ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI SITOTOKSIK SENYAWA ALKALOID DARI DAUN JOHAR (Senna siamea)

Transkripsi

1 JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No 3, Desember 2016 Program Studi Pendidikan Kimia Universitas Sebelas Maret halaman ISSN ISSN (online) ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI SITOTOKSIK SENYAWA ALKALOID DARI DAUN JOHAR (Senna siamea) Ismi Simpang Anggia 1,*,Dewi Kusrini 1, Enny Fachriyah 1 1,2 Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia **Keperluan korespondensi, telp: , ismisimpanganggia@gmail.com Received: 28 June 2016 Accepted: December 1, 2016 Online Published: December 30, 2016 ABSTRAK Telah dilakukan penelitian tentang isolasi alkaloid dari daun Johar (Senna siamea) menggunakan metode ekstraksi dengan pelarut etanol 96%. Ekstrak etanol dan serbuk daun Johar diuji penapisan fitokimia. Ekstrak alkaloid dihasilkan dengan cara penggaraman melalui penambahan HCl 2M sampai ph 3 dan diekstraksi dengan etil asetat, lapisan asam yang didapatkan ditambah NH4OH hingga ph 9-10 dan diekstraksi dengan etil asetat. Pemisahan alkaloid dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif menggunakan fasa diam silika gel GF254 dan fasa gerak etil asetat:kloroform (8:2) dan uji kemurniannya menggunakan metode KLT dengan berbagai eluen dan KLT dua dimensi. Isolat alkaloid diuji aktivitas sitotoksisitas dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test), penentuan struktur molekul isolat alkaloid dengan metode spektrometri UV-Vis, FT-IR dan LC-MS. Hasil penapisan fitokimia sampel mengandung senyawa flavonoid, tanin, kuinon, saponin, dan alkaloid. Ekstrak alkaloid diperoleh seberat 1,06 gram (0,645%). Identifikasi isolat alkaloid menggunakan spektrometri UV-Vis menunjukan alkaloid termasuk golongan isokuinolin dengan panjang gelombang 230 nm, 255 nm, dan 335 nm, analisis menggunakan spektrometri FTIR menunjukan isolat alkaloid memiliki gugus fungsi OH, CH3, C=C, C-N, C=O, C-O eter. Hasil LC-MS diperoleh berat molekul sampel sebesar 214,25 g/mol. Berdasarkan hasil analisis diduga senyawa yang didapatkan adalah senyawa cassiarin A. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak alkaloid menunjukkan LC50 sebesar 18,383 ppm dapat disimpulkan ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik. Kata Kunci: Senna siamea, Alkaloid, Brine Shrimp Lethality Test ABSTRACT Alcaloid from the leaf Johar (Senna siamea) was isolated by extraction method using solvent of 96% ethanol. The ethanol extract and powder of Johar leaf were tested by phytochemical screening. Alcaloid extract was produced by salting method. Methanol-water fraction were added by 2N HCl to ph 3 and extracted with ethyl acetate, acid layer obtained plus NH4OH to ph 9-10 and extracted with ethyl acetate. Alcaloid separation was carried out by preparative thin layer chromatography using silica gel GF254 as stationary phase and ethyl acetate: chloroform (8: 2) as a mobile phase. The purity test was performed by TLC using various of eluent and two-dimensional TLC. Cytotoxicity activity of alcaloid isolates were tested by the BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method and its molecular structure were determined using UV-Vis spectrometry, FT-IR and LC-MS methods. The results of phytochemical screening showed that samples contain flavonoids, tannins, quinones, saponins and alcaloids. Alcaloid extract obtained is 1.06 grams (0.645%). Molecular structure identification of alcaloid isolates showed that alcaloid belonged to isokuinolin with wavelengths of 230 nm, 255 nm, and 335 nm. The alcaloid has functional groups of OH, CH3, C=C, C-N, C=O, C-O eter with molecular weight 157

