Screening of biosurfactant producing hydrocarbonoclastic bacteria as a bioremediation agent of petroleum contaminated environment

Transkripsi

1 Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 Screening of biosurfactant producing hydrocarbonoclastic bacteria as a bioremediation agent of petroleum contaminated environment Hary Widjajanti, Muharni, dan Mirfat Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sriwijaya, Inderalaya Abstract. Biosurfactant application is one of the important efforts in accelerating the petroleum bioremediation process. The aim of this research were screening for biosurfactant producing by hydrocarbonoclastic bacteria from petroleum contaminated mangrove area and to know the production and emulsification potency of their biosurfactant. Screening done by looking hemolytic activity of 29 isolates of hydrocarbonoclastic bacteria on blood agar medium. The variables measured were total count bacteria, biosurfactant production and emulsification index. The results showed that 16 hydrocarbonoclastic bacteria known potentially to produce biosurfactant. Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas saccharophyla, and Bacillus sphaericus var rotans selected as the inoculum of biosurfactant production. The highest biosurfactant product achieved at the 48 hours incubation time, which biosurfactant produced by Pseudomonas alcaligenes was 1.9 g/l with emulsification index 0.6, Pseudomonas saccharophyla produce biosurfactant at 1.86 g/l with emulsification index of 0.63 and Bacillus sphaericus var rotans produce biosurfactant at 0.68 g/l with emulsification index of 0.6. Key words: screening, biosurfactant, hydrocarbonoclastic bacteria, emulsification index PENDAHULUAN Latar Belakang Pencemaran minyak bumi yang terjadi pada ekosistem perairan selain dapat merusak lingkungan biota air di bawahnya, dapat juga mengganggu kesehatan manusia. Bahan pencemar tersebut sangat sulit untuk diatasi apabila sudah menempel pada partikel padat seperti tanah, pasir, sediment dan tumbuhan. Beberapa cara telah dilakukan untuk menanggulangi pencemaran ini, diantaranya dengan fotooksidasi, penguapan, dan penggunaan surfaktan kimia (Van Dyke et al., 1991). Masalah lain dari penanggulangan tersebut diantaranya adalah biaya yang mahal, selain itu beberapa surfaktan kimia juga menyebabkan masalah bagi lingkungan karena sifatnya yang resisten untuk dapat dipecah secara biologi dan sangat toksik saat terakumulasi dalam suatu ekosistem alam (Fiechter, 1992). Salah satu cara penanggulangan pencemaran oleh minyak bumi yang aman adalah dengan menggunakan biosurfaktan yang dihasilkan oleh mikroba pendegradasi minyak bumi. Selain dapat membantu peningkatan degradasi minyak bumi juga tidak toksik terhadap lingkungan, sehingga keberadaan biosurfaktan dapat menjadi alternatif pengganti senyawa surfaktan kimia pengaktif permukaan (Van Dyke et al., 1991). Biosurfaktan dapat digunakan untuk mempercepat bioremediasi lingkungan yang tercemar minyak bumi, yaitu dengan meningkatkan daya kelarutan minyak bumi. Selanjutnya minyak bumi didegradasi oleh sel-sel mikroorganisme, melalui pembentukan butiran-butiran minyak bumi (misel) yang terdispersi dalam air (Dunvjak et al., 1983). Selain untuk bioremediasi, biosurfaktan juga dapat dimanfaatkan dalam teknologi MEOR untuk meningkatkan perolehan minyak bumi. Semirata 2013 FMIPA Unila 339

