PRINSIP DAN DASAR DASAR PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

Transkripsi

1 PRINSIP DAN DASAR DASAR PENGUJIAN MIKROBIOLOGI 1 Pendahuluan 2 1

2 Sejarah Mikrobiologi 1. Penemuan jasad renik dan penemu mikroskop oleh Antony van Leeuwenhoek ( ) 2. Teori abiogenesis oleh John Needham ( ) 3. Teori biogenesis oleh Lazaro Spallanzani ( ), John Tyndall (1870), Louis Pasteur ( ) 4. Penemuan proses fermentasi oleh Louis Pasteur ( ) 3 5. Teknik isolasi bakteri pada kasus penyakit antraks oleh Robert Koch ( ) 6. Koch dan rekan-rekannya mengembangakan beberapa prosedur laboratorium seperti mewarnai bakteri, membiakkan bakteri, penggunaan media 4 2

3 Mikrobiologi Micros = kecil (renik); Bios = hidup; logos = ilmu. Mikrobiologi : ilmu tentang perikehidupan organisme hidup yang sangat kecil yang hanya dapat dilihat menggunakan mikroskop. Mikroorganisme : Bakteri, Protozoa, virus, algae, cendawan 5 Morfologi sel bakteri - Umumnya bakteri berukuran 0,5-1,0 x 2,0-5,0 μm. - Bentuk bakteri : bola (kokus), batang (basilus), spiral (vibrio). - Penataan bakteri : berpasangan, gerombol, rantai, atau filamen. 6 3

4 Morfologi Fungi Ukuran khamir : lebar berkisar antara 1 5 μm, panjang 5 30 μm. Bentuk khamir: bulat, elips, tidak dilengkapi flagelum. Khamir bersifat fakultatif Kapang terdiri dari 2 bagian, yaitu miselium (kumpulan beberapa filamen >>hifa) dan spora. Kapang bersifat fakultatif 7 Medium pertumbuhan 8 4

5 MEDIA Nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh. - Menghitung - Memperkaya - Identifikasi - koleksi mikroba 9 Syarat-syarat media : Mengandung semua nutrisi yang digunakan oleh mikroba. Mempunyai tekanan osmosis. Mempunyai ph yang sesuai dengan kebutuhan mikroba. Tidak mengandung zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Harus dalam keadaan steril sebelum digunakan. 10 5

6 Jenis-jenis media 1. Berdasarkan fisiknya : a. Media cair b. Media padat c. Media semi padat 11 1.Media Cair Bentuk cair, tidak mengandung bahan pemadat Menumbuhkan/ membiakkan, menyimpan kultur, uji kemampuan fermentasi, pengayaan, dan pengujian lain. Nutrient broth, Brain Heart Broth, TS Broth, Lactose broth, SC Broth, LE Broth, dll. 12 6

7 1,5-2 % Agar 2. Media Padat Menumbuhkan mikroba, menyimpan kultur untuk jangka waktu tidak terlalu lama, mengisolasi dan menghitung mikroba. Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar, Violet Red Bile Agar, Nutrient Agar, dll. Tidak larut sempurna dalam air Pencairan & Pemadatan terus menerus menurunkan kekuatan agar 13 Bahan Pemadat Agar Rumput laut - Galaktan : polimer dari molekul galaktosa (tidak dapat dipecah oleh MO) Tidak digunakan sbg bahan makanan MO Tidak berpengaruh thd karakteristik MO Mix dengan medium broth sebelum sterilisasi Mencair setelah pemanasan C Memadat 40 0 C Digunakan pada suhu 45 0 C Jika lebih mikroba mati 14 7

8 Bahan Pemadat Gelatin - Polimer asam amino dari kolagen % - Jarang digunakan - Mencair pada T di atas suhu ruang tidak dapat diinkubasi pada T tinggi - Dapat dihidrolisis oleh sebagian bakteri Media Semi Padat 0,5 % agar Menyimpan kultur mikroba Pertumbuhan MO menyebar ke seluruh media tapi tidak mengalami pencampuran sempurna. Mencegah/menekan difusi oksigen kondisi anaerob atau sedikit oksigen Thioglycolate medium 16 8