2 JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 3, Bulan Desember 2016., hal of g / mol. Based on the results analysis described above, it reveals that the compound obtained is cassiarin A. Cytotoxicity assay results of alcaloid extract showed LC50 of ppm, it can be concluded that the alcaloid extract has highly cytotoxic. Key word: Senna siamea, Alcaloid, Brine Shrimp Lethality Test PENDAHULUAN Tanaman Johar (Senna siamea) telah digunakan secara tradisional sebagai obat penyakit demam, penyakit kuning, sakit perut, nyeri haid, dan juga digunakan untuk mengurangi tingkat gula dalam darah [1]. Ekstrak daun Johar memiliki sifat sebagai antimalaria, antioksidan [2], antibakterial [3] antidiabetes [4]. Salah satu penelitian melaporkan dalam ekstrak metanol, etanol, dan etil asetat dari daun Johar terkandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, flavonoid, saponin, tannin dan fenol, antrakuinon, antosianin, dan glikosida jantung [5]. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh [2] telah menguji aktivitas antikanker dari daun Johar. Daun Johar pada penelitian tersebut diekstrak dengan mengunakan berbagai pelarut dan berhasil mengidentifikasi aktivitas antikanker dan senyawa yang berperan adalah antrakuinon dan biantrakuinon. Alkaloid berhasil diidentifikasi pada daun Johar yang diambil dari Taman Botani Purwodadi, Indonesia [6].Daun Johar pada penelitian tersebut diekstrak dengan metanol dan dan digaramkan sehingga diperoleh alkaloid hasil analisis adalah cassiarin A dan cassiarin B. Berdasarkan informasi di atas, penelitian mengenai penentuan alkaloid pada daun Johar dengan penapisan fitokimia dan uji aktivitasnya telah banyak dilakukan, namun penelitian untuk mengidentifikasi struktur alkaloid pada daun Johar masih jarang dilakukan. Penelitian ini akan dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa golongan alkaloid pada daun Johar. Hasil penelitian ini nantinya diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis senyawa alkaloid yang terkandung dalam daun Johar (Senna siamea) dan uji sitotoksiknya. METODE PENELITIAN Alat dan bahan: Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari rotary evaporator, blender, neraca analitik, kertas saring, aluminium foil, erlenmeyer, pipet tetes, gelas beker, corong gelas, corong pisah, botol vial, pipa kapiler, tabung reaksi, pengaduk kaca, penangas air, cawan penguap, wadah pengembang, lampu UV, spektrofotometer UV Visibel, FTIR, dan LC-MS. Bahan: yang diperlukan dalam penelitian ini yaitu daun Johar (Senna siamea) diperoleh dari daerah Purworejo, Jawa Tengah, aquades, etanol 96% teknis, n-heksana teknis, kloroform teknis, etil asetat teknis, plat KLT silika gel GF254 (Merck), plat KLT Preparatif silika gel GF254 20x20 cm, tebal 2,0 mm (Merck), n-heksana p.a. (Merck), etil asetat p.a. (Merck), asam asetat p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck), metanol p.a. (Merck), asam klorida (Merck), natrium hidroksida (Merck), pereaksi dragendorf, pereaksi Mayer.