2 Hary Widjajanti, dkk: Screening of biosurfactant producing hydrocarbonoclastic bacteria as a bioremediation agent of petroleum contaminated environment Widjajanti dkk (2008) telah mendapatkan 29 jenis bakteri hidrokarbonoklastik dari kawasan mangrove yang tercemar minyak bumi, yaitu dari genera Alcaligenes, Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Flavobacterium, dan Pseudomonas. Semua jenis bakteri tersebut bersifat hidrokarbonoklastik dan diduga juga menghasilkan biosurfaktan. Oleh karena itu akan dikaji kemampuan isolat bakteri yang didapatkan dalam menghasilkan biosurfaktan dan optimasi pertumbuhannya dalam produksi biosurfaktan. Tujuan penelitian untuk melakukan skrining bakteri hidrokarbonoklastik penghasil biosurfaktan yang diperoleh dari kawasan mangrove yang tercemar minyak bumi dan menguji kemampuannya dalam produksi dan emulsifikasi biosurfaktan. BAHAN DAN METODE Skrining bakteri penghasil biosurfaktan Srining bakteri penghasil biosurfaktan menggunakan uji hemolisis. Aktivitas hemolitik oleh strain bakteri dilihat dengan cara menginokulasikan bakteri pada medium agar darah (blood agar) dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 24 jam. Terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan aktivitas hemolitik yang dapat diindikasikan sebagai penghasil biosurfaktan (Bicca et al., 1999 dalam Tabatabaee et al. 2005). Dari semua bakteri yang dapat menghasilkan biosurfaktan akan dipilih bakteri yang membentuk zona bening paling besar dan paling jelas di sekeliling koloninya. dan selanjutnya digunakan sebagai inokulum untuk produksi biosurfaktan. Pembuatan kurva standar dan kurva pertumbuhan bakteri Kurva standar yang dibuat merupakan korelasi antara kekeruhan biakan dan jumlah sel bakteri per ml biakan. Kurva standar ini selanjutnya akan digunakan dalam penghitungan jumlah bakteri selanjutnya. (Modifikasi Hadioetomo 1990). Kurva pertumbuhan dibuat dengan menumbuhkan bakteri pada medium ZoBell cair dan diinkubasi di atas shaker pada suhu ruang dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Jumlah sel bakteri dihitung setiap 6 jam sekali sampai terjadi penurun. Data jumlah sel bakteri dari setiap waktu pengamatan dibuat dalam bentuk grafik, sehingga diketahui fase-fase pertumbuhannya (Brock, 1974). Produksi Biosurfaktan Medium SMSS cair 100 ml dengan ph 6,5 diinokulasi dengan 10% inokulum bakteri. Kultur selanjutnya diinkubasi pada rotary shaker 150 rpm pada suhu ruang. Pengambilan sampel untuk pengukuran produksi biosurfaktan dilakukan setiap 12 jam sekali, sampai jam ke 60 (Modifikasi Suryatmana et al. 2004). Pengukuran Produksi Biosurfaktan Biosurfaktan dipisahkan dari kultur dengan sentrifugasi pada kecepatan rpm selama 60 menit sehingga diperoleh supernatan. Selanjutnya dilakukan ekstraksi biosurfaktan fraksi asam lemak (Suryatmana, 2006 dalam Devianto & Kardena 2010) dan ekstraksi biosurfaktan fraksi eksopolisakarida (Vermani et. al., 1995). Pengukuran Indeks Emulsifikasi (E 24 ) Pengukuran dilakukan untuk menguji tingkat emulsifikasi biosurfaktan fraksi total terhadap minyak bumi. Pengukuran dilakukan dengan menambahkan 5 ml supernatan hasil sentrifugasi pada 5 ml crude oil. Larutan campuran antara crude oil dan supernatan kemudian dikocok dengan vorteks kecepatan maksimal sampai tercampur merata, lalu dibiarkan selama 24 jam. Indeks Emulsifikasi (E 24 ) diketahui 340 Semirata 2013 FMIPA Unila

