VALIDASI & VERIFIKASI METODA MIKROBIOLOGI

Transkripsi

1 VALIDASI & VERIFIKASI METODA MIKROBIOLOGI 1 Penentu Kehandalan Analisis Mikrobiologi Metode Analisa Peralatan Analis/Pelaksana Metode Standar Modifikasi Penyederhanaan Neraca LAF Pipet Inkubator Autoklaf Pengetahuan Ketrampilan/kompeten Ketelitian VALIDASI & VERIFIKASI METODE KALIBRASI TRAINING & UJI KOMPETENSI 1

2 Jenis Metode Uji Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll Metode Resmi : Farmakope, EPA, dll Metode yang dikembangkan oleh organisasi profesional yang memiliki reputasi nasional dan internasional : AOAC, BAM Metode Pustaka In house methode Metode Modifikasi 3 Pemilihan Metode Faktor yang menjadi pertimbangan : Asal metode Status metode Apakah lab. menguasai teknologinya? Apakah SDM/Analis kompeten? Biaya & waktu yang dibutuhkan Metode mudah diaplikasikan Kondisi akomodasi & peralatan lab. memadai? 4 2

3 Proses untuk mengkorfimasi bahwa suatu metoda mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode,,,, Apa itu Validasi??? 5 Kapan Validasi dilakukan?? Metode non standar Reagent Baru VALIDASI METODE Menyederhanakan Metode In house Method Validasi harus dilakukan sebelum setiap metode non standar digunakan secara RUTIN di Laboratorium 6 3

4 Mengapa dilakukan Validasi??? ISO/IEC , elemen 5.4 Metode uji & Validasi metode. Banyak lab. menggunakan metode uji dari manual book/alat bukan metode standar/resmi (SNI, ISO, AOAC, BAM, USP,dll). Lab. di daerah kesulitan mendapatkan reagensia/media tertentu biaya, ED singkat memangkas metode standar. In house method sebagai alternatif yaitu dengan memodifikasi metode standar. Bukti metode baru dapat digunakan/diadopsi oleh Lab dengan mengevaluasi kemampuan kinerja metode uji,,, 7 Apa yang akan dibuktikan dalam Validasi? membuktikan bahwa metoda baru dapat menghasilkan paling tidak hasil yang sebanding dengan Metoda Standar yang dikenal (Australian Standar, ISO standar, BAM, AOAC method, dll). mempunyai tingkat sensitifitas & spesifisitas yang sama & dapat diterapkan dalam kisaran matrik contoh yang biasa diterima laboratorium untuk pengujian m.o. 8 4

5 Konfirmasi melalui pengujian dan penyajian bukti bahwa persyaratan yang telah ditetapkan telah di penuhi Apa itu Verifikasi??? 9 Apa yang akan dibuktikan dalam Verifikasi? Membuktikan bahwa metoda standar yang digunakan telah sesuai dengan kriteria yang ditetapkan,, Mempertimbangkan dan memastikan apakah metode uji tersebut dapat dipakai atau tidak 10 5

6 METODA PENGUJIAN mikrobiologi Kuantitatif Hitungan Cawan - Pour plate : TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae - Spread Plate : S.aureus, B.cereus MPN Petrifilm : Coliform, E.coli : TPC, Y&M, Coliform dll Kualitatif Isolasi - Salmonella - Vibrio Cholera - L.monocytogenes - dll 11 Parameter Validasi & Verifikasi Metode Uji Kuantitatif Presisi Akurasi Kualitatif Sensitifitas Spesifisitas False Positif False Negatif Efficiency 12 6

7 Presisi Kedekatan hasil antara beberapa hasil pengukuran ulang yang diukur dengan cara yang sama. Parameter : Relatif Standar Deviasi Koefisien Variasi Repeatability Waktu analisa, alat, penguji/analis sama dalam laboratorium yang sama. Intermediate Precision Waktu analisa atau alat atau penguji/analis beda dalam laboratorium yang sama (variasi inter laboratorium) Reproducibility Waktu analisa, alat, penguji/analis beda dalam laboratorium yang berbeda. 13 Presisi RSD = ((Log a log b) / x 1 ) 2 2n CV (coefisien of variation) = RSD x 100% Syarat : RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02) CV = max.10 % 14 7

8 Akurasi Kedekatan hasil analisis dengan nilai sebenarnya. Parameter : Recovery (Perolehan Kembali) Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan kultur acuan pada konsentrasi tertentu dalam suatu matriks contoh. Perhitungan H x 100 % A H = Hasil pengujian dengan metode (sample + spike) - sample A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike) Syarat : > 70 % Catatan : Gunakan sample yang tidak mengandung MO 15 Sensitifity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil positif terhadap sampel yang positif Spesificity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil negatif terhadap sampel yang negatif False positive rate : persentase jumlah sampel yang salah identifikasi sebagai positif False negative rate : persentase jumlah sampel yang salah identifikasi sebagai negatif Confidence limit :95% 16 8

9 Tahapan Validasi/Verifikasi Memilih Organisme Uji Memilih matriks sample Melakukan pengujian sesuai prosedur Interpretasi hasil 17 Syarat,,,, Menggunakan peralatan yang terkalibrasi Dilakukan oleh personil yang kompeten Media/Reagent yang digunakan sesuai spesifikasinya. Kondisi lingkungan memadai 18 9

10 Memilih Organisme Uji Sesuai SR 02 - MO acuan berasal dari koleksi yang diakui - Menjamin ketertelusuran - Dipelihara oleh Penanggungjawab MO acuan - Pemeliharaan sebagai berikut : 19 Strain (ATCC, NTCC) Subkultur sekali * Persediaan acuan (Liofilisasi) Dicairkan * : uji kemurnian Kultur kerja * (Penggunaan rutin) 20 10