3 159 Ismi Simpang Anggia et al., Isolasi, Identifikasi Cara Kerja: Ekstraksi senyawa alkaloid: Serbuk daun Johar sebanyak 1kg dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 10 x 24 jam. Ekstrak etanol diuapkan pada kondisi vakum sampai ekstrak pekat. Ekstrak pekat etanol dilarutkan dalam methanol dan ditambahkan aquades dengan rasio 1:1 dan didiamkan selama semalam untuk memisahkan antara klorofil dengan filtrat. Simpilisa dan ekstrak yang didapatkan dilakukan analisis penapisan fitokimia yang meliputi tanin, alkaloid, flavonoid, kuinon, saponin, dan steroid/ triterpenoid. Isolasi Alkaloid: Fraksi yang berupa metanol air dilakukan partisi menggunakan n-heksan dan kloroform. Fraksi metanol-air yang didapatkan dilakukan penggaraman menggunakan HCl 2 M hingga ph 3 lalu ekstraksi dengan pelarut etil asetat sehingga didapatkan lapisan asam, selanjutnya dilakukan penambahan NH4OH hingga ph 9 kemudian diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat dan diuapkan sehingga didapatkan ekstrak alkaloid. Ekstrak alkaloid dilakukan pemisahan menggunakan KLT dengan fase diam berupa silika gel GF254 dan eluen berupa etil asetat :kloroform dengan rasio 8:2. Noda yang terbentuk dilakukan uji alkaloid dengan pereaksi Dragendorf. Noda positif alkaloid dilakukan pemisahan menggunakan KLT Preparatif 20x20 cm dengan fase diam berupa silika gel GF254 dan eluen berupa etil asetat :kloroform dengan rasio 8:2. Uji Kemurnian: Isolat alkaloid dilakukan uji kemurnian dengan eluen etil asetat : kloroform (9:2), etil asetat: etanol (8:2), dan KLT dua dimensi dengan eluen (1) etil asetat : kloroform (9:1), (2) etil asetat:etanol (9:1) sehingga diperoleh isolat murni. Karakterisasi Isolat Alkaloid: Untuk mengetahui struktur dari senyawa alkaloid murni yang didapatkan, maka isolat alkaloid dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR dan LC-MS. Uji Aktivitas : Telur Artemia salina direndam di dalam air garam selama 2 x 24 jam. Suhu penetasan adalah ± C dan ph ± 6-7. Telur akan menetas setelah jam dan larvanya disebut nauplii yang siap untuk uji BSLT setelah berumur 2 hari. Sampel dari ekstrak alkaloid diambil 125 mg, dibuat pengenceran dengan konsentrasi 10, 100, 1000 µg/ml. Pengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ekor larva Artemia salina ke dalam tabung reaksi yang telah berisi larutan ekstrak yang telah diencerkan dengan air garam. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung dan dilakukan analisis probit untuk menentukan aktifitas LC50 [7]. HASIL DAN PEMBAHASAN Penapisan fitokimia berfungsi untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam simplisia serbuk maupun di dalam ekstrak etanol. Penapisan fitokimia yang dilakukan secara kualitatif dengan mengidentifikasi keberadaan suatu senyawa tanpa menentukan kadarnya. Prinsip penapisan fitokimia ialah analisis golongan kimia tumbuhan dengan uji spesifik dengan reagen yang memberikan uji spesifik terhadap golongan kimia tertentu. Golongan yang diidentifikasi pada penelitian ini antara lain alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, kuinon, steroid dan triterpenoid.

4 JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 3, Bulan Desember 2016., hal Hasil penapisan fitokimia dapat dilihat pada tabel 1 yang menunjukkan bahwa penapisan fitokimia pada serbuk dan ekstrak etanol daun Johar mengandung senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon dan steroid. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian yang pernah dilaporkan dalam jurnal sebelumnya [5]. kaloid atau tidak maka ditambahkan pereaksi Dragendorff, terbentuknya endapan merah bata berarti positif adanya alkaloid. Ekstrak alkaloid selanjutnya dianalisis menggunakan kromatografi lapis tipis dengan fasa diam silika gel 60 GF254 dan eluen campuran eluen etil asetat:kloroform Tabel 1. Hasil uji fitokimia daun Johar Uji Fitokimia Serbuk Ekstrak Alkaloid + + Saponin + + Flavanoid + + Tanin + + Kuinon + + Steroid + + Isolasi senyawa alkaloid dilakukan dengan menambahkan HCl 2M pada (8:2) untuk mengetahui jumlah komponennya. Hasil KLT ada 4 noda yang terbentuk berwarna biru dengan nilai Rf1 (0,08), Rf2 (0,26), Rf3 (0,43), Rf4 (0,65), dan Rf5 (0,75). Hasil KLT, warna noda dan nilai Rf, dapat dilihat pada gambar 1a. Hasil KLT setelah disemprot pereaksi Dragendorf menghasilkan satu noda pada Rf (0,42) yang berwarna jingga, berarti hanya satu noda yang positif alkaloid. Hasil KLT setelah disemprot pereaksi Dragendorf dapat dilihat pada gambar 1b. ekstrak methanol-air sampai suasana menjadi asam, sehingga alkaloid akan membentuk garam alkaloid. Garam alkaloid ini kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan dua lapisan. Lapisan atas adalah etil asetat yang mengikat senyawa selain alkaloid dan lapisan bawah adalah lapisan asam dan alkaloid terikat pada lapisan ini. Untuk mem- A B bebaskan alkaloid dari bentuk garamnya, maka ditambahkan ammonium hidroksida sampai suasana menjadi basa, sehingga alkaloid akan terbentuk menjadi basa alkaloid kembali. Larutan ini kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat sehingga akan terbentuk dua lapisan, lapisan etil asetat yang mengandung alkaloid dan lapisan basa yang mengandung air, pelarut etil asetat kemudian diuapkan sehingga diperoleh ekstrak alkaloid. Untuk mengetahui ekstrak alkaloid yang didapatkan positif al- Gambar 1. (A) Hasil KLT ekstrak alkaloid dengan eluen etil asetat : kloroform (8:2) pada panjang gelombang 365 nm dan (B) KLT setelah disemprot perekasi Dragendorf Pemisahan senyawa-senyawa alkaloid dengan KLT preparatif menggunakan eluen etil asetat:kloroform (8:2), sehinga menghasilkan pita-pita dan yang positif alkaloid dikerok lalu dilarutkan dalam pelarut etil asetat, kemudian dipisahkan dan diperoleh isolat alkaloid.

5 161 Ismi Simpang Anggia et al., Isolasi, Identifikasi Gambar 2. Hasil KLT preparative ekstrak alkaloid dengan eluen etil asetat:kloroform (8:2) pada lampu UV λ 365 nm rapan dari ikatan rangkap aromatik yang terkonjugasi dan diduga serapan alkaloid yang mempunyai kerangka dasar isokuinolin, menurut jurnal alkaloid yang mengandung kerangka dasar isokuinolin mempunyai panjang gelombang pada daerah 230 nm, 266 nm, 351 nm [8]. Hasil analisis dengan spektrofotometer UV-Vis dapat dilihat pada gambar 4. Selanjutnya isolat alkaloid dilakukan uji kemurnian dengan metode KLT menggunakan berbagai campuran eluen dan KLT dua dimensi. Hasil KLT menunjukkan satu noda, diduga isolat alkaloid telah murni. Hasil KLT uji kemurnian dapat dilihat pada gambar 3. Gambar 4. Spektra UV Vis isolat alkaloid daun Johar Kerangka dasar alkaloid isokuinolin adalah sebagai berikut: N A B C Gambar 3. Hasil uji kemurnian dengan eluen (A) etil asetat : kloroform (9:2), (B) etil asetat: etanol (8:2), dan (C) KLT dua dimensi dengan eluen (1) etil asetat : kloroform (9:1), (2) etil asetat:etanol (9:1) pada lampu UV λ365 nm Isolat alkaloid murni kemudian dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis didapatkan serapan pada panjang gelombang 230 nm, 255 nm, 335 nm merupakan se- Gambar 5. Spektra FTIR isolat alkaloid daun Johar Hasil analisis FTIR pada gambar 5 menunjukkan serapan pada panjang gelombang 3658 cm -1 (vibrasi ulur gugus OH), 2926,6 dan 2857,5 cm -1 (Vibrasi ulur CH alifatik), 1739,82 cm -1 (vibrasi ulur C=O), 1655,36 cm -1 (Vibrasi ulur C=C aromatic), 1460,55 cm -1 dan 1387,26 cm -1 (Vibrasi