9 Jenis-jenis media 2. Berdasarkan komposisi : a. Media alami : media yang tersusun dari bahan-bahan alami, seperti kentang, daging, telur, air kelapa, dll. b. Media semi sintesis : media yang tersusun dari bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis, contohnya : 17 Pepton Ekstrak daging NaCl Aquadest 10 gr 10 gr 5 gr 1000 ml c. Media sintesis : media yang disusun dari senyawa kimia, contohnya : K2HPO4 KH2PO4 MgSO4. 7H2O NaCl FeSO4. 7H2O MnSO4. 7H2O 0.5 gr 0.5 gr 0.1 gr 0.1 gr 0.01 gr 0.01 gr 18 9

10 3. Berdasarkan sifatnya : a. Media umum : media yang digunakan untuk pertumbuhan satu atau lebih mikroba, contohnya PCA, PDA, dll. b. Media pengayaan (enrichment) : media yang berfungsi untuk mempercepat suatu bakteri, contohnya RVS, TBB, Frasher, dll. c. Media selektif : media yang berfungsi menumbuhkan bakteri tertentu dan menghambat bakteri tertentu, contohnya Mc Conkey, EMB, XLD, dll. 19 d. Media diferensial : media yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba yang bertujuan mengetahui sifat dari mikroba tersebut, contohnya Mc Conkey Agar, BPA, dll. e. Media identifikasi : media yang digunakan untuk mempelajari/membuktikan satu atau lebih funsi metabolik khas dari mikroba yang diperlukan untuk identifikasi, contohnya TSI Agar

11 Larutan Pengencer Mengencerkan contoh yang akan dianalisa atau mikroba yang akan ditumbuhkan (dilusi). Mengandung buffer: mempertahankan keseimbangan fisiologis mikroba. PH netral = Larutan garam fisiologis 0.85%, buffer fosfat (KH 2 PO 4 ), Buffered Peptone Water. PH basa = Alkaline Peptone Water 21 Bahan Tambahan Media Indikator Asam-Basa - Phenol Red - Neutral Red Antibiotik - Menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan 22 11

12 TEKNIK ASEPTIK 23 Teknik Aseptik Suatu teknik yang dilakukan di laboratorium mikrobiologi yang bertujuan untuk meminimalisasi terjadi kontaminasi, yaitu dengan cara : 1. Menggunakan APD 2. Membersihkan meja kerja sebelum dan sesudah dengan menggunakan desinfektan 3. Menggunakan Laminar Air Flow/Biosafety Cabinet 24 12

13 Sterilisasi Suatu proses untuk membunuh mikoba, baik sel vegetatif maupun spora. Beberapa teknik sterilisasi : A. Mekanik/Filtrasi - 0,22-0,45 µ - Bahan yang mudah rusak dengan pemanasan 25 B. Fisik - Pemanasan Pemijaran : ose, pinset,dll Panas Kering (oven, C selama 2 jam) : alat gelas Uap air panas bertekanan : autoklaf (121 0 C, 15 psi, 15 ) : medium -Penyinaran UV, X, gamma, dll UV : membunuh mikroba pada permukaan LAF C. Kimiawi * Desinfektan : alkohol, formalin, khlor, dll 26 13

14 KULTUR MIKROBA Prosedur SR 02 Kelompok Resiko MO 27 Kultur Mikroba Mengetahui sifat dari mikroba, harus dipisahkan satu dengan yang lain dari kutur campuran Kultur Campuran : Biakan yang terdiri dari lebih dari satu species Kultur murni : biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal

15 Kultur Mikroba Peremajaan kultur murni dengan memindahkan ke medium baru Sub Kultur Piaraan Kultur yang disimpan Stock Kultur Kultur mikroba disimpan dalam L.Es pada T 4 0 C Dorman : tidak dapat tumbuh & berkembang biak tetapi tidak mati Bagaimana penanganan & pemeliharaan MO? 29 Kultur Mikroba & Cara Isolasi Kultur mikroba dapat dibekukan dengan cara Liofilisasi Isolasi mikroba adalah tehnik pemisahan/ pemurnian mikroba, dapat dilakukan dengan cara : 1. Isolasi pada medium agar dalam cawan 2. Isolasi pada agar tegak/ agar miring 3. Isolasi pada medium cair 30 15

16 Kultur Murni Pelet (Lypo disk) Stik (kwik stick) Cultiloop Berbeda cara penanganan dan persiapannya 31 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba 32 16

17 Sumber Nutrisi Carbon Nitrogen Oksigen Fosfor Sulfur Air Hidrogen Fe, Ca, Na, Mg, K dll T E R G A N T U N G Sifat MO 33 Waktu Reproduksi Fase Pertumbuhan Mikroba Stationary phase Lag phase Log phase Decline phase 34 17

18 Fase Pertumbuhan Mikroba Lag phase Belum ada pertumbuhan populasi karena sel mulai beradaptasi dengan medium sehingga siap untuk membelah diri. Logaritma phase Sel membelah diri dengan laju yang cepat & konstan. Stationary phase -Terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel - kandungan nutrien mulai habis Decline phase -Sel menjadi mati akibat penumpukan racun - nutrisi habis, mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial. 35 Aerob Mutlak ada O 2 Anaerob Mutlak tidak ada O 2 Kebutuhan O 2 Mikroaerofil Sedikit O 2 Fakultatif Ada/tidak O

19 Penggolongan Mikroorganisme Psikrofil C Mesofil C Termofil 50 atau lebih 0 C Aktivitas Suhu 37 Suhu Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan : 1) Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat dan Sebaliknya. 2) Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat pertumbuhan akan terhenti, komponen sel menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel menjadi mati. suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu : 1) Suhu minimum : suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan terhenti. 2) Suhu optimum : pertumbuhan berlangsung paling cepat dan optimum. (Disebut juga suhu inkubasi) 3) Suhu maksimum : suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi

20 PH Bakteri : 6,5-7,5 Y&M : 3-4 Aw Jumlah air yang terikat dalam bahan pangan Aw bakteri : 0,9 Aw Y&M : 0,7 Kondisi lembab dan kadar air yang tinggi sangat menguntungkan untuk pertumbuhan mikroba,, 39 Jumlah dan Jenis Mikroorganisme dalam suatu produk tergantung pada Kondisi lingkungan (substrat, kadar air, ph, dll). Kualitas mikrobiologi tempat penanganan & pengolahan (ruangan, personil, alat) Kondisi pengemasan, penanganan, penyimpanan (kemasan, ruangan, personil)

21 TOTAL MIKROBA BERDASARKAN KELOMPOK Total mikroba - Prinsip hitungan cawan menggunakan Plate Count Agar (PCA) sebagai media pemupukan. - Semua bakteri, kapang, khamir dapat tumbuh. 41 TOTAL MIKROBA BERDASARKAN KELOMPOK Total bakteri - Perhitungan menggunakan Nutrient Agar (NA), media yang mengandung nitrogen, tetapi tidak mengandung karbohidrat. - Baik untuk pertumbuhan bakteri, tetapi kapang dan khamir tidak dapat tumbuh

22 TOTAL MIKROBA BERDASARKAN KELOMPOK Total spora bakteri - Perhitungan jumlah spora bakteri, suspensi contoh dipanaskan terlebih dahulu untuk membunuh sel vegetatif bakteri, kapang, dan khamir maupun spora kapang dan khamir - Jumlah spora dihitung menggunakan metode hitungan cawan setelah contoh dipanaskan pada suhu tertentu. 43 TOTAL MIKROBA BERDASARKAN KELOMPOK Total kapang dan khamir - Perhitungan jumlah kapang dan khamir dengan metode hitungan cawan menggunakan media PDA - PDA merupakan suatu medium yang mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir, tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Dengan menurunkan ph PDA menjadi sekitar 3,5 pertumbuhan bakteri terhambat disebut Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)