3 Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 dengan mengukur ketinggian larutan minyak teremulsi dibagi tinggi total larutan setelah 24 jam (Suryatmana, 2006 dalam Devianto & Kardena 2010). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil skrining bakteri hidrokarbonoklastik penghasil biosurfaktan Hasil skrining bakteri hidrokarbonoklastik pada medium agar darah disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Hasil skrining bakteri hidrokarbonoklastik penghasil biosurfaktan No. Spesies Diameter Zona Bening (mm) 1. Alcaligenes eutrophus - 2. Alcaligenes faecalis 6,3 3. Bacillus aminovorans 9,7 4. Bacillus apiarius - 5. Bacillus brevis 3,3 6. Bacillus carotarum - 7. Bacillus cereus - 8. Bacillus coagulans - 9. Bacillus firmus Bacillus licheniformis Bacillus macerans 6,8 12. Bacillus megaterium 8,2 13. Bacillus mycoides 7,8 14. Bacillus polymyxa 1,0 15. Bacillus sphaericus 7,8 16. Bacillus sphaericus var rotans 15,0 17. Enterobacter - agglomerans 18. Flavobacterium thalpophilum 3,0 19. Pseudomonas alcaligenes 10,1 20. Pseudomonas aureofaciens Pseudomonas aeruginosa 7,5 22. Pseudomonas cepacia 10,5 23. Pseudomonas - diminuta 24. Pseudomonas mendocina 1,0 25. Pseudomonas pseudoalcaligenes 1,0 26. Pseudomonas - pseudomallei 27. Pseudomonas putida Pseudomonas saccharophyla 13,3 29. Pseudomonas syringae - Keterangan: tanda (-) : tidak terbentuk zona bening Diameter zona bening yang terbentuk di sekitar koloni bakteri bervariasi berkisar antara 1 hingga 15 mm. Perbedaan ini diduga disebabkan perbedaan kemampuan masing-masing bakteri dalam menghasilkan biosurfaktan. Bakteri yang memiliki kemampuan menghasilkan biosurfaktan lebih banyak, akan membentuk misel lebih banyak di sekeliling fosfolipid darah dan kemudian melisiskannya. Semakin banyak sel darah yang lisis semakin besar pula zona bening yang terbentuk, begitu juga sebalikanya. Menurut Yuliar (2008), prinsip aktivitas biosurfaktan didasarkan pada kemampuan biosurfaktan membentuk misel mengelilingi komponen hidrofobik dan melisis sel darah merah. Hasil skrining menunjukkan bahwa Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas saccharophyla, dan Bacillus sphaericus var rotans menghasilkan zona yang paling bening di sekeliling koloninya. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga bakteri mampu melisis darah dengan sempurna (β hemolisis). Menurut Tabatabaee et al. (2005), terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri menunjukkan aktivitas β hemolisis bakteri yang dapat diindikasikan sebagai penghasil biosurfaktan. Ketiga Semirata 2013 FMIPA Unila 341