6 JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK), Vol. 1, No. 3, Bulan Desember 2016., hal tekuk CH alifatik), 1266,28 cm -1 (vibrasi ulur C-N), 1166,92 cm -1 (gugus C-O eter). HO CH 3 N O CH 3 Gambar 8. Struktur senyawa cassiarin Gambar 6. Kromatogram isolat alkaloid daun Johar Hasil kromatogram dari LC-MS senyawa alkaloid pada gambar 6 menunjukkan bahwa isolat alkaloid murni memiliki satu puncak dengan waktu retensi 0,96 menit, sehingga dapat disimpulkan bahwa isolat alkaloid murni. Hasil uji aktifitas sitotoksik ekstrak alkaloid daun Johar menggunakan metode BSLT diperoleh harga LC50 18,383 ppm. Ini berarti bahwa ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid daun Johar dapat dilihat pada table 2. Tabel 2. Uji Sitotoksik Ekstrak Alkaloid Daun Johar Gambar 7. Spektrogram massa isolat alkaloid daun Johar Spektrogram pada gambar 7 muncul puncak dengan protonasi ion molekular [M+Na] + 237,27 dari (m/z) [M+23], [M+H] + 215,25 dari (m/z) [M+1] sehingga dapat disimpulkan bahwa berat molekul isolat yaitu 214,25 g/mol. Dari analisis dengan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR dan LC-MS diduga senyawa alkaloid merupakan senyawa cassiarin A. Struktur senyawa cassiarin A adalah sebagai berikut: KESIMPULAN 1. Berdasarkan hasil analisis diduga didapatkan senyawa alkaloid adalah casiarin A. 2. Uji aktivitas sitotoksik ekstrak alkaloid daun Johar diketahui bahwa bersifat sangat sitotoksik dengan LC50 sebesar 18,383 ppm. UCAPAN TERIMA KASIH

7 163 Ismi Simpang Anggia et al., Isolasi, Identifikasi 1. Dr. Dwi Hudiyanti, M.Sc selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro. 2. Seluruh Dosen Laboratorium organik yang telah memberikan kritik dan saran dalam penyusunan Publikasi ini. 3. Seluruh staff laboratorium Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro yang telah membantu penulis. 4. Bapak, ibu dan adik yang selalu memberikan motivasi dan semangat DAFTAR RUJUKAN [1] Majji, L. N., Battu, G. R., Jangiti, R. K., Talluri, M. R., 2013, Evaluation of in-vitro antibacterial activity of Cassia siamea, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, India [2] Kamagaté, M., Koffi Camille., Kouamé, N. M., Akoubet, A., Yao, N. A. R., Die-Kakou, H. M., 2014, Ethnobotany, phytochemistry, pharmacology and toxicology profiles of Cassia siamea Lam, The Journal of Phytopharmacology, 3(1): 57-76, Côte d'ivoir [3] Povendran, P., Ramanathan, N., Prabhu, N., 2014, Evaluation of the Antibacterial activity of Aegle marmelos and Cassia siamea Extracts Against Biofilm and Extended Spectrum β-lactamase Producing Uropathogenic Escerichia coli, International Journal of Microbiological Reserach 5(3): , India [4] Kumar, S., Kumar, V., Prakash, O., 2010, Antidiabetic and anti-lipemic effects of Cassia siamea leaves extract in streptozotocic induced diabetic rats, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine: , India [5] Veerachari, U., Bopaiah, DR. A. K., 2012, Phytochemical Investigation of the Ethanol. Methanol, and Ethyl Acetate Leaf Extracts of Six Cassia Species, International Journal of Pharma and Bio Sciences, Bangalore [6] Moshi, M.J., Innocent, E., Magadula, J.J., Otieno, D.F., dan Weisheit, A., 2010, Brine shrimp toxicity of some plants used as traditional medicines in Kagera Region, North Weste [7] Meyer, B.N., Ferigni, N.R., Putnam, J.E., Ja Cobsen, L.B., Nichols, D.E., Melaughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp, A Convonient General Bioassay for Activee Plant Constituent, Planta MedikaTanzania, Tanzania journal of Health Research, 12 (1): 1-6 [8] Cordell, A., 1981, Introduction to Alkaloids a Biogenetic Approach, John Willey and Sons, New Yor