11 Memilih Organisme Uji 3-5 strain untuk validasi dan min. 1 strain untuk verifikasi dari organisme target. Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif harus merupakan salah satu dari strain tersebut. Strain yang lain dipilih dari hal berikut : Strain dari organisme target yang diisolasi oleh laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik yang diperiksa. Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh cultur collection. 21 Memilih Matrik Sampel Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih sampel yang mewakili lingkup variasi yang akan ditemui dalam matriks yang telah ditentukan. Dapat menggunakan sample yang tercemari secara alami atau dapat menggunakan sample yang dicemari (spike sample). Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi jumlah dan homogenitas kontaminan

12 Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 1 Biakan murni dalam agar miring 1 loop BHI- Broth/media lainnya 10 ml Inkubasi selama 18-24jam pada suhu C 23 Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke Dst BHI-Broth 10 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Hit. Jumlah koloni/ml Inkubasi selama 48 jam pada suhu 36±1 0 C 24 12

13 Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 4 Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri Ulangan Hasil ,4 x 10 9 kol/ml Persiapan matriks Pipet 100 gr/ ml sample 900 ml BPW (Buffer Peptone Water) Homogenisasi Catatan,,, Gunakan sample yang tidak tercemari MO target 26 13

14 Pembuatan Spike Populasi Rendah BHI-Broth 10 ml 1 ml Dst ml 1 ml 10 ml 90 ml sample Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi rendah (2 kol/ml atau/gr) 27 Pembuatan Spike Populasi Sedang BHI-Broth 10 ml 1 ml Dst ml 1 ml 10 ml 90 ml sample Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi sedang (2,0 x 10 1 kol/ml atau/gr) 28 14

15 Pembuatan Spike Populasi Tinggi BHI-Broth 10 ml ml 1 ml 1 ml 10 ml 90 ml sample Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi tinggi (2,0 x10 2 kol/ml atau /gr) 29 Prosedur Validasi & Verifikasi Kuantitatif (Hitungan Cawan) - Lakukan pengujian sedikitnya 15 kali (perkiraan populasi pada contoh: rendah, sedang, tinggi) - Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan metode spike sample) atau tidak mengandung organisme target. - HitungRSD darimasing-masingpopulasidan gabungan semua populasi. Catatan. Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi dari masingmasing analis untuk mengetahui kinerja analis 30 15

16 Kuantitatif MPN (Most Probable Number) Kriteria Sensitifity Spesificity False positive rate False negative rate Efficiency Confidence limit :95% 31 Prosedur Siapkan sampel (kontaminasi alami atau sengaja) sesuai prosedur. Inokulasi larutan contoh pada media atau tabung-tabung pertumbuhan. Hitung jumlah tabung yang positif dan negatif. Konfirmasi dengan uji biokimia terhadap koloni yang terdapat pada cawan atau setiap tabung yang positif dan negatif. Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif, False Negatif, dan Efficiency

17 Konfirmasi Validasi Semuapresumptive positive dannegative harus dikonfirmasi Verifikasi Semuapresumptive positive yang dikonfirmasi 33 Perhitungan Confirmed Presumtive Positif Negatif Positif Negatif Sensitifitas = A/(A+B) x 100 Spesifitas = D/(C+D) x 100 A (positive) C (false positive) False positive rate = c/(a+c) x 100 False negatif rate = b/(b+d) x 100 Jumlah tabung : a + b + c + d = n B (false negative) D (negative) Efficiency = (a+d)/n x

18 Kualitatif Lakukan pengujian sedikitnya 10 kali (perkiraan populasi pada contoh : rendah dan tinggi) - Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan metode spike sample) atau tidak mengandung organisme target. -Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif, False Negatif, dan Efficiency 35 Penghitungan Verifikasi Confirmed positif negatif Presumtive positif negatif A (positive) C (false positive) B (false negative) D (negative) Sensitifitas = A/(A+B) x 100 Spesifitas = D/(C+D) x 100 Jumlah contoh : a + b + c + d = n False positive rate = c/(a+c) Efficiency = (a+d)/n x 100 False negatif rate = b/(b+d) 36 18

19 Perhitungan Validasi Confirmed Metoda non standar positif negatif positif A (positive) B (false negative) negatif C (false positive) D (negative) Sensitifitas = A/(A+B) x 100 Spesifitas = D/(C+D) x 100 Jumlah contoh : a + b + c + d = n False positive rate = c/(a+c) x 100 False negatif rate = b/(b+d) x 100 Efficiency = (a+d)/n x Method Validation of Microbiological Methods, Guidance Note : C & B and ENV 002. Singapore Acreditation Council, July

20 Kapan Validasi kultur Media dilakukan? Kultur media diganti dengan media baru (XLD Agar diganti dengan Rambach Agar) Kultur media diganti dengan brand lain (OXOID diganti dengan MERCK) Kultur media diganti dengan non kultur test (XLD diganti dengan Singlepath Salmonella) Metode kultur diganti dengan metode lain Mis. ELISA, PCR 39 Performance Kultur Media Misalnya : media Baird Parker Agar untuk pengujian S.aureus Reference media : TSA Parameter Strain Uji Kriteria Karakteristik koloni Produktivitas S.aureus ATCC Kuantitatif > 0,5 Black colonies with lightening halo Selektivitas E.coli ATCC Kualitatif Total penghambat Elektivitas S.epidermidis ATCC Kualitatif - Black colonies without lightening halo - PRoduktivitas = Test method Reference method Non Selektif : >

21 The end.. dalam M-BRIO bentuk apapun Training tanpa Proprietary ijin tertulis - dilarang dari menggandakan Embrio Biotekindo