4 Hary Widjajanti, dkk: Screening of biosurfactant producing hydrocarbonoclastic bacteria as a bioremediation agent of petroleum contaminated environment bakteri ini kemudian dipilih sebagai inokulum untuk produksi biosurfaktan. Produksi biosurfaktan Hasil pengukuran produksi biosurfaktan pada jam ke-0, 12, 24, 36, 48, dan 60 disajikan pada Gambar 1. Produksi biosurfaktan ketiga kultur bakteri cenderung mengalami peningkatan secara simultan sejak awal pengamatan hingga jam ke-48, dimana ketiga strain bakteri sedang berada pada fase eksponensial dan fase stasioner. Hal ini sesuai dengan pernyataan Mulligan & Gibbs tehun 1993 dalam Ratih & Eviyati (2007), bahwa senyawa biosurfaktan merupakan bioproduk sel bakteri yang terbentuk selama fase eksponensial dan stasioner. Biosurfaktan diproduksi jika terjadi akumulasi lemak pada dinding sel bakteri. Produksi biosurfaktan tertinggi terlihat pada jam ke-48, dimana ketiga kultur bakteri sedang berada pada akhir fase stasioner. Hal ini diduga disebabkan karena pada akhir fase stasioner terjadi penumpukan biosurfaktan yang dihasilkan oleh sel bakteri. Menurut Gosalam et al. (2008) pada akhir fase stasioner terjadi penimbunan metabolit-metabolit yang dapat menurunkan pertumbuhan. Gambar 1. Produksi Biosurfaktan oleh a) P. alcaligenes, b) P. saccharophyla, dan c) B. sphaericus var rotans Penurunan produksi mulai terjadi setelah 48 jam masa inkubasi, dimana bakteri mulai berada pada akhir fase stasioner atau awal fase kematian. Penelitian Latunussa (2007) dalam Devianto & Kardena (2010), bahwa setelah inkubasi selama 48 jam terjadi penurunan produksi eksopolisakarida oleh bakteri Lactobacillus rhamnosus hingga mencapai 82%. Anonim (2011) menambahkan, terjadi penurunan produksi biosurfaktan seiring dengan menurunnya pertumbuhan bakteri. Penurunan produksi ini diduga disebabkan karena pada akhir fase stasioner terdapat penimbunan metabolit yang menghambat pertumbuhan bakteri. Terhambatnya pertumbuhan sel bakteri secara tidak langsung juga menghambat bakteri untuk menghasilkan enzim yang berperan dalam pembentukan biosurfaktan. Menurut Sheppard & Cooper (1991), produksi biosurfaktan dipengaruhi oleh 342 Semirata 2013 FMIPA Unila

5 Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 keberadaan enzim glutamin sintetase. Jika kehadiran enzim glutamin sintetase tertekan maka produksi biosurfaktan pun akan menurun. Pola produksi biosurfaktan yang telah dijelaskan di atas memperlihatkan bahwa kuantitas produksi biosurfaktan berhubungan dengan pertumbuhan bakteri, dimana apabila jumlah sel bakteri meningkat maka produksi biosurfaktan meningkat. Menurut Shuler & Kargi tahun 1992 dalam Suryatmana et al. (2004), bakteri tertentu memiliki pola pembentukan produk yang secara simultan sejalan dengan pertumbuhan, dimana produk biosurfaktan proporsional terhadap pertumbuhan sel. Biosurfaktan yang dihasilkan ketiga bakteri pun dapat terdeteksi jenisnya. Berdasarkan hasil ekstraksi diketahui bahwa Pseudomonas alcaligenes dan Pseudomonas saccharophyla memiliki potensi dalam mengekskresikan senyawa kelompok eksopolisakarida (EPS). Sesuai dengan Kim et al. (1996) beberapa spesies dari genus Pseudomonas menghasilkan jenis polisakarida penting. Polisakarida tersebut antara lain polisakarida ekstraselular (EPS), kapsular, dan lipopolisakarida. Bacillus sphaericus var rotans juga mengekskresikan senyawa kelompok eksopolisakarida. Hal ini sejalan dengan penelitian Illias et al. (2001) bahwa dari uji produksi polisakarida pada medium sukrosa, didapatkan 6 koloni dari genus Bacillus terlihat berlendir karena kehadiran eksopolisakarida. Eksopolisakarida dapat berfungsi sebagai