun produk terbatas pada enzim dengan substrat yang berukuran kecil Polimer yang digunakan untuk membuat kapsul : nitroselulosa, polistiren, polivinil asetat. Polimer dilarutkan di dalam pelarut organik kemudian diendapkan dengan pelarut lain yang tidak dapat bercampur dengan pelarut tadi, misal : gabungan eter-xylene atau kloroform-eter. PERUBAHAN SIFAT ENZIM OLEH PROSES IMOBILISASI Tergantung dari jenis proses imobilisasi Akibat yang merugikan : turunnya aktivitas spesifik enzim Manfaat yang menyebabkan metode ini berkembang : Meningkatnya stabilitas enzim Meningkatnya daya tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim seperti ph dan suhu tinggi. Jika substrat atau produk yang dihasilkan sensitif terhadap ph maka metode imobilisasi memungkinkan untuk memilih jenis polimer pengikat yang sesuai sehingga kisaran ph optimum enzim imobil sesuai dengan ph stabilitas substrat dan produknya. 9

10 PERUBAHAN SIFAT ENZIM OLEH PROSES IMOBILISASI... Suhu optimum enzim imobil meningkat karena biasanya proses imobilisasi meningkatkan daya tahan enzim terhadap suhu. Pemerangkapan enzim akan melindungi enzim dari pengaruh denaturasi protein. 10