23 Keselamatan kerja di Lab. mikrobiologi 45 Asumsi Dasar Perlakukan semua MO sebagai yang memiliki potensi membahayakan kesehatan manusia. Yang Harus Dilakukan : 1. Cuci tangan terlebih dahulu dengan sabun sebelum bekerja laboratorium. 2. Selalu menggunakan jas laboratorium yang bersih dan APD lainnya selama berada di laboratorium. 3. Tidak makan, minum dan merokok di dalam laboratorium. 4. Sebelum mulai kerja, semprot tangan dengan alkohol 70 %. 5. Meja kerja dibersihkan dengan alkohol 70 % sebelum dan sesudah bekerja. 6. Beri label pada kultur atau media (nama kultur/media, tanggal dibuat). 7. Sterilisasikan peralatan bekas kultur dan media yang sudah tercemar. 8. Jangan memipet dengan mulut. 9. Jika kultur atau media tumpah, segera dilap dengan alkohol 70 %. 10.Setelah selesai bekerja, semprot kembali tangan dengan alkohol 70 % kemudian cuci tangan pakai sabun 46 23

24 Teknik dasar analisis mikrobologi Teknik Dilusi Sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Hampir semua metode perhitungan jumlah mikroba mempergunakan teknik ini. 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, dst. Kelebihan teknik ini adalah digunakan untuk mendeteksi jumlah populasi mikroba yang tinggi dengan pengenceran bertingkat

25 2. Teknik Pour Plate Suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme pada media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan sample. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC, Y&M, Enterobacteriaceae, Coliform, dll. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar Teknik Spread Plate Suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme pada media agar dengan cara menuangkan sample di atas media agar yang telah memadat dan diratakan menggunakan hockey stick. Bedanya dengan pour plate adalah pencampuran sample dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Teknik ini biasa digunakan pada uji S.aureus, B.cereus, dll. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar

26 4. Teknik Streak Plate Suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme pada media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar yang telah memadat dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan sample. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum ose. Teknik ini biasa digunakan pada uji Salmonella, L.monocytogenes, Vibrio, dll. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan M-BRIOdalam Training bentuk Proprietary apapun tanpa dilarang ijin menggandakan tertulis dari Embrio dalam Biotekindo Teknik Transfer Aseptik Suatu teknik memindahkan atau mentransfer sample dari satu medium ke medium lain secara aseptik agar tidak terjadi kontaminasi. Teknik transfer aseptis, yaitu : 1) Inoculating (inokulasi) dengan jarum ose 2) Pipetting (mentransfer dengan pipet) 52 26

27 1) Inoculating (inokulasi) dengan jarum ose a) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah. b) Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang, kemudian segera ambil tabung reaksi/cawan yang berisi MO. c) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi/cawan, lalu segera keluarkan dan lakukan di dekat pembakar bunsen. d) Jarum ose dibakar kembali untuk membunuh bakteri yang sudah diinokulasikan. 53 2) Pipetting (mentransfer dengan pipet) a) Gunakan pipet steril b) Usahakan ketika memasukkan pipet yang berisi sample ke dalam tabung/cawan petri jangan sampai menyentuh dinding tabung/cawan dan lakukan di dekat pembakar bunsen. c) Ganti dengan pipet baru dalam melakukan dilusi yang berbeda

28 Pengambilan contoh dalam uji mikrobologi 55 PENGAMBILAN CONTOH DALAM UJI MIKROBIOLOGI Prosedur Pengambilan Contoh REPRESENTATIF Peralatan Steril Teknik Aseptik o Bahaya terhadap kesehatan Organisme berbahaya sample semakin banyak o Keseragaman Homogen sample semakin sedikit 56 28

29 Penetapan Penerimaan Produk Sampel defektif: Mengandung mikroorganisme berbahaya Mengandung mikroorganisme dalam jumlah lebih tinggi dari yang ditetapkan 57 The N 58 29