biosurfaktan, yang dapat meningkatkan biodegradasi limbah minyak bumi (Iwabuchi et al. 2002). Indeks Emulsifikasi Hasil pengukuran indeks emulsifikasi menunjukkan bahwa biosurfaktan dari ketiga kultur bakteri yang diuji memiliki kemampuan dalam megemulsi hidrokarbon (Gambar 2). Hal ini sesuai dengan dengan Ni matuzzahroh et al. (2002), produk biosurfaktan yang dihasilkan bakteri Pseudomonas sp. dapat meningkatkan emulsifikasi hidrokarbon di dalam air dan mampu menurunkan tegangan permukaan supernatan kultur bakteri. Gambar 2. Index Emulsifikasi (E 24 ) biosurfaktan oleh kultur bakteri a) P. alcaligenes, b) P. saccharophyla, c) B. sphaericus var rotans Semirata 2013 FMIPA Unila 343

6 Hary Widjajanti, dkk: Screening of biosurfactant producing hydrocarbonoclastic bacteria as a bioremediation agent of petroleum contaminated environment Produksi biosurfaktan tertinggi dicapai pada jam ke-48, dimana indeks emulsifikasi (E 24 ) Pseudomonas alcaligenes sebesar 0,6 dengan produksi biosurfaktan 1,9 g/l, E 24 Pseudomonas saccharophyla mencapai angka 0,63 dengan 1,86 g/l, dan Bacillus sphaericus var rotans mencapai angka 0,6 dengan kuantitas biosurfaktan 0,68 g/l. Meski kultur bakteri Bacillus sphaericus var rotans menghasilkan produk yang relatif sedikit (0,68 g/l), namun kultur ini masih menunjukkan nilai emulsifikasi sebesar 0,6. Kondisi ini menunjukkan bahwa kualitas biosurfaktan yang dihasilkan memiliki kualitas emulsifikasi yang kuat. Menurut Dastgheib et al. (2008) biosurfaktan dengan berat molekul tinggi seperti eksopolisakarida merupakan emulsifier yang sangat efisien bekerja pada konsentrasi rendah dan menunjukkan kekhasan substrat. Diperkuat Diah (2008) bioemulsifier polisakarida amfifatik merupakan polimer dengan berat molekul besar. Dalam medium cair, bioemulsifier ini mempengaruhi pembentukan emulsi serta kestabilannya. Semakin tinggi produk yang terbentuk maka semakin tinggi pula indeks emulsifikasi yang dicapai (Gambar 2). Hal ini terjadi karena semakin banyak biosurfaktan yang diproduksi, semakin banyak pula misel yang terbentuk dan meningkatkan kelarutan minyak dalam air. Menurut Nababan (2008) mikroorganisme dengan produksi biosurfaktan yang besar pada umumnya juga mempunyai kemampuan yang besar dalam menguraikan senyawa hidrokarbon melalui pelarutan ataupun emulsifikasi. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Hasil skrining dari 29 bakteri hidrokarbonoklastik yang berasal dari kawasan mangrove tercemar minyak bumi diketahui 16 bakteri berpotensi menghasilkan biosurfaktan. Produk biosurfaktan tertinggi dicapai pada jam pengamatan ke-48, dimana P. alcaligenes memproduksi biosurfaktan sebesar 1,9 g/l, diikuti P. saccharophyla 1,86 g/l, dan B. sphaericus var rotans 0,68 g/l. Indeks emulsifikasi tertinggi dicapai pada jam pengamatan ke-48, dimana P. alcaligenes mencapai indeks emulsifikasi sebesar 0,6; P. Saccharophyla 0,63; dan B. sphaericus var. rotans 0,6. Saran Berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian ini, dapat disarankan perlunya dilakukan optimasi nutrien (sumber karbon dan nitrogen) dan faktor lingkungan (seperti: ph dan kecepatan agitasi) yang mendukung produksi biosurfaktan dari ketiga bakteri untuk mendapatkan hasil produksi yang lebih tinggi. DAFTAR PUSTAKA Datsgheib, S.M.M., M.A. Amoozegar, E. Elahi, S. Asad & I.M. Banat Bioemulsifier production by a halothermophilic Bacillus strain with potential applications in microbially enhanced oil recovery. Biotechnol. Lett. 30: Devianto, L.A. & E. Kardena Pengaruh Glukosa terhadap Produksi Biosurfaktan oleh Azotobacter vinelandii dan Pengaruh Biosurfaktan Terhadap Biodegradasi TPH oleh Konsorsium Bakteri Petrofilik. Biotechnology. 8 (1): Diah, P Mekanisme Kerja Bakteri Pseudomonas sp. dalam Proses Bioremediasi Minyak Bumi April Duvnjak, Z., Cooper, Cooper, D.G, dan Kosaric, N Effect of nitrogen sources on surfactans production by 344 Semirata 2013 FMIPA Unila

7 Prosiding Semirata FMIPA Universitas Lampung, 2013 Arthobacter paraffineus ATCC dalam Microbial Enhanced Oil Recovery. Zajic, J. E. Penn Well Books Tulsa, Oklahoma, Fiechter, A Biosurfactans : moving towards industrial application. Tibtech, 10, Gosalam, S., A. Tahir & J.L. Silviana Uji Kemampuan Bakteri dari Perairan dalam Mendegradasi Senyawa Minyak Solar. Jurnal Torani. 18 (2): Hadioetomo, R.S Mikrobiologi Dasar dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Gramedia. Jakarta. 163 hlm. Illias, R.M., O.S. Wei, A.K. Idris & W.A. Rahman Isolation and Characterization Of Halotolerant Aerobic Bacteria From Oil Reservoir. Jurnal Teknologi. 35 (1): Iwabuchi, N., M. Sunairi, M. Urai, C. Itoh, H. Anza, & S. Harayama Extra cellular Polysacharides of Rhodococus rhodochrous S-2 stimulate the Degradation of Aromatic Components in Crude Oil by Indigenous Marine Bacteria. J. Appl. Environ. Microbiol. 68: Kim, J.S., B.L. Reuhs, M.M. Rahman, B. Ridley & R.W. Carlson Separation of bacterial capsular and lipopolysaccharides by preparative electrophoresis. Glycobiology. 6 (4): Nababan, B Isolasi Dan Uji Potensi Bakteri Pendegradasi Minyak Solar Dari Laut Belawan. Tesis.Universitas Sumatera Utara. xi+62 hlm. Ni matuzahroh, T. Surtiningsih & M. Tanjung Mekanisme Asimilasi Hidrokarbon Oleh Bakteri Hidrokarbonoklastik Pseudomunas sp. Abstrak Penelitian. 1 hlm. Ratih, S. & R. Eviyati Pestisida Organik Berbahan Aktif Bakteri Agensia Hayati yang Efektif Mengendalikan Pustul Kedelai. Jurnal Agrijati. 6 (1): Sheppard, J.D. & D.G. Cooper The Respons of Bacillus subtillis ATCC to Manganese During Continous Phase Growth. Appl. Microbiol. Techno. 35: Suryatmana, P., K. Edwan, R. Enny & Wisjnuprapto Karakteristik Biosurfaktan dari Azotobacter chroococcum. Di dalam Laporan akhir dan Seminar Evaluasi RUT XI. Kementrian Riset dan Teknologi RI. Serpong hlm. Tabatabaee, A., M.M. Assadi, A.A. Noohi & V.A. Sajadian Isolation of Biosurfactant Producing Bacteria from Oil Reservoirs. Iranian J. Env. Health Sci. Eng. 2 (1): Van Dyke., Lee, H., and Trevor, J.T, Application of microbial surfactans, Biotech. Adv., 9, Widjajanti, H., M. Ridho & Munawar Upaya Rehabilisasi Hutan Mangrove: Studi Modelling Bioremediasi Menggunakan Agen Biologis Indigenous untuk Menurunkan bahan Pencemar di Hutan Mangrove Wilayah Propinsi Sumatera Selatan. Laporan Penelitian Universitas Sriwijaya hlm. Yuliar Skrining Bioantagonistik Bakteri untuk Agen Biokontrol Rhizoctonia solani dan Kemampuannya dalam Menghasilkan Surfaktin. Biodiversitas. 9 (2): Semirata 2013 FMIPA Unila 345

8 346 Semirata 2013 FMIPA Unila